內(nèi)生真菌對藤茶二氫楊梅素和楊梅素積累的影響

周防震，龔琪雯，周 志1,，陳夢潔，湯克立

1. 硒食品營養(yǎng)與健康智能技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北 恩施 445000；2. 湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000

藤茶（Amepelopsis grossedentata），是葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物，是一種非常古老的中草藥資源、類茶植物資源和藥食兩用植物資源[1]。二氫楊梅素是藤茶的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗突變、止咳、化痰和抗菌等多種生理活性[2]。研究顯示，藤茶幼嫩莖葉中二氫楊梅素含量可以高達(dá)30%以上，但其合成積累的機(jī)制尚不清楚。

許多研究已經(jīng)觀察到內(nèi)生真菌與植物次生代謝成分的聯(lián)系，指出內(nèi)生真菌能夠直接或間接地影響植物的次生代謝過程，引起植物的次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化[3]。目前國內(nèi)外有關(guān)植物內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究較多，但藤茶內(nèi)生真菌對其主要次生代謝產(chǎn)物二氫楊梅素積累的影響方面的研究尚未見報道。本試驗(yàn)從內(nèi)生真菌的角度探討了內(nèi)生真菌對藤茶二氫楊梅素和楊梅素積累的影響，以期為揭示藤茶次生代謝產(chǎn)物二氫楊梅素的合成機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶成熟漿果和待分離內(nèi)生真菌的藤茶葉片樣本分別于2019年9月和10月采集于恩施市七里坪藤茶基地。引物ITS 1（5'-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3'）和 ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。改良馬丁培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基）購于杭州微生物試劑有限公司；NaClO購于武漢市中天化工有限責(zé)任公司；Taq DNA聚合酶購于TAKARA公司；二氫楊梅素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC，＞99%）購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑購于國藥集團(tuán)。

1.2 主要儀器

ABI-2720 PCR擴(kuò)增儀，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)，TECAN Infinite-M200多功能酶標(biāo)儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藤茶內(nèi)生真菌的分離

用無菌水將藤茶葉片表面沖洗干凈，用75%的酒精浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗3次。將藤茶葉片接種到PDA培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。挑取菌絲接種到改良馬丁培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于分離培養(yǎng)基平板，得到藤茶葉源優(yōu)勢內(nèi)生真菌的純培養(yǎng)體。

1.3.2 內(nèi)生真菌的基因組提取

稱取少量的菌絲體（約0.04 g）；加入0.5 mL1.5 %（w/v）CTAB抽提液在預(yù)冷研缽中充分研磨；將研磨液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，立即置于65℃水浴10 min；加入200 μL乙酸銨（10 M），冰浴8 min；12000 r/min離心10 min；吸取上層水相至另一1.5 mL離心管中，加入0.5～ 0.6倍體積的冰預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置15 min；12000 r/min離心15 min，棄上清，75%乙醇洗滌兩次，自然晾干，加入適量ddH2O，放入-20℃冰箱保存，待用。

1.3.3 ITS序列擴(kuò)增

取2 mLEppendorf管，在其中添加以下各種反應(yīng)液：ddH2O 7 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（含dNTP混合物）10 μL、總體積20 μL；PCR擴(kuò)增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 30 S，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司進(jìn)行ITS序列測定。

1.3.4 藤茶實(shí)生苗繁育及移栽

將藤茶種子按常規(guī)方法育苗，待實(shí)生苗長度在4 ～ 7 cm時移入大田，5周后進(jìn)行內(nèi)生真菌處理；晴天早晚各澆水1次。

1.3.5 內(nèi)生真菌孢子懸液的制備及田間試驗(yàn)

血球計數(shù)板計數(shù)后，將內(nèi)生真菌孢子懸液調(diào)整為高、低濃度兩組，其濃度分別為5.16×106CFU/mL和2.58×106CFU/mL。藤茶實(shí)生苗共分9個處理，分別為生理鹽水對照組、高/低濃度葉面噴施組、高/低濃度根際灌施組、高/低濃度滅活菌液葉面噴施組以及高/低濃度滅活菌液根際灌施組，每組4株藤茶。其中灌施均使用50 mL懸液, 而噴施以葉面有液滴滴落為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 藤茶二氫楊梅素含量的測定

內(nèi)生真菌處理一個月后，收集藤茶莖端至下方4層葉片，60℃干燥至恒重，研缽充分研磨待用。精確稱取研磨后的藤茶0.5 g加入20 mL甲醇，超聲提取10 min，倒出提取液，重復(fù)操作1次，合并提取液置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，過濾，棄去初濾液10 mL；精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。利用多功能酶標(biāo)儀分別于291 nm和373 nm處測定吸光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，計算供試品中二氫楊梅素和楊梅素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果

分離得到一株藤茶葉源優(yōu)勢內(nèi)生真菌LZC-2，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周以上，可見大量分生孢子（圖1），光學(xué)顯微鏡下可見明顯分生孢子梗和頂囊等結(jié)構(gòu)。將LZC-2分生孢子接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基可形成明顯的菌絲球（圖2）。

