• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    二甲雙胍聯(lián)合來曲唑改善子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的機(jī)制研究

    2022-11-11 03:41:12程夢星張秋菊陳琪珍
    實用臨床醫(yī)藥雜志 2022年20期
    關(guān)鍵詞:曲唑孕激素亞組

    程夢星, 張秋菊, 陳 雄, 陳琪珍

    (上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 上海, 201900)

    子宮內(nèi)膜癌作為婦科常見的惡性腫瘤,其發(fā)病呈年輕化的趨勢[1]。目前,臨床上治療子宮內(nèi)膜癌主要采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療[2]。對于年輕的、有生育要求的、晚期復(fù)發(fā)的以及不宜接受手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌患者,可采用孕激素保守治療,即應(yīng)用醋酸甲羥孕酮(MPA)治療此類子宮內(nèi)膜癌患者[3]。研究[3]發(fā)現(xiàn)孕激素結(jié)合孕激素受體(PR)可延緩DNA及RNA的復(fù)制,降低雌激素受體(ER)表達(dá),進(jìn)而減少子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化。然而,臨床上仍有約30%的子宮內(nèi)膜癌患者對孕激素治療無反應(yīng),約47%的患者在首次孕激素治療后復(fù)發(fā)或發(fā)展為孕激素抵抗[4]。本課題組前期細(xì)胞研究[5]結(jié)果表明,外源性雌激素作用后可顯著上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2/人源性長壽保障基因2(Nrf2/Lass2)的mRNA表達(dá)水平,且Lass2可介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素治療敏感性。本研究通過構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植模型,采用動物實驗證明Lass2介導(dǎo)Nrf2調(diào)控的子宮內(nèi)膜癌孕激素敏感性的改善作用,為臨床上應(yīng)用來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌的孕激素耐藥性提供更多的研究數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,儲存于上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室; Balb/c裸鼠40只,雌性, 6~8周齡,體質(zhì)量20~24 g, 購自上海西普爾-必凱實驗動物公司,由上海市第一人民醫(yī)院動物中心喂養(yǎng); 二甲雙胍及MPA 購自Sigma公司,二甲雙胍、MPA均溶解于無菌的生理鹽水中; ER、PR、Nrf2、Lass2單克隆抗體均購自Sigma公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    常規(guī)復(fù)蘇Ishikawa細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至含胎牛血清10%、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L的DMEM-F12培養(yǎng)基中,而后迅速置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)及傳代,細(xì)胞貼壁生長,采集對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)的實驗。

    1.3 子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型的建立和處理

    1.3.1 建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型: 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將40只雌性裸鼠隨機(jī)分為對照組和雌激素組,每組20只。雌激素組每只裸鼠接種后連續(xù)給予補(bǔ)佳樂0.05 mg(相當(dāng)于人類劑量2 mg/d, 溶于2 mL生理鹽水中),灌胃1次/d。7 d后, 2組裸鼠均接種Ishikawa細(xì)胞,取對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰蛋白酶分解后配制成107/mL的單細(xì)胞懸液,在無菌條件下于裸鼠右腋處進(jìn)行皮下接種,每只裸鼠注射0.2 mL, 細(xì)胞計數(shù)約為2×106。注射7~10 d后,可見瘤體增長。

    1.3.2 實驗分組與處理: 細(xì)胞接種后第14天,移植瘤的平均長徑為0.5~1.0 cm。遵循腫瘤體積與裸鼠質(zhì)量平衡的原則,將對照組和雌激素組的裸鼠再隨機(jī)分為4組,每組5只,即生理鹽水組、MPA組(MPA 100 mg/kg腹腔注射,每只裸鼠0.3 mL)、來曲唑聯(lián)合MPA組(來曲唑7 mg/kg, 每只裸鼠0.1mL, MPA劑量及用法同MPA組)、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組(二甲雙胍200 mg/kg灌胃給藥,每只裸鼠0.1 mL, 其他藥物用法同來曲唑聯(lián)合MPA組)。二甲雙胍和來曲唑均為灌胃給藥, 1次/d, 共給藥21次; MPA經(jīng)腹腔注射給藥,3次/周,共給藥9次; 生理鹽水組裸鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。

    1.4 觀察指標(biāo)

