噬菌體培養(yǎng)與鑒定方法研究進展

郭文瓊 盧家輝 潘伍亮 樂率

(1 成都醫(yī)學院護理學院，成都 610500；2 成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，成都 610500；3 陸軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室，重慶 400038)

噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境和人體，被認為是地球上數量最多的生命體，數量被估算為1031左右，但是被分離、鑒定和測序的噬菌體只有幾萬株[1]。噬菌體也是生命科學研究的熱門對象，基于噬菌體的研究發(fā)現了限制修飾酶、CRISPR-Cas系統等分子生物學工具[2-3]。新型噬菌體的分離、鑒定，有望拓展新的研究領域，發(fā)現新的生物學規(guī)律，是進一步開拓噬菌體研究的基石。本文就噬菌體分離鑒定的前沿需求、裂解性和溶原性噬菌體分離鑒定方法進展進行綜述，為噬菌體分離鑒定提出方法學的總結，并對未來研究進行展望，為開拓噬菌體研究新領域提供參考。

1 新型噬菌體培養(yǎng)與鑒定的研究意義

近年來，噬菌體的基礎和應用研究都在快速發(fā)展，新的研究領域催生了噬菌體分離鑒定的新需求[3]，尤其是以下幾個方面的研究亟需以大量新型噬菌體分離鑒定為基礎。

1.1 人體噬菌體組學研究

人體擁有巨大的微生物群落，稱為微生物組，微生物組中包括的大量病毒被統稱為“病毒組”[4-5]。近年來，使用宏基因組測序和其他方法對人類病毒組的研究已經闡明了不同身體部位人類病毒組的多樣性，病毒組主要由噬菌體組成，且與健康、疾病的關系被逐漸揭示。例如，炎性腸病患者的腸道病毒組會出現有尾噬菌體數量增加而微小噬菌體減少的情況，這一變化可能是由于細菌種群生態(tài)失調所導致的[5]。盡管關注度越來越高，但典型的病毒組研究中的大多數序列數據仍未被識別，這些未被探索的噬菌體“暗物質”對微生物組及其對人體的影響還不清楚，是當前研究的熱門領域。不僅如此，噬菌體還可用于調控腸道微生物組，調節(jié)腸道代謝組，提示噬菌體捕食對哺乳動物宿主的影響，說明噬菌體在治療腸道疾病中具有潛在價值[6-7]。

1.2 超級細菌的噬菌體治療

隨著抗生素的大量使用，越來越多的泛耐藥、甚至全耐藥細菌不斷涌現，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。噬菌體是治療“超級細菌”感染的重要武器，近年來，歐美和我國都相繼開展了噬菌體治療臨床試驗，利用敏感的噬菌體治療“超級細菌”感染，取得重要進展[8-10]。但是，由于噬菌體的特異性太高，因此每次治療前都需要針對患者的病原體，分離能夠特異性識別該細菌的噬菌體，而這一過程繁瑣且耗費大量人力物力。因此，亟需一種快速、高效分離噬菌體的方法。

1.3 環(huán)境噬菌體研究

自然環(huán)境中存在大量的噬菌體，如，海洋、沉積物和土壤等[11-13]。噬菌體的多樣性研究才剛剛開始，目前的噬菌體研究的采樣是局限的，許多環(huán)境仍然是未知的，因此，全球噬菌體多樣性遠遠超過培養(yǎng)分離株所代表的多樣性。而這些自然界存在的噬菌體的研究，將有助于人們更好地了解生態(tài)系統和進化規(guī)律。宏基因組學研究為自然環(huán)境的噬菌體研究提供了高通量的手段，一項研究分析了來自3042個地理上不同的樣本，獲得超過5 Tb的病毒宏基因組序列數據，發(fā)現了超過12.5萬個DNA病毒基因組，包括迄今為止確定的最大噬菌體，結果突出了廣泛的全球病毒多樣性，但是，其中大多數基因功能還是未知，大量的噬菌體也未被分離鑒定[11]。

