二甲雙胍聯(lián)合來曲唑改善子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的機(jī)制研究

程夢星, 張秋菊, 陳 雄, 陳琪珍

(上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 上海, 201900)

子宮內(nèi)膜癌作為婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病呈年輕化的趨勢[1]。目前，臨床上治療子宮內(nèi)膜癌主要采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療[2]。對于年輕的、有生育要求的、晚期復(fù)發(fā)的以及不宜接受手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌患者，可采用孕激素保守治療，即應(yīng)用醋酸甲羥孕酮(MPA)治療此類子宮內(nèi)膜癌患者[3]。研究[3]發(fā)現(xiàn)孕激素結(jié)合孕激素受體(PR)可延緩DNA及RNA的復(fù)制，降低雌激素受體(ER)表達(dá)，進(jìn)而減少子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化。然而，臨床上仍有約30%的子宮內(nèi)膜癌患者對孕激素治療無反應(yīng)，約47%的患者在首次孕激素治療后復(fù)發(fā)或發(fā)展為孕激素抵抗[4]。本課題組前期細(xì)胞研究[5]結(jié)果表明，外源性雌激素作用后可顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2/人源性長壽保障基因2(Nrf2/Lass2)的mRNA表達(dá)水平，且Lass2可介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素治療敏感性。本研究通過構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植模型，采用動物實驗證明Lass2介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的改善作用，為臨床上應(yīng)用來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌的孕激素耐藥性提供更多的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，儲存于上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室; Balb/c裸鼠40只，雌性, 6～8周齡，體質(zhì)量20～24 g, 購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，由上海市第一人民醫(yī)院動物中心喂養(yǎng); 二甲雙胍及MPA 購自Sigma公司，二甲雙胍、MPA均溶解于無菌的生理鹽水中; ER、PR、Nrf2、Lass2單克隆抗體均購自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含胎牛血清10%、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L的DMEM-F12培養(yǎng)基中，而后迅速置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)及傳代，細(xì)胞貼壁生長，采集對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)的實驗。

1.3 子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型的建立和處理

1.3.1 建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型: 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將40只雌性裸鼠隨機(jī)分為對照組和雌激素組，每組20只。雌激素組每只裸鼠接種后連續(xù)給予補(bǔ)佳樂0.05 mg(相當(dāng)于人類劑量2 mg/d, 溶于2 mL生理鹽水中)，灌胃1次/d。7 d后, 2組裸鼠均接種Ishikawa細(xì)胞，取對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶分解后配制成107/mL的單細(xì)胞懸液，在無菌條件下于裸鼠右腋處進(jìn)行皮下接種，每只裸鼠注射0.2 mL, 細(xì)胞計數(shù)約為2×106。注射7～10 d后，可見瘤體增長。

1.3.2 實驗分組與處理: 細(xì)胞接種后第14天，移植瘤的平均長徑為0.5～1.0 cm。遵循腫瘤體積與裸鼠質(zhì)量平衡的原則，將對照組和雌激素組的裸鼠再隨機(jī)分為4組，每組5只，即生理鹽水組、MPA組(MPA 100 mg/kg腹腔注射，每只裸鼠0.3 mL)、來曲唑聯(lián)合MPA組(來曲唑7 mg/kg, 每只裸鼠0.1mL, MPA劑量及用法同MPA組)、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組(二甲雙胍200 mg/kg灌胃給藥，每只裸鼠0.1 mL, 其他藥物用法同來曲唑聯(lián)合MPA組)。二甲雙胍和來曲唑均為灌胃給藥, 1次/d, 共給藥21次; MPA經(jīng)腹腔注射給藥，3次/周，共給藥9次; 生理鹽水組裸鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.4 觀察指標(biāo)

成瘤后，采用游標(biāo)卡尺對裸鼠進(jìn)行皮下腫瘤瘤體的長徑a(cm)和短徑b(cm)的測量并稱重，觀察裸鼠的行為。用藥3周后，對成瘤裸鼠進(jìn)行解剖，測量瘤體的體積，計算腫瘤抑制率。腫瘤體積(cm3)=a×b2×1/6×π。腫瘤抑制率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。以各組移植瘤瘤體的平均體積作為縱軸，用藥后的時間作為橫軸，繪制腫瘤的生長曲線。

