分光光度法測定牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度評定

楊美豐，紀坤發(fā)，何 瑛，楊愛君

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 511356

0 引言

牛乳含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素以及礦物質等營養(yǎng)元素，不但可以很好地維持人體的健康水平，而且在預防各種慢性疾病方面也有一定地食療作用[1，2]，深受消費者的喜愛。

但牛乳的質量安全問題也一直是消費者關注的焦點。一般情況下，牛乳中會含有微量的亞硝酸鹽，其可被人體正常代謝而不會產(chǎn)生傷害。但在奶牛場水質、飼料、環(huán)境受到污染的情況下，牛乳中的亞硝酸鹽含量會出現(xiàn)超標問題。超標的亞硝酸鹽可能會使人體內的血紅蛋白發(fā)生異常而損害人體健康，甚至會在體內轉換成致癌性的亞硝胺[3]。因此，牛乳中亞硝酸鹽含量的準確檢測極其重要。

本試驗通過《GB 5009.33—2016 食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[1]中的第二法分光光度法對乳中亞硝酸鹽含量進行測定，并參照《JJF 1059.1—2012 測量不確定度評定與表示》[4]和《CNAS-CL006-2019 化學分析中不確定度的評估指南》[5]的要求對試驗過程中的不確定度進行分析，得到試驗過程中測量不確定度的主要來源，為日常檢測牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度評定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 樣品

生乳：來自廣東、福建、甘肅等地的奶牛場。

1.1.2 試驗試劑

亞硝酸鈉溶液標準物質（200 μg/mL），北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；亞鐵氰化鉀溶液（150 g/L)、乙酸鋅溶液（220 g/L）、飽和硼砂溶液（50 g/L）、鹽酸（20%），廣州化學試劑廠；對氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），國藥集團化學試劑有限公司；水為一級水。

1.1.3 標準物質配制

亞硝酸鈉標準儲備液（40 mg/L）：吸取10 mL亞硝酸鈉溶液標準物質于50 mL容量瓶，用水定容，混勻后放于4 ℃避光保存。

亞硝酸鈉標準使用液（5 mg/L）：吸取亞硝酸鈉標準儲備液3.125 mL于25 mL容量瓶，用水定容，搖勻。

1.1.4 儀器設備

紫外可見分光光度計(UV-1800)，島津中國；冷凍離心機，德國Sigma公司；電磁爐，九陽股份有限公司；振蕩水浴箱，德國Julabo公司；電冰箱，西門子公司；超純水系統(tǒng)，德國Millipore公司；移液器、容量瓶，德國Brand公司；渦旋振蕩器，廣州海太公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

吸取樣品18 mL放于50 mL離心管，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，渦旋振蕩器混勻后再加入70 ℃左右的水12 mL，繼續(xù)混勻后在95 ℃水中加熱15 min，取出放置至室溫后加入亞鐵氰化鉀溶液1 mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液1 mL，搖勻，以沉淀蛋白質，最后加5.5 mL水定容至40 mL。放置沉淀2 h后離心（9 000 r/min，3 min），過濾，濾液備用。

1.2.2 測定

吸取4 mL樣品于10 mL比色管，另外吸取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150μL、180 μL亞硝酸鈉標準使用液于10 mL比色管，相當于0.075 μg、0.15 μg、0.3 μg、0.45 μg、0.6 μg、0.75 μg、0.9 μg亞硝酸鈉，加入對氨基苯磺酸溶液0.6 mL，在渦旋振蕩器上混勻后靜置3～5 min，再加入鹽酸萘乙二胺溶液0.3 mL，加水定容至10 mL刻度線，再次搖勻勻，靜置15 min用零號管調節(jié)零點，于538 nm的波長測定吸光度，繪制的標準曲線作比較，同時做試劑空白。

2 結果與分析

2.1 數(shù)學模型和測量不確定度來源分析

2.1.1 數(shù)學模型

根據(jù)GB 5009.33—2016[6]中的第二法分光度度法計算亞硝酸鹽（以NaNa2計）含量的公式，可得出評定牛乳中亞硝酸鈉含量的測量不確定度的數(shù)學模型為:

公式中：X為樣品中亞硝酸鈉含量，mg/kg；C為曲線得出亞硝酸鹽的濃度，mg/L；m為樣品質量（18 mL×ρ樣品），g；V0-試樣處理液總體積，40 mL；V1-測定樣液定容體積，10 mL；V2-測定樣液體積，4 mL；1000為換算系數(shù)。