1.4 農牧食品行業(yè)的噬菌體研究

噬菌體在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和食品加工業(yè)中有重要的應用價值。如，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的添加會帶來細菌耐藥性的嚴峻問題，而噬菌體可用于控制細菌感染，代替或減少抗生素的使用。噬菌體對葉際病原菌也有防控潛力，美國已批準用噬菌體控制丁香假單胞菌引起的番茄和胡椒的葉片黑斑病。

2 裂解性噬菌體分離鑒定的經典方法及其局限性

大量噬菌體的前沿領域都需要以新噬菌體分離鑒定為基石，噬菌體的分離鑒定是噬菌體研究的起點。噬菌體的發(fā)現是基于噬斑實驗：噬菌體裂解細菌后在平板上形成肉眼可見的空斑。其操作非常簡單：將宿主菌與噬菌體混合后，加入半固體培養(yǎng)基，然后倒在固體平板上，培養(yǎng)一段時間后，噬菌體裂解細菌并形成肉眼可見的噬斑，詳細的步驟可參考相關文獻[14]。

這一方法引領了噬菌體研究100余年，簡單易行，被寫入全球各地的教科書，導致形成思維定式，研究人員總想用噬斑實驗來分離所有噬菌體。但在科研實踐中，經常無法用噬斑實驗分離到特定細菌的噬菌體。因此，需要從噬菌體感染的過程來分析噬菌體的生活周期、噬斑形成機制，最后提出新的方法或對策，來分離、鑒定新的噬菌體。

噬菌體的生活周期，包括吸附、注入基因組、生物合成和裂解釋放等幾個部分。而噬菌體能否感染一個特定細菌，取決于能否吸附、能否利用細菌的分子機器進行生物合成、是否會被細菌的抵抗系統清除[1]。因此，需要從采樣樣本、細菌、培養(yǎng)條件、鑒定方法等不同層面來思考噬菌體分離鑒定的方法(表1)。

3 培養(yǎng)與鑒定新型裂解性噬菌體的策略

3.1 增加噬菌體分離的樣本來源

噬菌體不能脫離細菌而繁殖，因此，分離特定細菌的噬菌體，首先需要選擇該細菌比較富集的樣本，這種環(huán)境中存在相應噬菌體的概率也較大。如，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等細菌是醫(yī)院常見的病原體，在醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在[15-16]。在醫(yī)院人員和患者洗手和打掃衛(wèi)生后，這些細菌都最終匯集到醫(yī)院污水中。因此，消毒前的醫(yī)院污水富含這些耐藥性較強的“超級細菌”的同時，也往往含有大量的對應的噬菌體。從醫(yī)院污水中比較容易分離出銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等“超級細菌”的噬菌體[17]。但是，一個醫(yī)院或一個地區(qū)的細菌有一定的特異性，因此，噬菌體也具有較強的特異性。因此，一個醫(yī)院的污水中并不能分離到可以感染所有銅綠假單胞菌菌株的噬菌體。此時，可以去不同醫(yī)院或不同城市的醫(yī)院取污水進行噬菌體分離[18]。例如，上海噬菌體與耐藥研究所進行噬菌體治療時，偶爾也會遇到患者的細菌不能被已有噬菌體裂解的問題，且在上海幾家醫(yī)院污水中無法分離到噬菌體，而在深圳醫(yī)院污水中則分離到了該患者細菌的噬菌體[10]。此外，河水、海水中通常沒有這些“超級細菌”，在這些自然水樣中，分離到銅綠假單胞菌噬菌體的概率較低。因此，需要選擇目標細菌最可能廣泛存在的樣本進行噬菌體分離。例如，Hryckowian等[19]從美國和孟加拉國的4個污水處理廠的未處理污水中，成功分離到27株不同的擬桿菌屬細菌Bacteroides thetaiotaomicron的噬菌體。