    成瘤后,采用游標(biāo)卡尺對裸鼠進(jìn)行皮下腫瘤瘤體的長徑a(cm)和短徑b(cm)的測量并稱重,觀察裸鼠的行為。用藥3周后,對成瘤裸鼠進(jìn)行解剖,測量瘤體的體積,計算腫瘤抑制率。腫瘤體積(cm3)=a×b2×1/6×π。腫瘤抑制率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。以各組移植瘤瘤體的平均體積作為縱軸,用藥后的時間作為橫軸,繪制腫瘤的生長曲線。

    末次給藥后30 min, 采取頸椎錯位法處死裸鼠,經(jīng)眼球采血,以3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 收集裸鼠血清,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用酶聯(lián)免疫夾心法檢測裸鼠血清雌激素及雌激素水平。

    1.5 免疫組化法檢測腫瘤組織中ER、PR、Nrf2、Lass2的蛋白表達(dá)

    采用免疫組化染色法,石蠟切片并常規(guī)脫蠟至水化,使用蒸餾水沖洗,而后PBS沖洗,配制1 L的檸檬酸修復(fù)液(一水合檸檬酸0.4 g和檸檬酸二鈉3 g), 調(diào)整pH值為6.0; 將切片放入修復(fù)液,采用高壓煮沸10 min, 使其自然狀態(tài)下降至室內(nèi)溫度, PBS沖洗3次,抗原修復(fù); 先用3%過氧化氫室溫孵育10 min, 再行PBS沖洗,再用10%山羊血清室溫封閉; 滴加適當(dāng)稀釋比例的一抗, 4 ℃孵育過夜(Nrf2抗體1∶100, Lass2抗體1∶200), 室溫孵育1 h, PBS緩沖液洗滌,滴加二抗,室溫孵育30 min, PBS洗滌,DAB顯色,蘇木紫復(fù)染,干燥封片。顯微鏡下觀察并拍攝照片。隨機(jī)抽取各亞組中3份裸鼠腫瘤標(biāo)本,制成病理切片,并請病理科醫(yī)生讀片。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 各組裸鼠血清雌激素及孕激素比較

    在雌激素組中,各亞組裸鼠用藥后,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平低于MPA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中,各亞組裸鼠用藥后,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組裸鼠血清雌激素水平也低于MPA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雌激素組與對照組用藥后裸鼠血清雌激素及孕激素比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 雌激素組與對照組中各亞組裸鼠用藥后血清雌激素及孕激素比較 pmol/L

    2.2 各亞組裸鼠移植瘤生長情況比較

    從移植腫瘤開始,每天對移植部位進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),腫瘤局部發(fā)紅,略有腫脹,腫瘤體積逐漸變大,腫瘤形狀為圓形或卵形,質(zhì)地堅硬。各亞組裸鼠在成瘤后,其前期運(yùn)動狀態(tài)無明顯變化; 成瘤晚期時,因腫瘤體積逐漸增大,裸鼠的運(yùn)動能力降低,但各亞組裸鼠的體質(zhì)量比較,差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 各亞組裸鼠用藥前與用藥后的體質(zhì)量變化比較 g

    2.3 來曲唑聯(lián)合二甲雙胍改善子宮內(nèi)膜癌移植瘤孕激素敏感性

    藥物治療21 d后,在雌激素組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為48.25%、67.97%、75.43%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組對Ishikawa細(xì)胞移植瘤生長抑制率分別為49.46%、69.97%、75.96%, 與生理鹽水組0%的腫瘤抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    表3 各亞組裸鼠移植瘤體積及腫瘤抑制率比較

    腫瘤生長曲線顯示,雌激素組與對照組中, MPA組、來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的腫瘤生長曲線斜率均小于生理鹽水組,其中二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組腫瘤生長速度最慢。見圖1。

    2.4 免疫組化分析各亞組裸鼠移植瘤中ER、PR、Nrf2、Lass2蛋白表達(dá)

    免疫組化結(jié)果顯示,在雌激素組中,來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組中Nrf2、Lass2的表達(dá)低于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。在雌激素組與對照組間,采取相同治療方式的亞組裸鼠移植瘤中的ER表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖3。在雌激素組和對照組中,來曲唑聯(lián)合MPA組、二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA組的PR表達(dá)均高于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

