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    腦梗死半暗區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)定量分析及臨床意義

    2022-11-11 11:55:58馬瑞寧侯惠蓮張冠軍王鴻雁宮惠琳
    陜西醫(yī)學(xué)雜志 2022年11期
    關(guān)鍵詞:胞體暗區(qū)星形

    馬瑞寧,侯惠蓮,柳 雨,張冠軍,王鴻雁,宮惠琳,楊 喆

    (西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,陜西 西安 710061)

    高血壓引起的腦梗死伴出血病情發(fā)展迅速,病死率及致殘率均較高,嚴(yán)重危害人們的健康[1-2]。高血壓病患者的血管壁玻變?cè)龊?,使腦部血流血液循環(huán)障礙,缺血、缺氧引起腦梗死,由于梗死區(qū)域血管重建,恢復(fù)血流灌注,從而導(dǎo)致繼發(fā)性出血,引起腦組織復(fù)雜的病理變化,嚴(yán)重影響神經(jīng)功能恢復(fù)及神經(jīng)再生。而腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[3],成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),受到人們的重視。研究認(rèn)為,腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、反應(yīng)性增生,并且這些活化增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變,包括細(xì)胞體積肥大、突起增粗、變長(zhǎng)等,限制了組織損傷,有助于腦組織神經(jīng)元功能的恢復(fù)[4],尚有爭(zhēng)議,其機(jī)制尚不清楚,而且研究者多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的定性分析[5],對(duì)于人體腦組織梗死出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其計(jì)算機(jī)智能量化分析,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少[6],尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異蛋白和骨架成分之一, GFAP表達(dá)的強(qiáng)弱能夠反映膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài),被公認(rèn)為膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物[7]。 本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)人體腦梗死周?chē)氚祬^(qū)GFAP的表達(dá),測(cè)定GFAP表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞體的面積、突起長(zhǎng)度,茲在分析探討腦梗死后周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,為進(jìn)一步研究腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 回顧性分析2018年1月至2019年6月間我院病理科歸檔確診的臨床病理資料完整的高血壓引起腦梗死伴繼發(fā)出血的患者行小骨窗微創(chuàng)開(kāi)顱手術(shù)、石蠟包埋及切片標(biāo)本63例,以每例梗死伴出血旁正常腦組織為對(duì)照組。其中男37例,女26例;年齡42~86歲,平均年齡(60.63±9.38)歲,63例患者頭顱CT或MRI顯示顱內(nèi)出血量約5~15 ml,從初次發(fā)病到手術(shù)時(shí)入院時(shí)間在6~23 d。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均具有高血壓病史[收縮壓≥140 mmHg,或者(和)舒張壓≥90 mmHg,或正在服用抗高血壓藥];②初次發(fā)病經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診為腦梗死;③入院時(shí)均有頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙等臨床癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等重要器官功障礙;②腦動(dòng)脈瘤,小腦、腦干出血者;③嚴(yán)重心臟瓣膜病變;④惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾?。虎莅橛衅渌窠?jīng)系統(tǒng)疾??;⑥臨床資料不完整等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 免疫組化染色及其結(jié)果測(cè)定 ①采用Max-Vision 即用型快速免疫組織化學(xué)一步法檢測(cè)GFAP表達(dá):兔抗人GFAP單克隆抗體及其試劑盒及DAB顯色試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,一抗稀釋度GFAP(1∶400),蘇木素復(fù)染核,DAB顯色。陽(yáng)性對(duì)照為已診斷的腦星形細(xì)胞瘤,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化染色的陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色。②GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):GFAP陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及突起,呈棕褐色,輪廓清楚,細(xì)胞突起呈星形,采用圖像分析系統(tǒng)分析被檢測(cè)細(xì)胞單位面積(mm×mm)的陽(yáng)性數(shù),在高倍鏡下(×400)選擇5個(gè)單位面積的陽(yáng)性數(shù)求其平均值即為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[8]。

    1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積及其突起長(zhǎng)度測(cè)定 用Image-Pro Plus 5.0軟件測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞分支突起長(zhǎng)度作為其突起長(zhǎng)度,即:每次在高倍鏡下(×400)選擇5個(gè)視野星形膠質(zhì)細(xì)胞分支突起長(zhǎng)度,求其平均值即為星形細(xì)胞突起長(zhǎng)度;在高倍鏡下(×400)選擇一個(gè)視野測(cè)5個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞,取其平均值作為一個(gè)視野的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積,隨機(jī)選取5個(gè)視野求其平均值即為星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積。