古細菌(Archaea)是一類特殊的原核生物，在自然界中廣泛存在，包括一些極端的生態(tài)環(huán)境中。因此，從極端環(huán)境樣本中可分離到古菌的噬菌體[20-21]。其分離方法與細菌噬菌體的分離類似，如研究人員先采集鹽礦的鹽水和鹽晶體，溶解濾過后與鹽古菌混合，再進行噬斑實驗，最后分離到大量鹽古菌的噬菌體，并揭示了鹽古菌噬菌體的多樣性[21]。

3.2 擴大篩選的菌株數量

噬菌體是有極強的特異性的，這種特異性通常是菌株水平的特異性，也就是一個噬菌體通常只能感染一種細菌中的部分菌株。這種特異性的機制是非常復雜的，總的來說，取決于兩大機制：首先是噬菌體對細菌的吸附能力，其具有很強特異性。其次，是細菌含有大量的抵抗噬菌體的機制，這將導致噬菌體無法繁殖形成噬斑[22]。因此，在分離特定細菌的噬菌體時，應該先盡量多地收集目標菌株，用不同的菌株進行分離，如不同血清型的菌株，這將增加分離到的概率。

Goller等[18]首先收集了117株不同的葡萄球菌菌株，然后從大量污水環(huán)境中分離了94種新型葡萄球菌噬菌體。發(fā)現大多數噬菌體只有一個分離宿主，即裂解譜很窄，只能用特殊的菌株進行分離鑒定，而部分噬菌體則表現為廣宿主譜，可以跨種感染不同細菌，這種廣譜噬菌體對基因水平轉移和生態(tài)學都有一定的影響。

此外，還可以選擇缺乏抵抗噬菌體機制的宿主來進行分離，則分離到的噬菌體概率會增加。Maffei 等[23]將大腸埃希菌的O抗原、所有的噬菌體抵抗系統(限制修飾系統、流產感染系統)都敲除后，用該細菌K-12 MG1655 ΔRM為宿主，從不同環(huán)境中分離到61個新噬菌體。用O抗原缺失的細菌可避免篩選到以O抗原為受體的噬菌體。因此，此次分離的新噬菌體的受體均為不同的細菌表面蛋白，且研究人員回補一種限制修飾系統后，細菌將對部分噬菌體產生抵抗，導致噬斑無法形成。該研究說明，細菌攜帶的各種抵抗機制會限制分離到噬菌體的概率，而用缺乏該系統的菌株則有望分離到新的噬菌體。

宏基因組學研究發(fā)現ssDNA噬菌體大量存在于腸道等環(huán)境中，但是分離鑒定的ssDNA噬菌體相對較少。少數裂解性的ssDNA噬菌體可利用噬斑實驗進行分離鑒定[24]。但部分ssDNA噬菌體為溶原性噬菌體，且攜帶有超感染排斥機制(superinfection exclusion)，這些噬菌體整合在細菌基因組中，導致這些細菌對其他ssDNA噬菌體形成抵抗，難以形成噬斑。因此，ssDNA噬菌體有時難以用噬斑實驗分離[25]。

3.3 模擬噬菌體培養(yǎng)的新條件

細菌-噬菌體相互作用非常復雜，需要特定的培養(yǎng)條件，因此根據實驗需要，盡量模擬原始生態(tài)環(huán)境中的條件，更容易在實驗室創(chuàng)造適合目標噬菌體繁殖的環(huán)境。如，腸道細菌大多為厭氧和微需氧細菌，且大部分腸道細菌難以培養(yǎng)。因此，Santiago-Rodriguez等[26]建立了糞便恒溫培養(yǎng)系統，利用改進的Infors Multifors系統模擬人類遠端結腸環(huán)境以支持病毒組的復制，在24 d的5個不同時間點檢查了培養(yǎng)的噬菌體群落，發(fā)現它們具有高度的個體特異性，且與原始糞便樣本中的噬菌體群落高度相似，說明該方法可以用于支持噬菌體群落的繁殖。