    3 討 論

    按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[6],子宮內(nèi)膜癌的傳統(tǒng)外科治療方式為全子宮切除和雙附件切除,并按臨床分期進(jìn)行盆腔淋巴結(jié)清掃聯(lián)合腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃。研究[7]顯示,子宮內(nèi)膜癌的中位發(fā)病年齡為63歲,其中約30%的患者在絕經(jīng)前發(fā)病,而標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)療法不僅會導(dǎo)致年輕患者喪失生育能力,而且會使絕經(jīng)前女性喪失卵巢內(nèi)分泌功能,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。GARZON S等[8]研究表明,大劑量黃體酮可以作為早期子宮內(nèi)膜癌的一種保守療法,但臨床中仍有約30%的患者對孕激素治療不敏感。有關(guān)孕激素耐藥的研究較多,多與ER、PR的不同表達(dá)以及對藥物的敏感性有關(guān)[9-10], 而胰島素抵抗、肥胖等也可能與女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)異常有關(guān)[11], 從而影響了腫瘤的發(fā)展及藥物治療。

    FERGUSON S E等[12]提出了子宮內(nèi)膜癌分型的概念,根據(jù)其與雌激素的關(guān)系,將子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型和非雌激素依賴型。來曲唑?qū)儆诜枷慊敢种苿梢种迫梭w內(nèi)雌激素的分泌,還能有效阻止由雌激素誘發(fā)的癌細(xì)胞增殖。王巧蓮等[13]研究表明,來曲唑可以明顯抑制子宮內(nèi)膜癌移植瘤的增長,但10 μg/d來曲唑的效果并不優(yōu)于1 μg/d來曲唑的效果,考慮是小劑量的來曲唑便能阻斷雌激素的產(chǎn)生[13]。本研究結(jié)果顯示,來曲唑聯(lián)合MPA組的腫瘤抑制率顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。Nrf2是抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子,抗氧化反應(yīng)原件(ARE)與其結(jié)合后,可正向調(diào)控抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵基因等眾多下游基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。CHEN N等[14]認(rèn)為Nrf2具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用,并可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)和抗腫瘤藥物的氧化損害,并通過激活一系列的藥物代謝和抗凋亡基因來實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的放療。本課題組前期研究[5]結(jié)果提示,與正常子宮內(nèi)膜組織相比, Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá); 增殖測定表明Nrf2/Lass2的過度表達(dá)導(dǎo)致孕激素抗性; 相反的,敲低Lass2則會增加細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞活力。此外,二甲雙胍可通過下調(diào)Nrf2/Lass2表達(dá)克服孕激素抵抗。

    本研究結(jié)果顯示,來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA、來曲唑聯(lián)合MPA均可顯著抑制孕激素敏感的Ishikawa細(xì)胞移植瘤的生長(P<0.05); 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明,來曲唑聯(lián)合MPA治療后腫瘤組織孕激素耐藥相關(guān)因子Nrf2、Lass2在組織內(nèi)的表達(dá)顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。研究[15]證明芳香化酶抑制劑阿那曲唑可以抑制局部雌激素合成,其可能通過抑制編碼芳香化酶CYP19來實現(xiàn),從而能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。有研究[16]表明,二甲雙胍可以改善子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對黃體酮的耐藥性,其機(jī)制是通過增加PR-β蛋白的表達(dá)來改善耐藥細(xì)胞對黃體酮的耐藥性。本研究結(jié)果表明,二甲雙胍聯(lián)合來曲唑及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 且腫瘤抑制率高于來曲唑聯(lián)合MPA組(P>0.05)。本研究免疫組化結(jié)果顯示,生理鹽水組腫瘤組織中Nrf2/Lass2的陽性表達(dá)顯著較少(P<0.05), 與腫瘤生長減慢的趨勢相同。Nrf2/Lass2在子宮內(nèi)膜癌的耐藥中起著重要的調(diào)節(jié)作用,作者認(rèn)為其機(jī)制可能是來曲唑通過阻斷裸鼠體內(nèi)雌激素的合成而抑制子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的生長,同時來曲唑還能夠降低體內(nèi)雌激素的表達(dá),降低腫瘤耐藥相關(guān)因子Nrf2/Lass2的表達(dá)。