    2 結(jié) 果

    2.1 腦出血梗死周?chē)氚祬^(qū)病理組織學(xué)特征及免疫組化GFAP的表達(dá) HE染色光鏡下顯示,正常腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞數(shù)目未見(jiàn)減少,無(wú)核固縮現(xiàn)象及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。梗死區(qū)不規(guī)則,周?chē)氚祬^(qū)腦組織水腫,神經(jīng)元數(shù)目減少,呈三角形、核固縮,有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn),星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,肉芽組織形成(圖1B)。GFAP陽(yáng)性表達(dá)在所觀察目標(biāo)組織星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)主要觀察其在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。在周?chē)DX組織中,GFAP 表達(dá)的陽(yáng)性星形細(xì)胞均勻分布,胞體較小,突起呈分支狀較纖細(xì),呈放射狀分布(圖1C)。在梗死灶周?chē)氚祬^(qū),GFAP 標(biāo)記的陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞體面積增大,突起增長(zhǎng)、互相交織成網(wǎng),聚集在病灶邊緣,并可見(jiàn)少量深入梗死灶(圖1D)。

    A:對(duì)照正常人體腦組織的相應(yīng)區(qū)域 (HE染色,×200);B:腦梗死半暗區(qū)肉芽組織(HE染色,×200);C:對(duì)照正常人體腦組織的相應(yīng)區(qū)域GFAP 標(biāo)記陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞均勻分布,胞體較小,突起呈分支狀(En Vision法染色,×200);D:腦梗死半暗區(qū),GFAP標(biāo)記陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積增大,突起增長(zhǎng)、互相交織成網(wǎng) (En Vision法染色,×200)

    2.2 腦梗死周?chē)氚祬^(qū)GFAP表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞體面積、突起長(zhǎng)度的變化 見(jiàn)表1。GFAP表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在腦梗死周?chē)氚祬^(qū)明顯高于周?chē)DX組織(P<0.01)。采用Image-Pro Plus 5.0軟件測(cè)量結(jié)果顯示,在周?chē)DX組織中,星形細(xì)胞的胞體面積較小,突起較短(圖2A);在梗死灶周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體面積增大,突起增長(zhǎng)、互相交織成網(wǎng)(圖2B)。兩者之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    表1 腦梗死周?chē)氚祬^(qū)GFAP 標(biāo)記的陽(yáng)性星形細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞體面積、細(xì)胞突起長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果

    A:正常腦組織的相應(yīng)區(qū)域,星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積較小,突起較短(×400);B:腦梗死半暗區(qū),星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體面積較大,突起增長(zhǎng)、互相交織成網(wǎng)(×400)

    2.3 腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞體面積、數(shù)目與其突起長(zhǎng)度相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示,在腦出血梗死周?chē)氚祬^(qū),GFAP表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與星形膠質(zhì)細(xì)胞體面積無(wú)相關(guān)性(r=0.246,P>0.05),與星形膠質(zhì)細(xì)胞突起長(zhǎng)度無(wú)相關(guān)性(r=-0.118,P>0.05)。說(shuō)明在人體腦梗死周?chē)氚祹^(qū),星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的增加與其細(xì)胞體增大及突起長(zhǎng)度的伸長(zhǎng)無(wú)關(guān)聯(lián)性,是相互獨(dú)立的,表明反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征多樣,可表現(xiàn)為其細(xì)胞體積的增大,或僅表現(xiàn)為細(xì)胞突起的伸長(zhǎng)。

    3 討 論

    高血壓引起的腦梗死病情發(fā)展迅速,嚴(yán)重危害人們的健康[9-10]。在腦梗死區(qū),一方面,由于梗死灶內(nèi)血管壁發(fā)生缺血,血栓溶解、栓子破碎、移向遠(yuǎn)端,使血管再通,血流再灌注,在血壓的作用下缺血壞死的血管破裂而形成出血性梗死;另一方面,梗死邊緣側(cè)支循環(huán)開(kāi)放,血管擴(kuò)張充血,造成梗死邊緣壞死,易致血液從受損的毛細(xì)血管漏出,發(fā)生梗死周?chē)c(diǎn)片狀出血[11]。此外,梗死后腦水腫使腦梗死周?chē)M織毛細(xì)血管受壓而發(fā)生缺血壞死和內(nèi)皮損害,血管壁通透性增強(qiáng),易致血液從受損的毛細(xì)血管漏出,發(fā)生梗死周?chē)X組織出血,由此引起腦組織一系列復(fù)雜的病理變化,引起嚴(yán)重的腦神經(jīng)功能的損害。本組結(jié)果顯示,患者因高血壓引起腦梗死,進(jìn)而伴出血,其病理學(xué)特征表現(xiàn)為,腦組織局灶區(qū)壞死,形態(tài)不規(guī)則,周?chē)纬砂导t色的半暗區(qū),表現(xiàn)為腦組織水腫,神經(jīng)元數(shù)目減少,呈三角形、核固縮,有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,肉芽組織形成。