2.1.2 測量不確定度來源分析

根據(jù)亞硝酸鹽含量的檢測步驟及輸入量的函數(shù)關系可以發(fā)現(xiàn)，測量不確定度分量主要來源為：（1）紫外分光光度計引入的不確定度；（2）取樣量引入的不確定度；（3）試樣處理液總體積引入的不確定度；（4）測定樣液定容體積引入的不確定度；（5）測定樣液體積引入的不確定度；（6）制備標準工作液引入的不確定度；（7）樣品重復性引入的不確定度。

亞硝酸鹽含量的測量不確定度分類見表1和不確定度因果關系見圖1。

表1 亞硝酸鹽含量的測量不確定度來源及分類

圖1 測量不確定因果關系圖

2.2 亞硝酸鹽含量測量不確定度分量的量化

2.2.1 紫外可見分光光度計影響因子的不確定度

樣品經(jīng)前處理提取離心定容后，使用紫外可見分光光度計在538 nm波長處進行測定時，所用儀器的的穩(wěn)定性、靈敏度等會影響測量結果的不確定度，根據(jù)紫外可見分光光度計校準證書（校準證書編號NW202105138）中給出U=0.4 nm，k=2，可以計算出儀器的標準不確定度u為：

將紫外可見分光光度計影響因子分量轉化為相對標準不確定度urelnm()為：

2.2.2 吸樣量的不確定度

由制造商提供的10 mL可調移液器校準證書（校準證書編號BSH-CL-2020080029-5）中標明其容量相對誤差測量結果擴展不確定度（k=2）為5 μL，因此10 mL可調移液器的標準不確定度為：

18 mL的樣品分兩次吸取，即吸樣量引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 試樣處理液總體積的不確定度

吸取樣品18 mL放于50 mL離心管，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，渦旋振蕩器混勻后再加入70 ℃左右的水12 mL，繼續(xù)混勻后在95 ℃水中加熱15 min，取出放置至室溫后加入亞鐵氰化鉀溶液1 mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液1 mL，搖勻，以沉淀蛋白質，最后加5.5 mL水定容至40 mL。

2.2.3.1 由2.2.2中可知urelm()=0.00039

2.2.3.2 由制造商提供的5 mL可調移液器校準證書（校準證書編號BSH-CL-2020080029-4）中標明其容量相對誤差測量結果擴展不確定度（k=2）為4.3 μL，其標準不確定度為

5 mL可調移液器引入的相對標準不確定為：

2.2.3.3 由制造商提供的A級25 mL分度吸量管校準證書（校準證書編BSH-CL-2020070020-1M）中標明其容量相對誤差測量結果擴展不確定度（k=2）為0.02 mL，因此25 mL分度吸量管的標準不確定度為：

即25 mL分度吸量管相對標準不確定度為：

2.2.3.4 由制造商提供的1 mL可調移液器校準證書（校準證書編號BSH-CL-2020080029-3）標明其容量相對誤差測量結果擴展不確定度（k=2）為1.3 μL，其標準不確定度為

由于加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液時使用了2次1 mL可調移液器，因此1 mL可調移液器引入的相對標準不確定為：

2.2.3.5 由2.2.2可知10 mL可調移液器的標準不確定度u=2.5μL ，其引入的相對標準不確定為：

2.2.3.6 合成上述五項相對標準不確定度，可得試樣處理液總體積的相對標準不確定度

2.2.4 測定樣液定容體積的不確定度

①校準引入的不確定度：根據(jù)《JJG 10—2005 專用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]，10 mL比色管容量允許誤差為±0.10 mL，按照矩形分布可得10 mL比色管校準產(chǎn)生的標準不確定度為

②溫度引入的不確定度：玻璃器皿校準時的溫度為20 ℃，而試驗室的溫度控制在（20±4）℃之間，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[8]，玻璃的膨脹系數(shù)忽略不計，按照矩形分布可得標準不確定度：

合成上述2項不確定度分量，則測定樣液定容體積的標準不確定度

因此，10 mL比色管的相對標準不確定度為：

2.2.5 測定樣液體積的不確定度

由2.2.3.2中可知5 mL可調移液器的標準不確定度u=2.15μL，其相對標準不確定為：

2.2.6 制備標準工作溶液的不確定度

2.2.6.1 標準物質溶液引入的不確定度

試驗中所用的亞硝酸鈉溶液標準物質濃度為200 μg/mL，由北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司提供，GBW（E）100156國家標準物質證書，批號為84G1，證書上標明食品檢測用亞硝酸鈉溶液標準物質的相對擴展不確定度（k=2）為2%，則相對標準不確定為

