D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在大腸桿菌內(nèi)的高效可溶性表達(dá)及發(fā)酵條件研究

李秋鳳，陳 靜，趙婧邑，韋 欣，王志琦，劉繼棟,

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；

2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西崇左 532415）

近年來，D-阿洛酮糖由于其多種生理功能而受到越來越多的關(guān)注，可作為抗癌劑、有效免疫抑制劑以及抗氧化劑，市場潛力巨大，目前針對化工合成法純化復(fù)雜、伴有副產(chǎn)物產(chǎn)生的缺點(diǎn)，生物合成法生產(chǎn)D-阿洛酮糖具有良好的應(yīng)用前景[1]。D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-allulose 3-epimerase，DAEase）是催化D-果糖和D-阿洛酮糖進(jìn)行可逆反應(yīng)的異構(gòu)化酶[1]。近年來，陸續(xù)有不同來源DAEase在不同宿主中表達(dá)的報道[2-4]。其中，Wei等[2]在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)了來自Clostridium bolteae和Doreasp.的兩個DAEase基因，并通過啟動子強(qiáng)度優(yōu)化將DAEase的產(chǎn)量提高約20%。然而在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒具有不穩(wěn)定性，在大規(guī)模生產(chǎn)中容易丟失或發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，不利于相關(guān)的基因表達(dá)和調(diào)控研究[5]。釀酒酵母作為食品級微生物，Juneja等[4]在釀酒酵母中成功表達(dá)了DAEase，在55 ℃時將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為26.6%。然而在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，外源蛋白易于糖基化及發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇，并會導(dǎo)致目標(biāo)蛋白產(chǎn)量下降[5]。

與其它宿主相比，大腸桿菌具有外源基因表達(dá)效率高、蛋白分泌量大和基因操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。Zhang等[7]使用重組大腸桿菌表達(dá)來源于Doreasp.CAG317的DAEase，在pH6.0的酸性條件下酶活性最高，達(dá)到了803 U/mg；Park等[8]在重組大腸桿菌中成功表達(dá)了來自Agrobacterium tumefaciens的DAEase雙位點(diǎn)突變體（I33L/S213C），培養(yǎng) 24 h后重組大腸桿菌中DAEase和粗蛋白的表達(dá)量分別為8.6%和37.0%（w/w）。目前大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要存在的問題是蛋白易發(fā)生錯誤折疊而形成不溶性包涵體，導(dǎo)致產(chǎn)量偏低[9]。將包涵體通過樹脂和凝膠色譜分離純化耗時耗力，且復(fù)性過程易造成肽鏈間的錯誤折疊[10]；此外，蛋白質(zhì)的正確折疊需在基因表達(dá)速率和蛋白溶解度之間達(dá)到平衡，基因操作難度大[11]。盡管Tseng等[12]將α-突觸核蛋白酸性尾部衍生的肽段與Agrobacteriumsp.ATCC31749的DAEase融合，其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)增加了1.57倍，但酶的分離純化步驟卻較為繁瑣，不利于生產(chǎn)應(yīng)用。

據(jù)報道，溫度會影響蛋白質(zhì)的合成速率、折疊動力學(xué)和蛋白質(zhì)降解的疏水作用[13]，低溫會為蛋白質(zhì)折疊提供充足時間[14]。閆真等[15]發(fā)現(xiàn)，在17 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)的重組酶比活明顯高于37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)的比活，說明低溫有利于提高可溶性蛋白的產(chǎn)量。低溫可以降低包涵體的數(shù)量，然而低溫下菌體生長緩慢會導(dǎo)致單位時間的表達(dá)水平降低[16]。CspA是37 ℃時處于抑制狀態(tài)的冷休克蛋白，在低溫（15 ℃）下會被激活誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)[17]。包含CspA啟動子的pCold-TF是一種融合冷休克表達(dá)載體，目標(biāo)基因被冷激誘導(dǎo)表達(dá)之前，細(xì)菌可在37 ℃快速生長；另外，TF分子伴侶可以作為可溶性融合標(biāo)簽表達(dá)，防止蛋白質(zhì)在密集細(xì)胞環(huán)境中發(fā)生錯誤折疊和聚集，與蛋白質(zhì)結(jié)合從而使其穩(wěn)定折疊，并在發(fā)揮作用后自行離開目的蛋白，有利于后續(xù)的分離純化[17]。因此，為了提高DAEase的產(chǎn)量，本文選擇冷休克表達(dá)質(zhì)粒pCold TF作為表達(dá)載體，以實(shí)現(xiàn)DAEase在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的高效可溶性表達(dá)，并對全細(xì)胞催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的條件進(jìn)行優(yōu)化，為其高效工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