    研究[17]認(rèn)為PR陰性提示孕激素治療預(yù)后較差。16%~34%的年輕患者存在免疫組化錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺陷[18]。相較于正常錯配修復(fù)蛋白表達(dá)的患者,錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失者對孕激素治療的反應(yīng)較差[19],這部分患者缺乏功能性PR的表達(dá)以及突變后腫瘤抑制基因缺失,進(jìn)而導(dǎo)致孕激素?zé)o法介導(dǎo)細(xì)胞分化、沉默及凋亡。本研究結(jié)果表明,來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對孕激素敏感性Ishikawa細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05), 推測來曲唑聯(lián)合二甲雙胍及MPA對PR陽性的患者更具治療價值。

    綜上所述,來曲唑能夠有效改善人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的孕激素耐藥性,二甲雙胍可增強(qiáng)該反應(yīng)。來曲唑聯(lián)合二甲雙胍通過參與雌激素與Nrf2及其下游Lass2基因表達(dá)及功能之間的反饋調(diào)節(jié),減少了Nrf2/Lass2的表達(dá),從而增強(qiáng)了孕激素的敏感性。

    猜你喜歡
    曲唑孕激素亞組
    基于Meta分析的黃酮類化合物對奶牛生產(chǎn)性能和血清免疫指標(biāo)影響的研究
    慢性阻塞性肺疾病患者膈肌移動度分析
    槭葉鐵線蓮亞組的研究進(jìn)展
    園林科技(2021年3期)2022-01-19 03:17:32
    冠心病患者腸道菌群變化的研究 (正文見第45 頁)
    保胎藥須小心服
    脈血康膠囊聯(lián)合雌孕激素治療血瘀型原因不明的月經(jīng)過少
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:31
    來曲唑灌胃后EM大鼠病灶體積及COX-2 mRNA、survivin蛋白表達(dá)變化
    雌、孕激素水平檢測與過期妊娠分娩發(fā)動的關(guān)系
    來曲唑治療多囊卵巢綜合癥臨床研究
    來曲唑或氯米芬聯(lián)合人絕經(jīng)期促性腺激素用于PCOS婦女促排卵療效的比較
    下体分泌物呈黄色| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲天堂av无毛| 夫妻午夜视频| 一区二区三区免费毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲三级黄色毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 高清av免费在线| 插阴视频在线观看视频| 18禁观看日本| 国产男女超爽视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一级a做视频免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲无线观看免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 一级a做视频免费观看| 女性被躁到高潮视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 少妇高潮的动态图| 一区二区av电影网| 性色avwww在线观看| 老熟女久久久| 插逼视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲av成人精品一区久久| 国产av精品麻豆| 亚洲美女视频黄频| 性色avwww在线观看| 国产乱人偷精品视频| av有码第一页| 最近最新中文字幕免费大全7| 99久久综合免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看 | 18在线观看网站| 一本色道久久久久久精品综合| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品国产三级国产专区5o| 考比视频在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 99热网站在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲成色77777| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久久精品精品| 欧美成人午夜免费资源| 在线天堂最新版资源| 亚洲综合色惰| 老司机影院成人| 国产成人精品一,二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 99热网站在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美日韩在线观看h| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品夜色国产| 国产精品99久久久久久久久| 男人操女人黄网站| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜av观看不卡| 黄片播放在线免费| 亚洲精品一区蜜桃| 男女免费视频国产| 免费av中文字幕在线| av女优亚洲男人天堂| 亚洲第一av免费看| 男女边摸边吃奶| 欧美另类一区| 99热6这里只有精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本色播在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 老司机影院毛片| 亚洲av男天堂| 午夜激情av网站| 国产av一区二区精品久久| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美另类一区| 三上悠亚av全集在线观看| videosex国产| 精品午夜福利在线看| 国产片特级美女逼逼视频| 精品一区二区三卡| 伊人亚洲综合成人网| 少妇的逼好多水| 午夜激情av网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本av免费视频播放| 亚洲情色 制服丝袜| 另类精品久久| 老司机影院毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 一本久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日韩精品有码人妻一区| 午夜老司机福利剧场| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久国产精品麻豆| 一区二区av电影网| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日日爽夜夜爽网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产综合精华液| 特大巨黑吊av在线直播| 九九在线视频观看精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 天堂中文最新版在线下载| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产亚洲精品久久久com| 精品人妻在线不人妻| 国产极品天堂在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲美女搞黄在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久 成人 亚洲| 国产乱人偷精品视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 黑人猛操日本美女一级片| 在线观看www视频免费| 五月开心婷婷网| 少妇人妻久久综合中文| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲国产av新网站| 在现免费观看毛片| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产av新网站| 麻豆乱淫一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久久国产一区二区| 国产成人aa在线观看| 午夜福利,免费看| 国产精品无大码| 在线观看免费高清a一片| 午夜激情福利司机影院| videosex国产| av天堂久久9| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久久视频综合| 少妇 在线观看| 亚洲久久久国产精品| 亚洲美女视频黄频| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 