• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    二甲雙胍聯(lián)合來曲唑改善子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的機(jī)制研究

    2022-11-11 03:41:12程夢星張秋菊陳琪珍
    實用臨床醫(yī)藥雜志 2022年20期
    關(guān)鍵詞:曲唑孕激素亞組

    程夢星, 張秋菊, 陳 雄, 陳琪珍

    (上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 上海, 201900)

    子宮內(nèi)膜癌作為婦科常見的惡性腫瘤,其發(fā)病呈年輕化的趨勢[1]。目前,臨床上治療子宮內(nèi)膜癌主要采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療[2]。對于年輕的、有生育要求的、晚期復(fù)發(fā)的以及不宜接受手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌患者,可采用孕激素保守治療,即應(yīng)用醋酸甲羥孕酮(MPA)治療此類子宮內(nèi)膜癌患者[3]。研究[3]發(fā)現(xiàn)孕激素結(jié)合孕激素受體(PR)可延緩DNA及RNA的復(fù)制,降低雌激素受體(ER)表達(dá),進(jìn)而減少子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化。然而,臨床上仍有約30%的子宮內(nèi)膜癌患者對孕激素治療無反應(yīng),約47%的患者在首次孕激素治療后復(fù)發(fā)或發(fā)展為孕激素抵抗[4]。本課題組前期細(xì)胞研究[5]結(jié)果表明,外源性雌激素作用后可顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2/人源性長壽保障基因2(Nrf2/Lass2)的mRNA表達(dá)水平,且Lass2可介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素治療敏感性。本研究通過構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植模型,采用動物實驗證明Lass2介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的改善作用,為臨床上應(yīng)用來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌的孕激素耐藥性提供更多的研究數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,儲存于上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室; Balb/c裸鼠40只,雌性, 6~8周齡,體質(zhì)量20~24 g, 購自上海西普爾-必凱實驗動物公司,由上海市第一人民醫(yī)院動物中心喂養(yǎng); 二甲雙胍及MPA 購自Sigma公司,二甲雙胍、MPA均溶解于無菌的生理鹽水中; ER、PR、Nrf2、Lass2單克隆抗體均購自Sigma公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    常規(guī)復(fù)蘇Ishikawa細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至含胎牛血清10%、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L的DMEM-F12培養(yǎng)基中,而后迅速置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)及傳代,細(xì)胞貼壁生長,采集對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)的實驗。

    1.3 子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型的建立和處理

    1.3.1 建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型: 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將40只雌性裸鼠隨機(jī)分為對照組和雌激素組,每組20只。雌激素組每只裸鼠接種后連續(xù)給予補(bǔ)佳樂0.05 mg(相當(dāng)于人類劑量2 mg/d, 溶于2 mL生理鹽水中),灌胃1次/d。7 d后, 2組裸鼠均接種Ishikawa細(xì)胞,取對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰蛋白酶分解后配制成107/mL的單細(xì)胞懸液,在無菌條件下于裸鼠右腋處進(jìn)行皮下接種,每只裸鼠注射0.2 mL, 細(xì)胞計數(shù)約為2×106。注射7~10 d后,可見瘤體增長。

    1.3.2 實驗分組與處理: 細(xì)胞接種后第14天,移植瘤的平均長徑為0.5~1.0 cm。遵循腫瘤體積與裸鼠質(zhì)量平衡的原則,將對照組和雌激素組的裸鼠再隨機(jī)分為4組,每組5只,即生理鹽水組、MPA組(MPA 100 mg/kg腹腔注射,每只裸鼠0.3 mL)、來曲唑聯(lián)合MPA組(來曲唑7 mg/kg, 每只裸鼠0.1mL, MPA劑量及用法同MPA組)、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組(二甲雙胍200 mg/kg灌胃給藥,每只裸鼠0.1 mL, 其他藥物用法同來曲唑聯(lián)合MPA組)。二甲雙胍和來曲唑均為灌胃給藥, 1次/d, 共給藥21次; MPA經(jīng)腹腔注射給藥,3次/周,共給藥9次; 生理鹽水組裸鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。

    1.4 觀察指標(biāo)