對于難以在實驗室條件下培養(yǎng)的細菌，需要先優(yōu)化培養(yǎng)方法來培養(yǎng)目標細菌。如高通量測序技術證實SAR11是淡水中較為豐富的一種異養(yǎng)細菌，但是一直無法培養(yǎng)。研究人員將水樣稀釋到每個孔只含有1個細菌，然后在23℃培養(yǎng)30 d后，終于鑒定出了一些SAR11細菌[27]。其生長非常緩慢，需要12 h才能繁殖一代，因此，較難分離培養(yǎng)。而分離到該細菌之后，研究人員就發(fā)現其攜帶的前噬菌體NP1。進而發(fā)現營養(yǎng)充足時，約2.3%的細菌會被NP1裂解，而在碳源缺乏的培養(yǎng)條件下，30.6%的細菌會被其裂解，揭示了噬菌體在海洋細菌生態(tài)學中的重要作用[28]。

3.4 選擇最佳的噬菌體鑒定方法

如果確定某一噬菌體在目標細菌中可以繁殖，但是又無法形成噬斑時，可采用其他手段來鑒定。例如，宏基因組學研究發(fā)現腸道中有大量的噬菌體，其中crAss類噬菌體是最知名的腸道噬菌體之一，超過50%的人類腸道中都有該噬菌體，且預測其宿主為擬桿菌。但是，用不同的擬桿菌為宿主分離crAss001，發(fā)現均沒有噬斑。最后，Colin Hill團隊[29]就用宏基因組測序來檢測crAss001是否能在對應細菌樣本中進行繁殖。研究人員首先收集利用宏基因組技術鑒定了含有crAss001的樣本，然后將其上清與54個腸道主要的細菌菌株分別混合，用宏基因組技術檢測混合培養(yǎng)后的上清中是否有crAss001的基因組序列，結果發(fā)現Bacteroidales intestinalis919/174菌株可以支持crAss001的復制，進而發(fā)現crAss001可以在該菌株中形成噬斑。但是crAss001的宿主特異性非常高，另外14個來自6個不同種的擬桿菌菌株則不能被crAss001感染，無法形成噬斑[29]。該研究說明，在對未知宿主的噬菌體進行分離時，可先用大量菌株和測序技術，確定該噬菌體能否復制，再去進一步精確尋找其宿主。

隨后，Colin Hill團隊[30]則繼續(xù)嘗試使用噬斑實驗分離其他crAss類噬菌體，但未成功。于是，對糞便樣本進行厭氧培養(yǎng)后，同時加入萬古霉素和卡那霉素，抑制革蘭陽性和兼性厭氧細菌的生長，并有利于嚴格厭氧的革蘭陰性擬桿菌生長。然后，對培養(yǎng)液進行宏基因組測序，發(fā)現crAss類噬菌體的比例在增加。同時，將富含crAss類噬菌體的糞便樣品進行培養(yǎng)，根據菌落形態(tài)選擇了48個菌落，進行16S rRNA基因片段的測序后，發(fā)現48個菌落分別屬于6個菌種。將富含crAss噬菌體的上清分別加入到 48個菌株后，再用qPCR檢測單個菌株中crAss類噬菌體是否增加，最終從B.xylanisolνensAPCS1/XY菌株中鑒定到ΦcrAss002噬菌體的繁殖。但是，ΦcrAss002不會在敏感細菌中形成噬斑，液體培養(yǎng)時也不會導致菌液裂解澄清，說明ΦcrAss002和類桿菌可以在適宜環(huán)境中共存，而不會產生劇烈的篩選而導致“此消彼長”[30]。