视频区图区小说| 热99国产精品久久久久久7| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲av.av天堂| 丝袜脚勾引网站| 国产在线视频一区二区| 在线观看三级黄色| 婷婷成人精品国产| 欧美xxⅹ黑人| xxxhd国产人妻xxx| 欧美精品高潮呻吟av久久| 18在线观看网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 爱豆传媒免费全集在线观看| 飞空精品影院首页| av网站免费在线观看视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲人成网站在线播| 永久网站在线| 美女福利国产在线| 久久久精品免费免费高清| 亚洲美女黄色视频免费看| 美女内射精品一级片tv| 97超碰精品成人国产| 人人妻人人澡人人看| 日韩亚洲欧美综合| 伦理电影大哥的女人| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产69精品久久久久777片| 老司机影院毛片| 精品一区在线观看国产| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av日韩在线播放| 中国国产av一级| 高清在线视频一区二区三区| 成人手机av| 国产精品久久久久成人av| 在线播放无遮挡| 国产一区二区在线观看av| 女性被躁到高潮视频| 亚洲在久久综合| 99热网站在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 自线自在国产av| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲成人手机| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产男人的电影天堂91| 性色av一级| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 在线观看免费视频网站a站| 又大又黄又爽视频免费| 国产乱来视频区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费大片18禁| 欧美97在线视频| 日本午夜av视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 观看美女的网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久影院123| 涩涩av久久男人的天堂| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本黄色片子视频| 美女大奶头黄色视频| 男男h啪啪无遮挡| 久久久欧美国产精品| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品456在线播放app| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久 成人 亚洲| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲av福利一区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 婷婷色麻豆天堂久久| 一级毛片我不卡| 麻豆成人av视频| 大码成人一级视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 九九在线视频观看精品| 国产精品久久久久久av不卡| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久国产一区二区| 高清毛片免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩免费高清中文字幕av| 伦精品一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲图色成人| 久久精品国产自在天天线| 最近2019中文字幕mv第一页| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲天堂av无毛| 简卡轻食公司| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久 成人 亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产片内射在线| 涩涩av久久男人的天堂| 最新中文字幕久久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 我的老师免费观看完整版| 国产av国产精品国产| 考比视频在线观看| 国产精品三级大全| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲图色成人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 少妇人妻精品综合一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲在久久综合| 91久久精品国产一区二区三区| 日本欧美视频一区| 亚洲av成人精品一二三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 伦精品一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美 日韩 精品 国产| 久久99精品国语久久久| 亚洲精品第二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 成人免费观看视频高清| 日日爽夜夜爽网站| 国产成人精品福利久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲国产精品999| 一级毛片电影观看| 少妇的逼水好多| 亚洲av福利一区| 老女人水多毛片| 最新中文字幕久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本av免费视频播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| freevideosex欧美| a级毛色黄片| 22中文网久久字幕| 少妇 在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一级毛片我不卡| 亚洲成色77777| av国产精品久久久久影院| 午夜福利,免费看| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品不卡视频一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲精品一二三| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 考比视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜视频国产福利| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品一二三| 国产视频首页在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久欧美国产精品| 丰满乱子伦码专区| 成人午夜精彩视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 考比视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日本黄色日本黄色录像| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产在线视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 一个人看视频在线观看www免费| 青青草视频在线视频观看| 国产成人一区二区在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美成人精品一区二区| 综合色丁香网| av有码第一页| 日韩欧美精品免费久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 在现免费观看毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品夜色国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产一区二区三区av在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产极品天堂在线| 国产一级毛片在线| 亚洲天堂av无毛| 久久久久久久大尺度免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看人妻少妇| 九色成人免费人妻av| 免费人成在线观看视频色| 久久久国产一区二区| 秋霞伦理黄片| 国产高清国产精品国产三级| 91精品三级在线观看| 色视频在线一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品.