    研究認(rèn)為,腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[3]。腦梗死出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵是神經(jīng)元再生和神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建。多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為,膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死出血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用,不僅對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞起支撐、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等作用,而且構(gòu)成了神經(jīng)信息傳導(dǎo)的重要部分[8]。郭金赫等[12]研究發(fā)現(xiàn),腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,細(xì)胞大量分化增殖,反應(yīng)性增生,同時(shí),GFAP等相關(guān)蛋白的增加,對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用,間接地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要的細(xì)胞骨架蛋白,主要存在于腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中[13-14]。GFAP陽(yáng)性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖可能是具有保護(hù)神經(jīng)元和微血管活性的星形細(xì)胞,在發(fā)生腦梗死后的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中尤為明顯,因此常作為分化和反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物[15-16]。本組結(jié)果顯示,在人體腦梗死周?chē)氚祬^(qū)GFAP表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高,說(shuō)明該區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了反應(yīng)性增生。

    近年研究發(fā)現(xiàn),腦梗死后,周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)亦發(fā)生了變化,包括胞體肥大、腫脹、突起增多、延長(zhǎng),并朝著壞死區(qū)遷移,形成一道屏障,將其與周?chē)^(qū)隔離,防止細(xì)胞損傷的擴(kuò)散,同時(shí)為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持,維持神經(jīng)元的存活,對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用,有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)[17-18]。新近,隨著計(jì)算機(jī)人工智能在神經(jīng)病理學(xué)中的應(yīng)用,采用計(jì)算機(jī)圖像分析對(duì)細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)精準(zhǔn)的測(cè)量,這一新的技術(shù)能夠準(zhǔn)確地顯示腦梗死半暗區(qū)星形細(xì)胞胞體肥大、突起延長(zhǎng),并進(jìn)行量化分析,簡(jiǎn)便易行,省時(shí)省力,對(duì)研究神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞功能具有劃時(shí)代意義[19]。本組結(jié)果顯示:人體腦梗死周?chē)氚祬^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞不但數(shù)目明顯增加,而且其細(xì)胞體面積增大、突起變長(zhǎng),說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。推測(cè)這種反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞可能具有恢復(fù)細(xì)胞外環(huán)境成分和刺激自我修復(fù)的作用,并對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活具有促進(jìn)作用,有助于顱腦損傷的修復(fù)。間接證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了梗死灶神經(jīng)修復(fù)和再生的過(guò)程。

    另有研究[20]發(fā)現(xiàn),過(guò)度增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)抑制神經(jīng)元的發(fā)育和生長(zhǎng)。隨著腦梗死區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞大量聚集,細(xì)胞間的生長(zhǎng)相互疊加和覆蓋,GFAP 過(guò)度表達(dá)形成膠質(zhì)瘢痕。膠質(zhì)瘢痕作為物理、化學(xué)屏障,可以局限于梗死區(qū),從而發(fā)揮保護(hù)作用,然而,腦梗死區(qū)中的某些有害分子可經(jīng)滲透通過(guò)膠質(zhì)瘢痕,導(dǎo)致神經(jīng)變性,阻止了神經(jīng)元軸突的再生,抑制神經(jīng)修復(fù)并引起嚴(yán)重的組織損傷,甚至使壞死區(qū)擴(kuò)大,引起免疫性炎性反應(yīng)等。本結(jié)果還顯示,在腦梗死周?chē)氚祬^(qū),GFAP 標(biāo)記的陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞突起互相交織成網(wǎng),聚集在病灶邊緣,有形成膠質(zhì)瘢痕的趨勢(shì)。推測(cè)可能會(huì)抑制神經(jīng)修復(fù)并引起組織損傷。

    總之,高血壓引起腦梗死出血后,神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性改變對(duì)神經(jīng)功能修復(fù)的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,GFAP在其周?chē)氚祬^(qū)表達(dá)明顯升高,并且這種反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,間接說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞參與并促進(jìn)了梗死灶神經(jīng)修復(fù)和再生的過(guò)程。

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