此外，還可以采用不同的病毒基因組抽提方法，來鑒定噬菌體的存在。與成千上萬的已經完成測序的雙鏈DNA噬菌體相比，目前只有8個雙鏈RNA噬菌體被測序[31]。有趣的是，雙鏈RNA病毒在真菌中非常常見，通常具有共生或互惠的生活方式，不導致真菌的死亡[32]。因此，使用噬斑實驗可能無法分離到這種非裂解生活周期的噬菌體。我們應用分離真菌病毒的方法來鑒定細菌中的雙鏈RNA噬菌體，成功地從一株微枝桿菌中分離出一種新的雙鏈RNA噬菌體phiNY[33]。phiNY的基因組由3個雙鏈RNA片段組成，其基因組序列與任何其他噬菌體都沒有核苷酸序列相似性。且感染phiNY的菌株比未感染噬菌體的菌株生長得更快，表現為一種共生寄生的生活方式。因此，這項研究不僅揭示了一種新的互惠寄生雙鏈RNA噬菌體，也提示：其他病毒分離方法對于鑒定具有其他生活方式的噬菌體是有價值的。

4 溶原性噬菌體的鑒定與培養(yǎng)方法

溶原性噬菌體是一類可以整合在細菌基因組中的噬菌體，具有裂解和溶原兩種周期[34]。有些溶原性噬菌體可形成模糊的噬斑，有些溶原性噬菌體則無法形成噬斑。這是由于不同噬菌體進入裂解和溶原周期的調控機制不一，不僅涉及噬菌體自身的調控機制，如抑制蛋白CI對噬菌體的抑制，還涉及群體感應系統、SOS系統、H-NS蛋白等系統對溶原周期的調控[34-35]。溶原性噬菌體的鑒定方法包括以下3種。

4.1 利用噬斑實驗鑒定溶源性噬菌體

部分溶原性噬菌體可以形成模糊噬斑，這是比較理想的研究對象。如部分溶原性噬菌體可在傷寒沙門菌中形成噬斑，可用噬斑實驗進行檢測[36]。但是，溶原性噬菌體要形成噬斑，不僅面臨裂解性噬菌體所面臨的所有問題，還涉及溶原-裂解周期的調控機制[37]。因此，大部分溶原性噬菌體不能形成噬斑。但是，如果敲除部分抵抗機制相關基因，則可以使得溶原性噬菌體形成噬斑。例如，傷寒沙門菌攜帶的BstA是一種流產感染系統蛋白，能抵抗溶源性噬菌體的感染。而敲除BstA的菌株則可被部分溶源性噬菌體感染，形成模糊的噬斑，便于觀察和研究[36]。

4.2 誘導溶源性噬菌體進入裂解周期并鑒定

部分溶原性噬菌體很穩(wěn)定地整合于細菌基因組，不容易進入裂解周期，無法形成噬斑?？捎媒z裂霉素C、紫外線等方法，誘導前噬菌體進入裂解周期，形成溶原性噬菌體顆粒[38]。如果誘導成功，可使得菌液變澄清，或者顯微鏡下觀察發(fā)現細菌大量裂解，則高度提示有溶原性噬菌體產生。進一步抽提病毒顆粒的基因組，進行測序鑒定，或者進行電鏡觀察。

4.3 溶源性噬菌體的生物信息學預測與鑒定

從細菌基因組和宏基因組序列中預測溶原性噬菌體，再有目標地進行分離鑒定，可提高分離鑒定成功率，給溶原性噬菌體的研究提供了極大的便利。溶原性噬菌體是口腔和腸道病毒組的主要成員，溶原性噬菌體在口腔、腸道中的作用受到高度關注[39]。因此，基于宏基因組技術的噬菌體組學方法可幫助判斷所培養(yǎng)的樣本中是否存在目標噬菌體。如，MARVEL是基于隨機森林機器學習方法來預測宏基因組中的噬菌體序列[40]。另一項研究對16種宏基因組組裝方法在噬菌體組研究中的作用進行了比較[41]，發(fā)現不同軟件的組裝性能差異很大，SPAdes(meta)軟件的表現較好。但是，病毒組數據分析還有很多挑戰(zhàn)，如低讀取覆蓋率、基因組重復導致組裝的基因組回收率低、碎片化程度高、閾值設定等，從病毒組數據中得出結論時必須謹慎考慮這些因素。