T4 DNA連接酶、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、5×蛋白加樣緩沖液、Real Band蛋白預(yù)染 Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp） 生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ TaKaRa 公司；Ni Seoharose 6 Fsat Flow 蛋白純化樹脂 美國GE公司；D-阿洛酮糖標(biāo)品（99%）色譜純 Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純；大腸桿菌Escherichia coliDH5α、BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞、冷休克表達(dá)載體pCold TF 由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物合成和核酸測序 由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；LB培養(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨、10 g/L 氯化鈉和 5 g/L 酵母提取物，pH7.2，121 ℃ 滅菌20 min，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

GR85DP型高壓滅菌鍋 智微（廈門）儀器有限公司；Power PacTM Basic型蛋白電泳儀 美國伯樂（BIO-RAD）公司；T100 Thermal Cycler型 PCR 儀美國伯樂（BIO-RAD）公司；Waters 2595型高效液相色譜儀 美國沃特世（Waters）公司；722N可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫上篩選得到來源于C.bolteaeATCCBAA-613的DAEase基因序列，對其進(jìn)行了針對E.coli中表達(dá)的密碼子的優(yōu)化[18]，在C端加上6×His標(biāo)簽，同時在基因序列的 5'端與 3'端分別引入EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位點(diǎn)，將優(yōu)化后的基因序列交由上海生工生物公司合成，連接至載體PUC57上。將優(yōu)化合成的DAEase基因用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，并與經(jīng)同樣酶切的pCold TF載體在T4連接酶的介導(dǎo)下連接，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜[19]。次日挑取單克隆于LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng) 12 h，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定目的基因的插入，并送測序。經(jīng)測序驗(yàn)證后，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pCold TF-Cb-DAE。

1.2.2 pCold TF-Cb-DAE重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pCold TF-Cb-DAE轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E.coliBL21 （DE3）中，37 ℃ 過夜培養(yǎng)后，取 1% 的種子液接種于 50 mL LB 培養(yǎng)基（含 100 μg/mL Amp），37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)至生物量OD600約為0.6～0.8，加入 0.25 mmol/L IPTG，15 ℃下 200 r/min低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)，24 h后收集菌液離心，用15 mL 1× PBS緩沖液懸浮菌體，經(jīng)超聲波細(xì)胞破壁后的上清液及沉淀經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）鑒定，分析菌體中目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 Cb-DAEase的純化 重組菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)24 h后，收集上清液用于蛋白質(zhì)純化。上清液中存在大量的雜蛋白質(zhì)，使用Ni Seoharose 6 Fast Flow蛋白純化樹脂對其進(jìn)行純化，可以得到高純度的目的蛋白[20]。采用梯度洗脫法（咪唑濃度 20、50、500 mmol/L），低濃度咪唑洗脫液洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測純化效果[21]。