久久久| 久久午夜福利片| 免费高清在线观看日韩| 日本欧美国产在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 老女人水多毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久狼人影院| 伦理电影免费视频| 高清视频免费观看一区二区| av在线播放精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜老司机福利剧场| 永久网站在线| 免费黄色在线免费观看| 免费观看a级毛片全部| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品国产自在天天线| 国产深夜福利视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 天天影视国产精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 美女中出高潮动态图| 国产国语露脸激情在线看| 久久 成人 亚洲| 天美传媒精品一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产视频内射| 免费大片黄手机在线观看| 国产成人91sexporn| 在线观看www视频免费| 免费观看av网站的网址| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产日韩欧美亚洲二区| 一区二区三区精品91| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 高清黄色对白视频在线免费看| 丝袜美足系列| 国产成人一区二区在线| 日韩大片免费观看网站| 另类精品久久| 成人毛片60女人毛片免费| 国产片内射在线| 日本91视频免费播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av专区在线播放| 一区二区av电影网| 国产视频内射| 亚洲精品aⅴ在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线观看一区二区三区激情| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 高清不卡的av网站| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品 国内视频| av卡一久久| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久蜜臀av无| 18禁观看日本| 国产精品国产三级专区第一集| 999精品在线视频| 黑丝袜美女国产一区| 一区二区三区乱码不卡18| 高清黄色对白视频在线免费看| 少妇熟女欧美另类| av福利片在线| 精品久久久噜噜| 久久午夜综合久久蜜桃| av有码第一页| 国产免费一区二区三区四区乱码| 中文天堂在线官网| 丝袜在线中文字幕| 爱豆传媒免费全集在线观看| 97超碰精品成人国产| 91久久精品国产一区二区成人| 免费观看av网站的网址| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产国语对白av| 中文天堂在线官网| 国产av码专区亚洲av| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 九九爱精品视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 伦精品一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品蜜桃在线观看| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产精品999| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产一级毛片在线| 亚洲精品色激情综合| 熟女av电影| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久热久热在线精品观看| xxx大片免费视频| 麻豆成人av视频| av电影中文网址| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美成人午夜免费资源| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 制服诱惑二区| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品久久午夜乱码| 日本黄大片高清| 婷婷色av中文字幕| av免费在线看不卡| 久久av网站| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 中文字幕最新亚洲高清| 最近中文字幕2019免费版| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品人妻在线不人妻| 久久 成人 亚洲| 男的添女的下面高潮视频| 美女视频免费永久观看网站| 在线观看三级黄色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲国产色片| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美性感艳星| 国产av码专区亚洲av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久久久久久大av| 熟女av电影| 午夜福利影视在线免费观看| av播播在线观看一区| 午夜福利视频在线观看免费| 国产成人av激情在线播放 | 欧美精品国产亚洲| 九草在线视频观看| 国产 精品1| 久久精品国产自在天天线| 日韩视频在线欧美| 久久 成人 亚洲| 久久热精品热| 久久精品国产a三级三级三级| 国产片内射在线| 国产av精品麻豆| 性色av一级| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费看光身美女| 免费日韩欧美在线观看| 最黄视频免费看| 久热这里只有精品99| 美女内射精品一级片tv| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线观看人妻少妇| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 中文字幕免费在线视频6| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲成人av在线免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 十分钟在线观看高清视频www| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费日韩欧美在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 最后的刺客免费高清国语| 免费高清在线观看视频在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产黄片视频在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| av天堂久久9| 成年美女黄网站色视频大全免费 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 简卡轻食公司| 日本vs欧美在线观看视频| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品日本国产第一区| 少妇人妻 视频| 国产不卡av网站在线观看| 精品久久久精品久久久| 成人黄色视频免费在线看| 精品一品国产午夜福利视频| 午夜91福利影院| 制服诱惑二区| 久热这里只有精品99| 性色avwww在线观看| 日本午夜av视频| 赤兔流量卡办理| 婷婷色综合www| 欧美bdsm另类| 久久毛片免费看一区二区三区| 一本久久精品| 看非洲黑人一级黄片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 我要看黄色一级片免费的| 少妇丰满av| 久久久欧美国产精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 制服丝袜香蕉在线| 国产亚洲一区二区精品| 婷婷色av中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 涩涩av久久男人的天堂| 国产一区亚洲一区在线观看| 尾随美女入室| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品,欧美精品| av在线老鸭窝|