末次給藥后30 min, 采取頸椎錯位法處死裸鼠，經(jīng)眼球采血，以3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 收集裸鼠血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶聯(lián)免疫夾心法檢測裸鼠血清雌激素及雌激素水平。

1.5 免疫組化法檢測腫瘤組織中ER、PR、Nrf2、Lass2的蛋白表達(dá)

采用免疫組化染色法，石蠟切片并常規(guī)脫蠟至水化，使用蒸餾水沖洗，而后PBS沖洗，配制1 L的檸檬酸修復(fù)液(一水合檸檬酸0.4 g和檸檬酸二鈉3 g), 調(diào)整pH值為6.0; 將切片放入修復(fù)液，采用高壓煮沸10 min, 使其自然狀態(tài)下降至室內(nèi)溫度, PBS沖洗3次，抗原修復(fù); 先用3%過氧化氫室溫孵育10 min, 再行PBS沖洗，再用10%山羊血清室溫封閉; 滴加適當(dāng)稀釋比例的一抗, 4 ℃孵育過夜(Nrf2抗體1∶100, Lass2抗體1∶200), 室溫孵育1 h, PBS緩沖液洗滌，滴加二抗，室溫孵育30 min, PBS洗滌，DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，干燥封片。顯微鏡下觀察并拍攝照片。隨機(jī)抽取各亞組中3份裸鼠腫瘤標(biāo)本，制成病理切片，并請病理科醫(yī)生讀片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠血清雌激素及孕激素比較

在雌激素組中，各亞組裸鼠用藥后，二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平低于MPA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中，各亞組裸鼠用藥后，二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平也低于MPA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雌激素組與對照組用藥后裸鼠血清雌激素及孕激素比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 雌激素組與對照組中各亞組裸鼠用藥后血清雌激素及孕激素比較 pmol/L

2.2 各亞組裸鼠移植瘤生長情況比較

從移植腫瘤開始，每天對移植部位進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤局部發(fā)紅，略有腫脹，腫瘤體積逐漸變大，腫瘤形狀為圓形或卵形，質(zhì)地堅硬。各亞組裸鼠在成瘤后，其前期運(yùn)動狀態(tài)無明顯變化; 成瘤晚期時，因腫瘤體積逐漸增大，裸鼠的運(yùn)動能力降低，但各亞組裸鼠的體質(zhì)量比較，差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各亞組裸鼠用藥前與用藥后的體質(zhì)量變化比較 g

2.3 來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌移植瘤孕激素敏感性

藥物治療21 d后，在雌激素組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為48.25%、67.97%、75.43%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為49.46%、69.97%、75.96%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各亞組裸鼠移植瘤體積及腫瘤抑制率比較

腫瘤生長曲線顯示，雌激素組與對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的腫瘤生長曲線斜率均小于生理鹽水組，其中二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組腫瘤生長速度最慢。見圖1。

2.4 免疫組化分析各亞組裸鼠移植瘤中ER、PR、Nrf2、Lass2蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，在雌激素組中，來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組中Nrf2、Lass2的表達(dá)低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。在雌激素組與對照組間，采取相同治療方式的亞組裸鼠移植瘤中的ER表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖3。在雌激素組和對照組中，來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的PR表達(dá)均高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

3 討 論

按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[6]，子宮內(nèi)膜癌的傳統(tǒng)外科治療方式為全子宮切除和雙附件切除，并按臨床分期進(jìn)行盆腔淋巴結(jié)清掃聯(lián)合腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃。研究[7]顯示，子宮內(nèi)膜癌的中位發(fā)病年齡為63歲，其中約30%的患者在絕經(jīng)前發(fā)病，而標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)療法不僅會導(dǎo)致年輕患者喪失生育能力，而且會使絕經(jīng)前女性喪失卵巢內(nèi)分泌功能，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。GARZON S等[8]研究表明，大劑量黃體酮可以作為早期子宮內(nèi)膜癌的一種保守療法，但臨床中仍有約30%的患者對孕激素治療不敏感。有關(guān)孕激素耐藥的研究較多，多與ER、PR的不同表達(dá)以及對藥物的敏感性有關(guān)[9-10], 而胰島素抵抗、肥胖等也可能與女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)異常有關(guān)[11], 從而影響了腫瘤的發(fā)展及藥物治療。