1.2.4 Cb-DAEase的酶學(xué)性質(zhì) 為進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白是否可以催化合成D-阿洛酮糖，以50 g/L D-果糖為底物測酶活力，加入適量純化的Cb-DAEase和1 mmol/L的 Co2+，在 55 ℃和 pH 7.0條件下催化10 min后，立即沸水浴10 min以終止反應(yīng)，反應(yīng)終止液用0.22 μm濾膜過濾后，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測D-阿洛酮糖的合成，酶活定義為：每分鐘產(chǎn)生1 μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量是1 U。檢測條件：Waters 2595型液相色譜儀，Sugar-Pak1糖柱，Waters 2414示差折光檢測器，85 ℃柱溫，流動相為超純水，流速為0.4 mL/min[22]。

1.2.4.1 最適溫度和pH的測定 在pH8.0條件下，測定不同溫度（40、45、50、55、60、70、75及 80 ℃）條件下的酶活力；在測得的最適反應(yīng)溫度條件下，測定不同 pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5）條件下的酶活力，將最高酶活力定義為相對酶活100%，其他處理組酶活力/最高酶活力×100%為相對酶活力。

1.2.4.2 金屬離子對DAEase活力的影響 保持上述最適催化溫度和pH不變，在標(biāo)準(zhǔn)測定體系中分別加入 1 mmol/L 不同金屬離子（Co2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+和 Zn2+），催化反應(yīng) 10 min，使用HPLC測定酶活力。以緩沖溶液代替金屬離子為對照組，將對照組的酶活力設(shè)為相對酶活100%。

1.2.5 重組菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.5.1 碳源對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活力的影響在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以5.0 g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油為碳源，按1%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL培養(yǎng)基（含Amp濃度100 mg/L）中，于 37 ℃下 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 h，當(dāng) OD600為 0.6～0.8時加入 0.25 mol/L IPTG誘導(dǎo)劑，繼續(xù)置于15 ℃的搖床中以200 r/min的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，考察不同種類的碳源對酶活力和菌體生長量的影響。酶活力測定同1.2.4節(jié)，菌體生長量的測定：將發(fā)酵液樣品稀釋至適宜濃度，使用分光光度計(jì)記錄OD600，其中稀釋倍數(shù)以O(shè)D600落在0.2～0.8確定。

1.2.5.2 氮源對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活力的影響在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以7 g/L的甘油為碳源，分別以10 g/L的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、氯化銨作為氮源，考察不同種類的氮源對酶活力和菌體生長量的影響，其他培養(yǎng)條件同1.2.5.1節(jié)。

1.2.5.3 培養(yǎng)條件對Cb-DAEase活力的影響 將培養(yǎng)過夜的重組菌株BL21/TF-Cb接種到200 mL含有 100 μg/mL Amp的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，使用單因素實(shí)驗(yàn)考察接種量、IPTG誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間等因素對酶活力的影響，將最高酶活力定義為相對酶活100%。在培養(yǎng)基中接種不同量（0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%和2.0%）的種子液，添加0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，于15 ℃下200 r/min誘導(dǎo)24 h，收集發(fā)酵液測定酶活力和菌體生長量；在培養(yǎng)基接種1% 的種子液，添加不同濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35及 0.4 mmol/L）的 IPTG，于 15 ℃ 下 200 r/min誘導(dǎo)24 h，收集發(fā)酵液測定酶活力和菌體生長量；在培養(yǎng)基中接種1%的種子液，培養(yǎng)不同時間（3、4、5、6、7 h）后，加入0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，于15 ℃、200 r/min誘導(dǎo)24 h，收集發(fā)酵液測定酶活力和菌體生長量。