    成瘤后,采用游標(biāo)卡尺對裸鼠進(jìn)行皮下腫瘤瘤體的長徑a(cm)和短徑b(cm)的測量并稱重,觀察裸鼠的行為。用藥3周后,對成瘤裸鼠進(jìn)行解剖,測量瘤體的體積,計算腫瘤抑制率。腫瘤體積(cm3)=a×b2×1/6×π。腫瘤抑制率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。以各組移植瘤瘤體的平均體積作為縱軸,用藥后的時間作為橫軸,繪制腫瘤的生長曲線。

    末次給藥后30 min, 采取頸椎錯位法處死裸鼠,經(jīng)眼球采血,以3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 收集裸鼠血清,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用酶聯(lián)免疫夾心法檢測裸鼠血清雌激素及雌激素水平。

    1.5 免疫組化法檢測腫瘤組織中ER、PR、Nrf2、Lass2的蛋白表達(dá)

    采用免疫組化染色法,石蠟切片并常規(guī)脫蠟至水化,使用蒸餾水沖洗,而后PBS沖洗,配制1 L的檸檬酸修復(fù)液(一水合檸檬酸0.4 g和檸檬酸二鈉3 g), 調(diào)整pH值為6.0; 將切片放入修復(fù)液,采用高壓煮沸10 min, 使其自然狀態(tài)下降至室內(nèi)溫度, PBS沖洗3次,抗原修復(fù); 先用3%過氧化氫室溫孵育10 min, 再行PBS沖洗,再用10%山羊血清室溫封閉; 滴加適當(dāng)稀釋比例的一抗, 4 ℃孵育過夜(Nrf2抗體1∶100, Lass2抗體1∶200), 室溫孵育1 h, PBS緩沖液洗滌,滴加二抗,室溫孵育30 min, PBS洗滌,DAB顯色,蘇木紫復(fù)染,干燥封片。顯微鏡下觀察并拍攝照片。隨機(jī)抽取各亞組中3份裸鼠腫瘤標(biāo)本,制成病理切片,并請病理科醫(yī)生讀片。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 各組裸鼠血清雌激素及孕激素比較

    在雌激素組中,各亞組裸鼠用藥后,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平低于MPA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中,各亞組裸鼠用藥后,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平也低于MPA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雌激素組與對照組用藥后裸鼠血清雌激素及孕激素比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 雌激素組與對照組中各亞組裸鼠用藥后血清雌激素及孕激素比較 pmol/L

    2.2 各亞組裸鼠移植瘤生長情況比較

    從移植腫瘤開始,每天對移植部位進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),腫瘤局部發(fā)紅,略有腫脹,腫瘤體積逐漸變大,腫瘤形狀為圓形或卵形,質(zhì)地堅硬。各亞組裸鼠在成瘤后,其前期運(yùn)動狀態(tài)無明顯變化; 成瘤晚期時,因腫瘤體積逐漸增大,裸鼠的運(yùn)動能力降低,但各亞組裸鼠的體質(zhì)量比較,差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 各亞組裸鼠用藥前與用藥后的體質(zhì)量變化比較 g

    2.3 來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌移植瘤孕激素敏感性

    藥物治療21 d后,在雌激素組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為48.25%、67.97%、75.43%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為49.46%、69.97%、75.96%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    表3 各亞組裸鼠移植瘤體積及腫瘤抑制率比較

    腫瘤生長曲線顯示,雌激素組與對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的腫瘤生長曲線斜率均小于生理鹽水組,其中二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組腫瘤生長速度最慢。見圖1。

    2.4 免疫組化分析各亞組裸鼠移植瘤中ER、PR、Nrf2、Lass2蛋白表達(dá)

    免疫組化結(jié)果顯示,在雌激素組中,來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組中Nrf2、Lass2的表達(dá)低于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。在雌激素組與對照組間,采取相同治療方式的亞組裸鼠移植瘤中的ER表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖3。在雌激素組和對照組中,來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的PR表達(dá)均高于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