此外，根據單個細菌的序列可更準確地預測前噬菌體，如Phage_Finder[42]、PHASTER[43]和 Prophage Hunter[44]。PHASTER是一個基于網絡的服務器，用于快速識別和注釋細菌基因組和質粒中的原噬菌體序列[43]。Prophage Hunter不僅可以系統地定位細菌基因組內的原噬菌體區(qū)域，并預測原噬菌體的活性，它還確定了與目標原噬菌體在系統進化上最相關的噬菌體，并在整個噬菌體基因組中注釋蛋白質的功能[44]。根據預測的前噬菌體及其激活后的狀態(tài)，就可以設計實驗，利用PCR或電鏡等方式對激活的前噬菌體進行鑒定[45]。

例如，Cornuault等[46]先利用PHASTER工具，從15株普氏糞桿菌(Faecalibacterium prausnitzii)基因組中預測了18個前噬菌體，用測序的方法發(fā)現前噬菌體Lagaffe和Mushu可以被激活，其基因組拷貝數分別為宿主菌A2-165的8倍和16倍，然后用電鏡觀察到Mushu噬菌體的形態(tài)，但是這些噬菌體不會形成噬斑，無法用噬斑實驗進行鑒定。

以上程序主要依賴已知噬菌體的內置驗證數據集進行序列相似性搜索，以識別與噬菌體相關的基因富集區(qū)域，預測出的前噬菌體很多是不能進入裂解周期的。最近，王曉雪團隊設計了一個預測前噬菌體的軟件Prophage Tracer[47]，該程序是基于單個細菌基因組測序原始數據，來預測是否有溶原性噬菌體的軟件，而不是基于噬菌體基因相似性搜索。Prophage Tracer使用重疊拆分技術讀取包含細菌和噬菌體的整合序列，代表原噬菌體切除信號的位點。如果前噬菌體被激活，測序時就會出現上述信號，軟件可檢測到激活的前噬菌體特征，并可預測前噬菌體的精確整合位點(表1)。

表1 噬菌體分離鑒定方法總結Tab.1 The methods to isolate bacteriophag

5 展望

隨著微生物組[48]、基因編輯工具[49]和噬菌體治療[50-51]等領域的飛速發(fā)展，噬菌體研究也進入了復興時代。但是，目前大多數噬菌體研究對象還比較局限，多為模式細菌、常見病原體以及少數生態(tài)環(huán)境中的噬菌體，還有大量的新型噬菌體有待分離鑒定，而這些噬菌體中可能蘊含著全新的生物學現象，或存在新的分子生物學工具，是進一步拓展噬菌體研究的基石。

噬菌體是細菌的病毒，而目前自然界還有大量的細菌無法分離培養(yǎng)[52-53]，因此，噬菌體研究人員也應及時關注細菌分離培養(yǎng)的新方法，利用新分離的細菌去分離新的噬菌體，則有望發(fā)現全新的生物學規(guī)律[28]。

在無法分離到所需的噬菌體時，要仔細思考和創(chuàng)新噬菌體的分離方法，可考慮更換樣本、宿主菌和培養(yǎng)方法，使得噬菌體可在實驗室模擬的環(huán)境下繁殖，而噬菌體最終要裂解細菌并釋放噬菌體顆粒。因此，可用噬斑實驗、qPCR、熒光染色、宏基因組測序、電鏡等多種鑒定手段證實噬菌體的存在，再進一步對噬菌體進行鑒定，為開拓新的研究領域奠定基礎。