在上述最適條件下，以120 g/L果糖為底物進(jìn)行全細(xì)胞催化30 min，整個體系經(jīng)離心處理后0.22 μm濾膜過濾，濾液使用高效液相色譜（HPLC）檢測，測定阿洛酮糖產(chǎn)量和酶活力，以未優(yōu)化條件培養(yǎng)重組菌作為對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cb-DAEase誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將構(gòu)建成功的重組菌株BL21/TF-Cb接種于LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)Cb-DAEase，通過SDS-PAGE鑒定其分子量。DAEase的分子量大小約為34.2 kDa，攜帶TF分子伴侶的質(zhì)粒分子量大小約為54 kDa，Cb-DAEase的分子量預(yù)測為88.2 kDa。如圖1（a），在75～100 kDa之間有明顯的條帶，與預(yù)測值一致，說明重組質(zhì)粒pCold TF-Cb-DAE成功在大腸桿菌宿主E.coliBL21（DE3）中表達(dá)。與總粗酶液（lane 2）相比，Cb-DAEase更多的以可溶性蛋白的方式存在于上清液中（lane 3），經(jīng)分析軟件Image J分析得出，上清中目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的84.7%±1.4%，而沉淀中的包涵體含量僅占少部分（lane 4），說明冷休克表達(dá)質(zhì)粒pCold TF在低溫誘導(dǎo)條件下成功實(shí)現(xiàn)了DAEase在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)。pCold載體上攜帶的分子伴侶TF可以伴隨著蛋白質(zhì)的初始折疊，通過與錯誤折疊的多肽暴露的疏水區(qū)域結(jié)合，并將分子轉(zhuǎn)移到特定的亞細(xì)胞，從而避免蛋白質(zhì)聚集，減少包涵體形成[21]。

圖1 大腸桿菌 E.coli BL21（DE3）中表達(dá) Cb-DAEase 的SDS-PAGE電泳圖（a）以及純化Cb-DAEase的SDS-PAGE 結(jié)果（b）Fig.1 Expression of Cb-DAEase in E.coli BL21 (DE3) SDSPAGE electrophoretogram (a) and SDS-PAGE results of purified Cb-DAEase (b)

將重組菌株BL21/TF-Cb發(fā)酵上清液通過Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱分離純化目的蛋白，如圖1（b）所示，條帶W1為20 mmol/L洗脫液洗出的雜蛋白，條帶W2為50 mmol/L洗脫液洗出的剩余雜蛋白（SDS-PAGE電泳圖中未出現(xiàn)條帶），表明20～50 mmol/L咪唑洗脫液條件下可將所有的雜蛋白洗脫。條帶E1、E2為500 mmol/L洗脫液洗出的目的蛋白，純化后的Cb-DAEase條帶單一清晰占比高，回收的目的蛋白純度高，可用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.2 Cb-DAEase的酶學(xué)特性分析

重組菌株在以D-果糖為底物的培養(yǎng)基中發(fā)酵，通過HPLC檢測D-阿洛酮糖的生成。如圖2所示，在20.25 min左右檢測到D-阿洛酮糖，這表明Cb-DAEase可以在大腸桿菌冷休克系統(tǒng)中表達(dá)為活性蛋白，具有催化合成D-阿洛酮糖的能力。

圖2 重組Cb-DAEase活性HPLC檢測Fig.2 HPLC analysis of the bioactivity in recombinant Cb-DAEase

2.2.1 溫度、pH、金屬離子對Cb-DAEase酶活的影響最適溫度作為生物催化反應(yīng)的重要參數(shù)，可反應(yīng)其是否適用于工業(yè)化生產(chǎn)[23]。Cb-DAEase的最適反應(yīng)溫度為 55 ℃（圖3A）。在溫度 45～65 ℃ 內(nèi)，Cb-DAEase仍保存50%以上的活性；但當(dāng)溫度超過55 ℃時，酶活力隨著溫度的升高而逐步下降，80 ℃時Cb-DAEase僅有19.56%的活性，說明溫度是影響酶活力的主要因素。

Cb-DAEase在 pH7.0時酶活力最高（圖3B），在pH5～7.5時Cb-DAEase可以保持60%以上的相對酶活力。Sato等[22]報道的 Trpr-DAEase在 pH 8.0時表現(xiàn)出最高活性，Zhu等[1]報道的重組DAEase在pH 7.5～8.0時活性最高，與目前發(fā)現(xiàn)的偏堿性DAEase不同，本研究的Cb-DAEase為中性酶，中性條件可避免褐變反應(yīng)及其它非特異性副反應(yīng)發(fā)生，減少后續(xù)分離純化的難度，在工業(yè)應(yīng)用中具有明顯優(yōu)勢。