    3 討 論

    按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[6],子宮內(nèi)膜癌的傳統(tǒng)外科治療方式為全子宮切除和雙附件切除,并按臨床分期進(jìn)行盆腔淋巴結(jié)清掃聯(lián)合腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃。研究[7]顯示,子宮內(nèi)膜癌的中位發(fā)病年齡為63歲,其中約30%的患者在絕經(jīng)前發(fā)病,而標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)療法不僅會導(dǎo)致年輕患者喪失生育能力,而且會使絕經(jīng)前女性喪失卵巢內(nèi)分泌功能,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。GARZON S等[8]研究表明,大劑量黃體酮可以作為早期子宮內(nèi)膜癌的一種保守療法,但臨床中仍有約30%的患者對孕激素治療不敏感。有關(guān)孕激素耐藥的研究較多,多與ER、PR的不同表達(dá)以及對藥物的敏感性有關(guān)[9-10], 而胰島素抵抗、肥胖等也可能與女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)異常有關(guān)[11], 從而影響了腫瘤的發(fā)展及藥物治療。

    FERGUSON S E等[12]提出了子宮內(nèi)膜癌分型的概念,根據(jù)其與雌激素的關(guān)系,將子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型和非雌激素依賴型。來曲唑?qū)儆诜枷慊敢种苿梢种迫梭w內(nèi)雌激素的分泌,還能有效阻止由雌激素誘發(fā)的癌細(xì)胞增殖。王巧蓮等[13]研究表明,來曲唑可以明顯抑制子宮內(nèi)膜癌移植瘤的增長,但10 μg/d來曲唑的效果并不優(yōu)于1 μg/d來曲唑的效果,考慮是小劑量的來曲唑便能阻斷雌激素的產(chǎn)生[13]。本研究結(jié)果顯示,來曲唑聯(lián)合MPA組的腫瘤抑制率顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。Nrf2是抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子,抗氧化反應(yīng)原件(ARE)與其結(jié)合后,可正向調(diào)控抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵基因等眾多下游基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。CHEN N等[14]認(rèn)為Nrf2具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用,并可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)和抗腫瘤藥物的氧化損害,并通過激活一系列的藥物代謝和抗凋亡基因來實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的放療。本課題組前期研究[5]結(jié)果提示,與正常子宮內(nèi)膜組織相比, Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá); 增殖測定表明Nrf2/Lass2的過度表達(dá)導(dǎo)致孕激素抗性; 相反的,敲低Lass2則會增加細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞活力。此外,二甲雙胍可通過下調(diào)Nrf2/Lass2表達(dá)克服孕激素抵抗。

    本研究結(jié)果顯示,來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA、來曲唑聯(lián)合MPA均可顯著抑制孕激素敏感的Ishikawa細(xì)胞移植瘤的生長(P<0.05); 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明,來曲唑聯(lián)合MPA治療后腫瘤組織孕激素耐藥相關(guān)因子Nrf2、Lass2在組織內(nèi)的表達(dá)顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。研究[15]證明芳香化酶抑制劑阿那曲唑可以抑制局部雌激素合成,其可能通過抑制編碼芳香化酶CYP19來實現(xiàn),從而能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。有研究[16]表明,二甲雙胍可以改善子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對黃體酮的耐藥性,其機(jī)制是通過增加PR-β蛋白的表達(dá)來改善耐藥細(xì)胞對黃體酮的耐藥性。本研究結(jié)果表明,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 且腫瘤抑制率高于來曲唑聯(lián)合MPA組(P>0.05)。本研究免疫組化結(jié)果顯示,生理鹽水組腫瘤組織中Nrf2/Lass2的陽性表達(dá)顯著較少(P<0.05), 與腫瘤生長減慢的趨勢相同。Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌的耐藥中起著重要的調(diào)節(jié)作用,作者認(rèn)為其機(jī)制可能是來曲唑通過阻斷裸鼠體內(nèi)雌激素的合成而抑制子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的生長,同時來曲唑還能夠降低體內(nèi)雌激素的表達(dá),降低腫瘤耐藥相關(guān)因子Nrf2/Lass2的表達(dá)。

