缺氧誘導(dǎo)因子-1α、Notch1和Jagged1共轉(zhuǎn)染對急性心肌梗死模型大鼠心功能的改善作用

李雪梅，南武娟

(1.榆林市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 榆林 719000；2.咸陽市第一人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，陜西 咸陽 712000)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)指心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，進而導(dǎo)致心肌缺氧，最終導(dǎo)致心功能受損[1-3]。AMI是所有類型心血管疾病的主要死因，因此探索心肌梗死后缺氧調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的機制可能為深入了解和預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡提供重要的分子基礎(chǔ)。心肌缺血/再灌注可激活保護心肌細(xì)胞免受缺血性損傷的各種分子和細(xì)胞途徑[4-5]。在這些信號通路中，Notch信號傳導(dǎo)是一種重要的模式識別受體，與骨髓分化、炎癥和平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，并且與動脈粥樣硬化、糖尿病和其他代謝疾病等有關(guān)[6]。在典型的信號通路中，Notch受體與其配體(Delta-like或Jagged)相互作用導(dǎo)致跨膜Notch受體的蛋白水解切割，產(chǎn)生Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，遷移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核中，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子重組信號結(jié)合蛋白J結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。Jagged1是Notch信號通路重要的配體，是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的特異性單次細(xì)胞跨膜蛋白，具有修復(fù)神經(jīng)元、促進其再生的作用，進而提高神經(jīng)元的存活率。Notch信號使巨噬細(xì)胞向M1促炎表型極化并增強炎性反應(yīng)。此外，Notch信號傳導(dǎo)可能通過發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1(Hairy and enhancer of split 1，Hes1)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路的激活子激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)基因。HIF-1α在缺氧期間調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)水平，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮雙向作用[7]。HIF-1α是心肌梗死后缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，通過減少氧氣或增加氧化應(yīng)激激活 HIF-1α，在心肌中發(fā)揮心臟保護作用[8]。本研究探討急性心肌梗死模型大鼠外周血缺氧誘導(dǎo)因子-1α、Notch1和Jagged1表達(dá)水平與心功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠30只，鼠齡2～3個月，平均體重(250±30)g，購自陜西省疾病預(yù)防控制中心，許可證號：XYXK(陜)2018-009。將大鼠飼養(yǎng)在(22±2)°C、40%～50%濕度、12 h/12 h光/暗循環(huán)、自由獲取食物和水的環(huán)境中。

1.2 主要試劑與儀器 1%戊巴比妥鈉(批號：P3761，德國Sigma-Aldrich公司)；4%多聚甲醛(批號：47608，德國Sigma-Aldrich公司)；TRIzol試劑(批號：5017511，美國Thermo Fisher公司)；PCR試劑盒(批號：4349182美國，Thermo Fisher公司)；增強型化學(xué)發(fā)光試劑(批號：WP20005，美國Thermo Fisher公司)；光學(xué)顯微鏡(型號：CH20BIMF200，日本東京奧林巴斯公司)。

1.3 實驗分組 將30只大鼠分為模型組、共轉(zhuǎn)染組和對照組，每組10只。①模型組：通過腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉。氣管插管后，所有大鼠使用小動物呼吸機接受正壓有氧通氣，并在左側(cè)第4肋間打開胸部，切開心包后將心臟外化。使用6-0絲線縫合冠狀動脈左前降支，距主動脈根部約3～5 mm。通過梗死區(qū)域的局部發(fā)紺驗證AMI模型的制備成功。②共轉(zhuǎn)染組：在冠狀動脈左前降支結(jié)扎過程中將HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉(zhuǎn)染慢病毒注射到大鼠心臟的胸前組織中，即在梗死區(qū)域周圍的4個不同點注射慢病毒，每個點注射1×106個慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。③對照組：與模型組進行相同的外科手術(shù)，但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。