金屬離子能夠與酶形成絡(luò)合物，穩(wěn)定或破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，在生物催化中起重要作用[23]。與對照組相比（圖3C），金屬離子Co2+、Mn2+及Mg2+在不同程度上提高了Cb-DAEase的活性，Mg2+將酶活力提高了1.48倍，Mn2+將酶活力提高了2.43倍，Co2+的激活作用最強(qiáng)，將酶活力提高了4.52倍，其激活作用原因可能是該陽離子在調(diào)節(jié)酶活力構(gòu)象中起重要作用，從而促進(jìn)果糖異構(gòu)化成阿洛酮糖[24]。

圖3 重組Cb-DAEase的酶學(xué)性質(zhì)Fig.3 Enzymatic properties of the recombinant Cb-DAEase

2.3 碳源對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活力的影響

碳源是細(xì)胞生長的基礎(chǔ)，其種類及濃度是影響胞內(nèi)酶表達(dá)的重要因素[25]。如圖4A，在添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油的培養(yǎng)基中，以甘油為碳源時最有利于細(xì)胞生長、相對酶活最高，與Su[25]和Lei[26]等研究相似。甘油作為成本低廉的小分子穩(wěn)定劑，可以降低發(fā)酵體系的極性，與酶蛋白形成氫鍵，有利于隔絕水分子環(huán)境及穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)[25]。

通過在培養(yǎng)基中加入濃度為3～7 g/L的甘油，研究了不同甘油質(zhì)量濃度對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活性的影響。如圖4B，當(dāng)甘油濃度為3～5 g/L時，菌株生長量隨著濃度的增加而提高；當(dāng)甘油濃度為5～7 g/L時，菌株生長量隨著濃度的增加而降低，這可能是由于碳代謝阻遏（CCR）效應(yīng)[27]，據(jù)報道，CCR效應(yīng)會隨著碳源濃度的增加而降低發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，而且重組蛋白的表達(dá)通常會對細(xì)胞生長產(chǎn)生一定的代謝負(fù)擔(dān)，降低細(xì)胞生物量[28]。Cb-DAEase的相對酶活力隨著甘油濃度的增加而顯著提高，7 g/L時相對酶活最高，菌體生長旺盛，故選擇7 g/L甘油作為碳源。

圖4 碳源種類及甘油質(zhì)量濃度對菌體生長量和Cb-DAEase酶活性的影響Fig.4 Effects of carbon source type and glycerol concentration on growth mass and activity of Cb-DAEase

2.4 氮源對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活力的影響

此外，本研究還考察了氮源種類對細(xì)胞生長和Cb-DAEase發(fā)酵活性的影響。在含有酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨的培養(yǎng)基中，重組菌株生長量高，Cb-DAEase相對酶活在70%以上（圖5A），其中酵母膏作為氮源時菌株生長量和相對酶活最高，說明有機(jī)氮源是基因工程菌表達(dá)Cb-DAEase的適宜氮源，這可能是由于有機(jī)氮源中除了含有蛋白質(zhì)、肽及游離的氨基酸以外，還含有少量的維生素和生長因子，促進(jìn)大腸桿菌的生長和蛋白表達(dá)[26,29]。

酵母膏濃度在6～10 g/L的范圍時，Cb-DAEase活力和細(xì)胞生長都隨著濃度的增加而提高，10 g/L時酶活力和生物量最高（圖5B），當(dāng)酵母膏濃度在10～14 g/L的范圍時，酶活力和細(xì)胞生長都隨著濃度的增加而下降，故確定酵母膏的最適添加濃度為10 g/L。