2.2.6.2 稀釋配制過程容量瓶引入的不確定度

25 mL容量瓶（A級）和50 mL容量瓶（A級）引入的不確定度，其有校準和溫度兩種影響因素

①校準：由制造商提供的25 mL容量瓶（A級）和50 mL容量瓶（A級）校準證書（校準證書編號BSH-CL-2020070020-3）中標明其在20 ℃下的擴展不確定度（k=2）都為U=0.02 mL，按照矩形分布，計算其標準不確定度

②溫度：根據(jù)證書信息，該容量瓶在20 ℃校準，而試驗室的溫度控制在（20±4）℃之間，根據(jù)JJG 196—2006規(guī)定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[8]，按照矩形分布可得25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的標準不確定度分別為：

由上述兩種分量可得使用25 mL容量瓶和50 mL容量瓶時引入的標準不確定度分別為：

因此，25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的相對標準不確定度分別為：

2.2.6.3 稀釋配制過程移液器引入的不確定度

由2.2.2可知10 mL可調移液器的標準不確定度為u10mL移=2.5μL ，其相對標準不確定度為:

由2.2.3.2可得5 mL可調移液器的標準不確定度為u5mL移=2.15μL ，其相對標準不確定度為:

由 制 造 商 提 供 的1 0 0 μ L和2 0 0 μ L可調移液器校準證書（校準證書編號B S HC L-2 0 2 0 0 8 0 0 2 9-1和校準證書編號B S HCL-2020080029-2）標明容量相對誤差測量結果擴展不確定度（k=2）分別為0.09 μL和0.40 μL，其標準不確定度分別為

表2 可調移液器引入的相對標準不確定度

2.2.6.4 稀釋配制過程比色管引入的不確定度

由2.2.4可知10 mL比色管的相對標準不確定度為 urelV1()=0.0058

2.2.6.5 配制標準儲備液引入的不確定度

用10 mL可調移液器吸取10 mL 200 μg/mL亞硝酸鈉溶液標準物質于50 mL容量瓶（A級），用水定容，混勻后可得40 mg/L亞硝酸鈉標準儲備液，則40 mg/L亞硝酸鈉標準儲備液的相對標準不確定度：

2.2.6.6 配制標準使用液引入的不確定度

用5 mL可調移液器吸取3.125 mL 200 μg/mL亞硝酸鈉標準儲備液于25 mL容量瓶（A級），用水定容，混勻后可得5 mg/L亞硝酸鈉標準使用液，則5 mg/L亞硝酸鹽標準使用液的相對標準不確定度：

2.2.6.7 配制標準工作溶液引入的不確定度

用100 μL和200 μL可調移液器分別移取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL亞硝酸鈉標準使用液于10 mL比色管，相當于0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L亞硝酸鈉。則0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L的亞硝酸鈉標準曲線系列點的相對標準不確定度分別見公式1。

綜上所述，標準工作溶液引入的不確定度由標準工作溶液各個系列點的相對標準不確定度方根求得，即：

2.2.7 樣品重復性的不確定度

將同一份生乳樣品做6個平行樣進行重復性測定，試驗所得回歸方程為y=0.7948x-0.0005，相關系數(shù)R2為0.99994。計算出生乳中亞硝酸鈉的平均含量及標準偏差，結果如下表3所示：

表3 乳中亞硝酸鈉的重復性試驗（n=6）

所以重復性（Rep）引入的相對標準不確定度為：

2.3 合成相對標準不確定度

該方法測定牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度來源匯總如表4所示。

表4 牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度來源匯總

合成的相對標準不確定度為：

即標準不確定度為：

2.4 亞硝酸鹽含量擴展不確定度

分光光度法測定牛乳中亞硝酸鹽含量的擴展不確定度，當取置信度為95%，包含因子為k=2時，擴展不確定度為

3 結論

分光光度計測定牛乳中亞硝酸鹽含量的測量不確定度報告，取置信度為95%，包含因子k=2時，報告結果為

通過此次分光光度法測定牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度評定分析可得，檢測結果的不確定度來源最主要是標準工作溶液引入的不確定度，試樣處理液總體積、測定樣液定容體積和樣品重復性的影響次之，而儀器影響因子、樣品取樣量和測定樣液體積帶來的影響與前幾者相比，可以忽略不計。因此，在使用分光光度計測定牛乳中亞硝酸鹽時，需使用有證標準物，可增加平行樣的測定次數(shù)，使用精密度更高的玻璃器皿，試驗設備也需要定時計量，減少不確定度，提高檢測結果的準確度。