FERGUSON S E等[12]提出了子宮內(nèi)膜癌分型的概念，根據(jù)其與雌激素的關(guān)系，將子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型和非雌激素依賴型。來曲唑?qū)儆诜枷慊敢种苿梢种迫梭w內(nèi)雌激素的分泌，還能有效阻止由雌激素誘發(fā)的癌細(xì)胞增殖。王巧蓮等[13]研究表明，來曲唑可以明顯抑制子宮內(nèi)膜癌移植瘤的增長，但10 μg/d來曲唑的效果并不優(yōu)于1 μg/d來曲唑的效果，考慮是小劑量的來曲唑便能阻斷雌激素的產(chǎn)生[13]。本研究結(jié)果顯示，來曲唑聯(lián)合MPA組的腫瘤抑制率顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。Nrf2是抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，抗氧化反應(yīng)原件(ARE)與其結(jié)合后，可正向調(diào)控抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵基因等眾多下游基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。CHEN N等[14]認(rèn)為Nrf2具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用，并可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)和抗腫瘤藥物的氧化損害，并通過激活一系列的藥物代謝和抗凋亡基因來實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的放療。本課題組前期研究[5]結(jié)果提示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比, Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá); 增殖測定表明Nrf2/Lass2的過度表達(dá)導(dǎo)致孕激素抗性; 相反的，敲低Lass2則會增加細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞活力。此外，二甲雙胍可通過下調(diào)Nrf2/Lass2表達(dá)克服孕激素抵抗。

本研究結(jié)果顯示，來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA、來曲唑聯(lián)合MPA均可顯著抑制孕激素敏感的Ishikawa細(xì)胞移植瘤的生長(P<0.05); 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明，來曲唑聯(lián)合MPA治療后腫瘤組織孕激素耐藥相關(guān)因子Nrf2、Lass2在組織內(nèi)的表達(dá)顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。研究[15]證明芳香化酶抑制劑阿那曲唑可以抑制局部雌激素合成，其可能通過抑制編碼芳香化酶CYP19來實現(xiàn)，從而能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。有研究[16]表明，二甲雙胍可以改善子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對黃體酮的耐藥性，其機(jī)制是通過增加PR-β蛋白的表達(dá)來改善耐藥細(xì)胞對黃體酮的耐藥性。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 且腫瘤抑制率高于來曲唑聯(lián)合MPA組(P>0.05)。本研究免疫組化結(jié)果顯示，生理鹽水組腫瘤組織中Nrf2/Lass2的陽性表達(dá)顯著較少(P<0.05), 與腫瘤生長減慢的趨勢相同。Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌的耐藥中起著重要的調(diào)節(jié)作用，作者認(rèn)為其機(jī)制可能是來曲唑通過阻斷裸鼠體內(nèi)雌激素的合成而抑制子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的生長，同時來曲唑還能夠降低體內(nèi)雌激素的表達(dá)，降低腫瘤耐藥相關(guān)因子Nrf2/Lass2的表達(dá)。

研究[17]認(rèn)為PR陰性提示孕激素治療預(yù)后較差。16%～34%的年輕患者存在免疫組化錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺陷[18]。相較于正常錯配修復(fù)蛋白表達(dá)的患者，錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失者對孕激素治療的反應(yīng)較差[19]，這部分患者缺乏功能性PR的表達(dá)以及突變后腫瘤抑制基因缺失，進(jìn)而導(dǎo)致孕激素?zé)o法介導(dǎo)細(xì)胞分化、沉默及凋亡。本研究結(jié)果表明，來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 推測來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對PR陽性的患者更具治療價值。

綜上所述，來曲唑能夠有效改善人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的孕激素耐藥性，二甲雙胍可增強(qiáng)該反應(yīng)。來曲唑聯(lián)合二甲雙胍通過參與雌激素與Nrf2及其下游Lass2基因表達(dá)及功能之間的反饋調(diào)節(jié)，減少了Nrf2/Lass2的表達(dá)，從而增強(qiáng)了孕激素的敏感性。