    研究[17]認(rèn)為PR陰性提示孕激素治療預(yù)后較差。16%~34%的年輕患者存在免疫組化錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺陷[18]。相較于正常錯配修復(fù)蛋白表達(dá)的患者,錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失者對孕激素治療的反應(yīng)較差[19],這部分患者缺乏功能性PR的表達(dá)以及突變后腫瘤抑制基因缺失,進(jìn)而導(dǎo)致孕激素?zé)o法介導(dǎo)細(xì)胞分化、沉默及凋亡。本研究結(jié)果表明,來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 推測來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對PR陽性的患者更具治療價值。

    綜上所述,來曲唑能夠有效改善人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的孕激素耐藥性,二甲雙胍可增強(qiáng)該反應(yīng)。來曲唑聯(lián)合二甲雙胍通過參與雌激素與Nrf2及其下游Lass2基因表達(dá)及功能之間的反饋調(diào)節(jié),減少了Nrf2/Lass2的表達(dá),從而增強(qiáng)了孕激素的敏感性。

    猜你喜歡
    曲唑孕激素亞組
    基于Meta分析的黃酮類化合物對奶牛生產(chǎn)性能和血清免疫指標(biāo)影響的研究
    慢性阻塞性肺疾病患者膈肌移動度分析
    槭葉鐵線蓮亞組的研究進(jìn)展
    園林科技(2021年3期)2022-01-19 03:17:32
    冠心病患者腸道菌群變化的研究 (正文見第45 頁)
    保胎藥須小心服
    脈血康膠囊聯(lián)合雌孕激素治療血瘀型原因不明的月經(jīng)過少
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:31
    來曲唑灌胃后EM大鼠病灶體積及COX-2 mRNA、survivin蛋白表達(dá)變化
    雌、孕激素水平檢測與過期妊娠分娩發(fā)動的關(guān)系
    來曲唑治療多囊卵巢綜合癥臨床研究
    來曲唑或氯米芬聯(lián)合人絕經(jīng)期促性腺激素用于PCOS婦女促排卵療效的比較
    天堂动漫精品| 人人妻人人澡人人看| 成年人免费黄色播放视频| videosex国产| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 免费少妇av软件| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产欧美亚洲国产| 国产精品 国内视频| 99精品久久久久人妻精品| av一本久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美黑人欧美精品刺激| 麻豆国产av国片精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲色图av天堂| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久久久精品国产欧美久久久| 黑人操中国人逼视频| 久9热在线精品视频| 久久久久网色| 电影成人av| 国产三级黄色录像| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 性色av乱码一区二区三区2| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲精品自拍成人| 黄频高清免费视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 成人亚洲精品一区在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 男女床上黄色一级片免费看| cao死你这个sao货| 久久久国产一区二区| 国产在视频线精品| 91字幕亚洲| 亚洲久久久国产精品| 国产黄色免费在线视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一区二区三区乱码不卡18| 精品国产亚洲在线| 777米奇影视久久| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲精华国产精华精| 免费人妻精品一区二区三区视频| av福利片在线| 老司机午夜福利在线观看视频 | 欧美午夜高清在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久国产精品大桥未久av| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲色图av天堂| 精品国产亚洲在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲久久久国产精品| 国产精品电影一区二区三区 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 高清在线国产一区| 在线 av 中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| av有码第一页| 99热国产这里只有精品6| 黄色丝袜av网址大全| 日韩免费高清中文字幕av| 国产高清视频在线播放一区| 国产av又大| 超色免费av| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品av久久久久免费| 国产黄色免费在线视频| 正在播放国产对白刺激| 亚洲色图av天堂| 男女无遮挡免费网站观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 操出白浆在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产黄频视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 美女福利国产在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一进一出好大好爽视频| 中国美女看黄片| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美日韩av久久| 国产不卡一卡二| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲综合色网址| 99国产精品一区二区三区| av天堂在线播放| 岛国毛片在线播放| aaaaa片日本免费| 大片免费播放器 马上看| 国产高清视频在线播放一区| 大香蕉久久网| 中文亚洲av片在线观看爽 | 涩涩av久久男人的天堂| 欧美中文综合在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 热99re8久久精品国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品国产国语对白av| 日韩有码中文字幕| 多毛熟女@视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产在视频线精品| 欧美日韩av久久| a级毛片黄视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 老汉色∧v一级毛片| 精品人妻1区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 久久亚洲真实| 视频在线观看一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| e午夜精品久久久久久久| 欧美精品av麻豆av| 午夜福利影视在线免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| tube8黄色片| www.999成人在线观看| 免费高清在线观看日韩| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| bbb黄色大片| 一级毛片电影观看| 午夜福利视频精品| 午夜激情av网站| 国产xxxxx性猛交| 最近最新免费中文字幕在线| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久 | 99国产精品一区二区蜜桃av | 中文亚洲av片在线观看爽 | 无人区码免费观看不卡 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 极品教师在线免费播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产日韩欧美在线精品| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜福利,免费看| tube8黄色片| 丝袜美足系列| 日韩中文字幕视频在线看片| av片东京热男人的天堂| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲成国产av| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 91老司机精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品二区激情视频| 两人在一起打扑克的视频| 午夜激情av网站| 99国产精品免费福利视频| bbb黄色大片| 女性被躁到高潮视频| 亚洲男人天堂网一区| 中国美女看黄片| 一区福利在线观看| 男女免费视频国产| 国产午夜精品久久久久久| 91精品三级在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 蜜桃在线观看..| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美黄色淫秽网站| 精品高清国产在线一区| 免费日韩欧美在线观看| 天堂动漫精品| 在线av久久热| 美女视频免费永久观看网站| 久久久久久久精品吃奶| 日日爽夜夜爽网站| 免费少妇av软件| 两性夫妻黄色片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久人妻熟女aⅴ| 国产成人欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一卡二卡三卡精品| bbb黄色大片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 热99久久久久精品小说推荐| 无人区码免费观看不卡 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产欧美网| 久久亚洲精品不卡| 叶爱在线成人免费视频播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 成人国产一区最新在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 超碰成人久久| 大香蕉久久网| 久久人妻av系列| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产av又大| 在线 av 中文字幕| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久视频综合| 老熟女久久久| 久久九九热精品免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 午夜老司机福利片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 天天添夜夜摸| 精品少妇久久久久久888优播| 国产成人系列免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 下体分泌物呈黄色| 99国产综合亚洲精品| 久久ye,这里只有精品| 久久精品国产a三级三级三级| 最新的欧美精品一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产1区2区3区精品| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品国产av在线观看| 国产区一区二久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 不卡一级毛片| 18禁国产床啪视频网站| 国产黄色免费在线视频| 看免费av毛片| av线在线观看网站| 日韩欧美三级三区| 国产男女超爽视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久国内视频| 成人三级做爰电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产欧美在线一区| 国产日韩欧美视频二区| 国产男女超爽视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 91国产中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久亚洲真实| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩欧美国产一区二区入口| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久香蕉激情| 免费av中文字幕在线| 欧美日韩av久久| 成人免费观看视频高清| 波多野结衣一区麻豆| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲视频免费观看视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 999精品在线视频| 国产成人精品在线电影| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜视频精品福利| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产在线视频一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一区二区三区激情视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| www.熟女人妻精品国产| 天堂俺去俺来也www色官网| a级片在线免费高清观看视频| tocl精华| 真人做人爱边吃奶动态| 免费日韩欧美在线观看| 美女午夜性视频免费| 亚洲精品自拍成人| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 色视频在线一区二区三区| 黄色 视频免费看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成人三级做爰电影| 日韩中文字幕欧美一区二区| 五月开心婷婷网| 亚洲成国产人片在线观看| www日本在线高清视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线观看免费高清a一片| 99国产精品免费福利视频| av天堂久久9| 久久狼人影院| 国产激情久久老熟女| 精品亚洲成国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人av一区二区三区在线看| 波多野结衣一区麻豆| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 9色porny在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久香蕉激情| 看免费av毛片| 日本五十路高清| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜免费鲁丝| 亚洲 国产 在线| 亚洲av日韩在线播放| 黄片播放在线免费| 999久久久国产精品视频| tocl精华| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99精品久久久久人妻精品| 婷婷成人精品国产| 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 啦啦啦在线免费观看视频4| 天堂动漫精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一进一出好大好爽视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲视频免费观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 在线永久观看黄色视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线天堂中文资源库| 日日夜夜操网爽| 一二三四社区在线视频社区8| 怎么达到女性高潮| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日爽夜夜爽网站| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 日本a在线网址| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一级片免费观看大全| 9热在线视频观看99| 大型av网站在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜两性在线视频| 亚洲天堂av无毛| 婷婷成人精品国产| 国产成人av教育| 乱人伦中国视频| 日本wwww免费看| 国产男靠女视频免费网站| 