1.4 心肌組織HE染色 用40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，快速解剖心臟并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，隨后使用充水球囊將左心室內(nèi)壓維持在20 mmHg。移除主動脈弓、右心室、心房和耳廓，水平切成五個1 mm厚的部分。提取的左心室梗死區(qū)域在4%多聚甲醛中固定24 h。將固定的組織標(biāo)本切成6 μm切片用于HE染色。在光學(xué)顯微鏡下以400倍放大率評估染色組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 反轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)分析 根據(jù)制造商的方案，用Trizol試劑從100 mg缺血心肌組織樣品中提取總RNA。RNA的純度用分光光度法測定A260/A280比值。每個樣品的總RNA(2 μg)用莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以下引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成：HIF-1α正向序列為5’-CAGCGATGACACGGAAAC-3’，反向序列序列為5’-AGTGACTCTGGGCTTGAC-3’；Notch1 正向序列為5’-CTTCGTGCTCCTGTTCTTTG-3’，反向序列為5’-GCCTCTGACACTTTGAAACC-3’；Jagged1正向序列為5’-CACCCGAACTGGACAAAC-3’，反向序列為5’-AGCCTCAGACTGGGATAC-3’。這些引物對分別產(chǎn)生210、105、170 bp的擴增產(chǎn)物。將大鼠甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部對照：正向序列為5’-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向序列為5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’。使用SYBR實時PCR試劑盒制備qPCR反應(yīng)。通過檢測SYBR-Green 熒光信號強度對PCR產(chǎn)物進行定量，并通過Applied Biosystems Prism 7300 SDS軟件進行分析。HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達(dá)水平通過2-ΔΔCt法量化，歸一化為GAPDH水平。

1.6 蛋白印跡分析 將20 mg冷凍組織樣品粉碎并在150～250 μl RIPA裂解緩沖液中均質(zhì)化。根據(jù)制造商的方案，通過進行BCA測定來確定蛋白質(zhì)水平。制備的蛋白質(zhì)樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，將膜在室溫下用TBS中的奶粉封閉60 min，與抗HIF-1α(1∶1000)、抗Notch1(1∶1000)、抗Jagged1(1∶500)和抗GAPDH(1∶1500)一抗在4 ℃下孵育過夜后，用含0.1% Tween-20的TBS洗滌膜3次，隨后用含0.1% Tween-20的TBS中的HRP偶聯(lián)二抗(1∶2000)在37 ℃下孵育30 min。根據(jù)制造商的方案，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑使條帶可視化。將HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為來自同一樣品的GAPDH條帶的強度。所有實驗重復(fù)3次，并計算平均值。

1.7 心功能指標(biāo)檢測 通過超聲心動圖和有創(chuàng)壓力-容積血流動力學(xué)評估心臟功能。超聲心動圖專家以盲法進行測量，檢測射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 見圖1。對照組大鼠心肌細(xì)胞膜完整，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組心肌細(xì)胞溶解或破壞、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞或膠原纖維及少量炎癥細(xì)胞浸潤；共轉(zhuǎn)染組上述組織病理學(xué)異常較模型組減輕。

圖1 三組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

2.2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白相對表達(dá)水平比較 見圖2(表1)。模型組HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白相對表達(dá)水平較對照組降低，共轉(zhuǎn)染組HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白相對表達(dá)水平較模型組升高(均P<0.05)。

圖2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白電泳結(jié)果

表1 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白相對表達(dá)水平比較

2.3 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1 mRNA相對表達(dá)水平比較 見表2。模型組HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達(dá)水平較對照組降低，共轉(zhuǎn)染組HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達(dá)水平較模型組升高(均P<0.05)。

表2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.4 三組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表3。模型組EF和FS較對照組降低，共轉(zhuǎn)染組EF和FS較模型組升高(均P<0.05)。模型組LVEDD和LVESD較對照組升高，共轉(zhuǎn)染組LVEDD和LVESD較模型組降低(均P<0.05)。