圖5 氮源種類及酵母膏質(zhì)量濃度對菌體生長量和Cb-DAEase酶活性的影響Fig.5 Effects of nitrogen source type and yeast extract concentration on growth mass and activity of Cb-DAEase

2.5 培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活力的影響

接種量是影響菌株生長快慢的因素之一，接種量過少會導(dǎo)致一個長時間的滯后期[30]；增加接種量可促進(jìn)微生物生長，縮短細(xì)胞生長的滯后期并降低感染雜菌的概率，但接種量過高會導(dǎo)致代謝廢物增加，增加菌株的生物量，過早引起菌株之間的競爭[31]，從而降低Cb-DAEase生物合成的速率，故研究接種量對細(xì)胞生長和Cb-DAEase活性的影響尤為重要。由圖6A可知，Cb-DAEase的相對酶活隨著接種量變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)接種量為1%時Cb-DAEase的相對酶活最高。

圖6 接種量（A）、誘導(dǎo)劑濃度（B）和誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間（C）對生物量和Cb-DAEase表達(dá)的影響Fig.6 Effects of inoculum size (A)， IPTG concentration (B) and induction time (C) on growth mass and expression of Cb-DAEase

以1%接種量為基礎(chǔ)，改變誘導(dǎo)劑濃度，如圖6B，隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加，酶活性和菌體生長量先增加后降低，在0.25 mmol/L時達(dá)到最高。IPTG濃度過高具有一定的毒性，導(dǎo)致菌體生長緩慢及形成包涵體，細(xì)胞內(nèi)不溶性DAEase的比例增加[26]；用量過多也會增加生產(chǎn)成本，故選擇0.25 mmol/L作為最佳誘導(dǎo)劑濃度。

以上述條件為基礎(chǔ)，改變誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間，如圖6C，培養(yǎng)時間在3～5 h時，酶活性和生長量隨著培養(yǎng)時間的增加而提高；培養(yǎng)時間為5 h時，酶活力與生長量達(dá)到最大；此后延長培養(yǎng)時間，酶活力和生長量反而呈現(xiàn)下降趨勢，說明培養(yǎng)5 h重組菌株生長旺盛，有利于產(chǎn)酶。因此，最終確定誘導(dǎo)前培養(yǎng)時間為5 h。

以120 g/L果糖作為底物，在上述條件下對重組菌株BL21/TF-Cb進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)，經(jīng)全細(xì)胞反應(yīng)催化后通過HPLC儀檢測產(chǎn)物。Cb-DAEase活力達(dá)到（10.11±0.02） U/g，同比優(yōu)化前（1.38±0.01） U/g 提高了 86.35%；阿洛酮糖產(chǎn)量為（11.47±0.04） g/L，同比優(yōu)化前（1.03±0.02） g/L提高了 91.02%，是 Zhang等[31]發(fā)酵產(chǎn)量（4.56±0.01）g/L 的 2.51 倍，優(yōu)化效果十分顯著，達(dá)到高效可溶性表達(dá)的目的，為工業(yè)化高產(chǎn)D-阿洛酮糖提供了數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論

在大腸桿菌中構(gòu)建冷休克啟動子誘導(dǎo)的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其新穎之處在于解決了胞內(nèi)蛋白濃度過高導(dǎo)致折疊時間、空間受限而形成大量包涵體的問題，從而顯著提高了DAEase在大腸桿菌中的表達(dá)水平。此外，以7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接種量、0.25 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)前培養(yǎng)5 h的條件進(jìn)行發(fā)酵顯著降低了DAEase的生產(chǎn)成本， DAEase活力達(dá)到（10.11±0.02） U/g；以 pH7.0、55 ℃ 和 1 mmol/L Co2+催化條件進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)，D-阿洛酮糖產(chǎn)量最高可達(dá)（11.47±0.04） g/L，基于這些結(jié)果，大腸桿菌冷休克表達(dá)系統(tǒng)在DAEase生產(chǎn)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步研究利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛酮糖提供技術(shù)參考。