桃花免费在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 成人18禁在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产三级黄色录像| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美激情高清一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清 | 日本wwww免费看| 亚洲五月色婷婷综合| 男女之事视频高清在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产成人影院久久av| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品影院久久| 人妻久久中文字幕网| 欧美黑人精品巨大| 国产高清国产精品国产三级| 成年人免费黄色播放视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日本av手机在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 又大又爽又粗| 黄色 视频免费看| 午夜老司机福利片| 欧美在线黄色| 亚洲欧洲日产国产| 十八禁网站免费在线| av国产精品久久久久影院| 亚洲av电影在线进入| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 性少妇av在线| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 91成年电影在线观看| 国产在视频线精品| 精品福利观看| 1024视频免费在线观看| 午夜视频精品福利| 亚洲精品乱久久久久久| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲人成77777在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产黄频视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产单亲对白刺激| 亚洲精品一二三| 一级毛片精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 视频区图区小说| 日韩一区二区三区影片| av福利片在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久久精品94久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 黄色毛片三级朝国网站| 成在线人永久免费视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 18在线观看网站| 动漫黄色视频在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 两个人免费观看高清视频| 久久热在线av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 超碰成人久久| 91国产中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| www.精华液| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄色片一级片一级黄色片| 99久久人妻综合| 国产区一区二久久| 1024香蕉在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲av电影在线进入| 曰老女人黄片| 日本av免费视频播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲久久久国产精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 天天操日日干夜夜撸| 日本黄色视频三级网站网址 | 成人精品一区二区免费| 满18在线观看网站| 悠悠久久av| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲熟妇熟女久久| 757午夜福利合集在线观看| a在线观看视频网站| av线在线观看网站| www.熟女人妻精品国产| 国产成人精品在线电影| 久热爱精品视频在线9| 一进一出抽搐动态| 国产不卡一卡二| xxxhd国产人妻xxx| 男女免费视频国产| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 婷婷丁香在线五月| 日本精品一区二区三区蜜桃| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 麻豆av在线久日| 韩国精品一区二区三区| 一级毛片电影观看| 亚洲av电影在线进入| 国产精品免费视频内射| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久毛片免费看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 在线看a的网站| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 最新的欧美精品一区二区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品自拍成人| 国产精品98久久久久久宅男小说| av网站免费在线观看视频| 欧美性长视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 一级毛片精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 91成年电影在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线观看66精品国产| 男女边摸边吃奶| 日韩一区二区三区影片| 欧美精品一区二区大全| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精华国产精华精| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲人成77777在线视频| 精品久久久精品久久久| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲专区字幕在线| 老司机影院毛片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 久久久国产一区二区| 搡老岳熟女国产| 久久久久视频综合| 波多野结衣av一区二区av| 国产单亲对白刺激| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品一区二区免费欧美| 91精品三级在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 国产成人精品在线电影| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品二区激情视频| 我的亚洲天堂| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品国产av在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲久久久国产精品| 国产精品电影一区二区三区 | 免费观看人在逋| 成人永久免费在线观看视频 | 在线 av 中文字幕| 99riav亚洲国产免费| 亚洲国产成人一精品久久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产在线观看jvid| 日日爽夜夜爽网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 少妇精品久久久久久久| 久久 成人 亚洲| a在线观看视频网站| 免费少妇av软件| 精品少妇内射三级| 久久九九热精品免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 欧美日韩视频精品一区| 两个人免费观看高清视频| 午夜福利影视在线免费观看| 99香蕉大伊视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| tocl精华| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 手机成人av网站| 操美女的视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男女床上黄色一级片免费看| 色老头精品视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲久久久国产精品| 在线观看66精品国产|