圖1 PDA培養(yǎng)基上LZC-2形態(tài)Figure 1 Morphology of LZC-2 on PDA medium

2.2 內(nèi)生真菌分子鑒定結(jié)果

分離純化得到的內(nèi)生真菌LZC-2，經(jīng)基因組提取，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。該基因大小在10 Kb以上（圖3），表明該基因組DNA提取成功。對LZC-2的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果顯示該基因片段大小為500 bp左右，符合真菌通用引物擴(kuò)增ITS基因序列片段的大小。將擴(kuò)增出來的ITS序列測序，發(fā)現(xiàn)其片段長度為572 bp（圖4），測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌LZC-2與煙曲霉菌最為相似，NCBI登錄號為MW578364.1。

圖4 ITS序列擴(kuò)增片段電泳圖Figure 4 Electrophorogram of ITS sequence amplified fragment

2.3 內(nèi)生真菌對藤茶二氫楊梅素含量的影響

二氫楊梅素濃度在13.5 ～ 108 mg/L，濃度與吸光值間有良好的線性關(guān)系，y=1.22379+0.02268x，相關(guān)系數(shù)R=0.99886，決定系數(shù)R2=0.99772（圖5）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得藤茶供試樣本中的二氫楊梅素含量如表1所示，可以看出內(nèi)生真菌處理均能不同程度地降低藤茶中二氫楊梅素的積累，高濃度處理組的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而低濃度處理組的抑制作用沒有顯著性差異（P＞ 0.05），其中高濃度內(nèi)生真菌滅活液根際灌施對二氫楊梅素積累的抑制作用最強(qiáng)（表1）。

圖5 二氫楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Standard curve of dihydromyricetin

表1 LZC-2處理對藤茶中二氫楊梅素含量的影響Table 1 Effect of LZC-2 treatment on dihydromyricetin content in vine tea

2.3 內(nèi)生真菌對藤茶楊梅素含量的影響

楊梅素濃度在1.2 ～ 9.6 mg/L，濃度與吸光值間有良好的線性關(guān)系，y=0.1084+0.03643x，相關(guān)系數(shù)R=0.99958，決定系數(shù)R2=0.99917（圖6）。

圖6 楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 Standard curve of myricetin

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得藤茶供試樣本中的楊梅素含量如表2所示，可以看出各處理藤茶中的楊梅素含量變化區(qū)間為17.86 ～ 23.13 mg/g，其中高濃度內(nèi)生真菌孢子懸液和其滅活液根際灌施均能顯著增加藤茶中楊梅素的積累（P＜0.05），而其它內(nèi)生真菌處理對楊梅素含量的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）（表2）。

表2 LZC-2處理對藤茶中楊梅素含量的影響Table 2 Effect of LZC-2 treatment on myricetin content in vine tea

3 討論

藤茶幼嫩莖葉中二氫楊梅素含量較高，被譽(yù)為黃酮類化合物在植物體中分布的一種特例[4]。然而藤茶植株中大量光合產(chǎn)物流向二氫楊梅素的機(jī)制尚不清楚。植物次生代謝產(chǎn)物種類多，具有廣泛的藥用價值，其合成和積累不僅受遺傳基因的控制，還受到生長發(fā)育階段、季節(jié)和環(huán)境因子（光照強(qiáng)度、光質(zhì)、溫度、水分和養(yǎng)分）等多種因素的影響[5]。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物的健康組織內(nèi)，在長期的進(jìn)化過程中與其宿主植物建立了特殊的關(guān)系，這種關(guān)系顯著影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。

大量報道顯示，內(nèi)生真菌可以促進(jìn)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的積累，如內(nèi)生曲霉（Aspergillus sp）可提高宿主植物毛脈酸模山楂素、白藜蘆醇、大黃酚和大黃素的含量[6]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌LZC-2處理降低宿主植物二氫楊梅素的積累（表1），而高濃度內(nèi)生真菌LZC-2根際灌施顯著增加宿主中楊梅素的積累（表2）。這些現(xiàn)象暗示不是所有內(nèi)生真菌都能促進(jìn)植物活性次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，內(nèi)生真菌抑制部分次生代謝產(chǎn)物的積累也可能利于其他次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，甚至改變植物次生代謝產(chǎn)物的組成。類似的情況在內(nèi)生真菌對薄荷（Mentha piperitaL.）[7]以及高羊茅（Festuca arundinacea schreb）[8]的次生代謝物積累影響的試驗(yàn)研究中均有報道。

值得注意的是，高濃度內(nèi)生真菌LZC-2孢子懸液滅活液根際灌施既能顯著降低藤茶植株二氫楊梅素的積累，也能提高楊梅素的積累，表明內(nèi)生真菌LZC-2很可能是通過其誘導(dǎo)子調(diào)控藤茶植株次生代謝產(chǎn)物二氫楊梅素和楊梅素積累的。迄今利用真菌誘導(dǎo)子調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累已有大量報道[9]，誘導(dǎo)子信號被傳遞到細(xì)胞內(nèi)以后，通過控制次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的生物合成[10]。內(nèi)生真菌LZC-2對宿主藤茶二氫楊梅素和楊梅素積累的調(diào)控作用是否是通過控制其代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，尚需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。