表3 三組大鼠心功能指標(biāo)比較

3 討 論

AMI伴有心肌細(xì)胞凋亡、心肌重構(gòu)等多種病理特征，心肌細(xì)胞凋亡是AMI后心肌損傷的主要原因。一系列病理因素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，包括缺氧、鈣超載和酸中毒，其中缺氧是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的重要因素[9-11]。在本研究中，通過冠狀動脈結(jié)扎建立大鼠AMI模型。HE染色觀察到梗死心臟組織學(xué)變化表現(xiàn)為心肌細(xì)胞溶解或破壞、心肌結(jié)構(gòu)紊亂和大量成纖維細(xì)胞或膠原纖維，而HIF-1α、Notch1和Jagged1共轉(zhuǎn)染過表達(dá)顯著減輕了這些病理異常。

HI是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由HIF-1α和HIF-1β組成[12-13]。研究表明，HIF-1α是一種表達(dá)發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧期間發(fā)揮重要作用。HIF-1α調(diào)節(jié)與糖酵解、糖代謝、線粒體功能、細(xì)胞存活相關(guān)的一系列基因的表達(dá)，以及細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激。具體來說，低劑量和高劑量的HIF-1α對缺氧后心肌細(xì)胞凋亡的影響不同。研究[14-16]表明，HIF-1α增強了對缺氧的耐受性并保護了心肌。隨著HIF-1α劑量的增加，HIF-1α介導(dǎo)的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致更差的結(jié)果。AMI誘導(dǎo)缺血或缺氧心肌中HIF-1α的上調(diào)，這有助于心臟保護作用。在本研究中，與模型組大鼠相比，共轉(zhuǎn)染組增加了HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)。動物實驗表明，HIF-1α過表達(dá)可減輕梗死面積并在梗死后4周改善心臟功能。因此，HIF-1α被認(rèn)為是心臟保護的治療靶點。Notch信號傳導(dǎo)在免疫細(xì)胞中的作用也得到了廣泛的研究，特別是在巨噬細(xì)胞之間的近分泌同型通訊以及在各種缺血損傷模型中[17-18]。全身和局部巨噬細(xì)胞趨化性的增加導(dǎo)致Notch信號和巨噬細(xì)胞(M1)的激活，并延長炎癥細(xì)胞向傷口的募集。Notch信號通路對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。心肌中的低氧環(huán)境可能導(dǎo)致Notch信號激活，從而通過促進心肌再生、保護缺血心肌或誘導(dǎo)血管生成來減輕心肌損傷并改善心臟功能[19-20]。Notch1和Jagged1是在成人肌細(xì)胞中表達(dá)的主要Notch信號形式。此外，Notch1信號在增殖的胚胎和未成熟心肌細(xì)胞或梗死后心肌的邊界區(qū)中被激活[21]。Notch1信號傳導(dǎo)還抑制缺血后心肌細(xì)胞的凋亡[22]。本研究在AMI后檢測到心肌中Notch1和Jagged1的表達(dá)降低，與模型組大鼠相比，Notch1和Jagged1的模擬轉(zhuǎn)染物增加了Notch1和Jagged1 mRNA及蛋白的表達(dá)，表明Notch1/Jagged1信號傳導(dǎo)的上調(diào)可能是減輕AMI后心肌損傷的潛在機制。

本研究中使用動物超聲系統(tǒng)檢測大鼠的心功能并進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組EF和FS較對照組降低，共轉(zhuǎn)染組EF和FS較模型組升高；模型組LVEDD和LVESD較對照組升高，共轉(zhuǎn)染組LVEDD和LVESD較模型組降低。這表明HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉(zhuǎn)染減輕了模型組大鼠心功能的惡化，具有改善心功能的作用。

綜上所述，AMI模型大鼠外周血HIF-1α、Notch1、Jagged1表達(dá)水平降低，心功能下降。HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉(zhuǎn)染可改善AMI模型大鼠的心功能。