C1q壞死因子相關(guān)蛋白12、脂聯(lián)素在腦動脈粥樣硬化大鼠血清中的表達(dá)及其與磁共振成像技術(shù)參數(shù)相關(guān)性研究

宋 煒，徐曉軍，張學(xué)平

(1.陜西省康復(fù)醫(yī)院影像科,陜西 西安 710065;2.榆林市星元醫(yī)院磁共振室,陜西 榆林 719000)

顱內(nèi)動脈粥樣硬化是指腦動脈的管壁由于脂類物質(zhì)沉積和內(nèi)膜受損，血小板、纖維素等物質(zhì)聚集在損傷的內(nèi)膜上，引起管壁結(jié)締組織增生、內(nèi)膜粗糙、失去彈性以及管腔狹窄或閉塞，從而引起腦組織供血減少或梗死，是一種臨床上常見的腦血管疾病之一[1-2]。腦動脈粥樣硬化的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括年齡、飲食、性別、吸煙以及高血壓等。在我國，缺血性腦卒中約占腦卒中的74%，其中約46.6%的缺血性腦卒中是由顱內(nèi)動脈粥樣硬化性狹窄而引起，所以腦動脈硬化斑塊的早期檢出和穩(wěn)定性判斷對預(yù)防和治療腦卒中意義重大[3-4]。磁共振成像技術(shù)是一種無創(chuàng)的、可有效評估患者血管壁和動脈斑塊穩(wěn)定性的影像學(xué)診斷技術(shù)，但高昂的價格使其不能被廣泛的應(yīng)用于腦動脈粥樣硬化患者的斑塊評估中[5]。C1q壞死因子相關(guān)蛋白12(C1q necrosis factor-related protein 12，CTRP12)是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，是脂聯(lián)素保守的旁系同源物。研究[6-7]表明，CTRP12主要參與脂肪細(xì)胞合成和分泌，具有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗炎和抑制甘油三酯合成等，被發(fā)現(xiàn)可以通過miR-155-5p/LXRα 通路促進(jìn)膽固醇流出和抑制炎性反應(yīng)來改善動脈粥樣硬化。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN) 是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)。此外，脂聯(lián)素也是一種胰島素增敏激素能改善小鼠的胰島素抗性和動脈硬化癥，并被證實與2型糖尿病和冠心病的發(fā)展有關(guān)，在臨床試驗表現(xiàn)出抗糖尿病、抗動脈粥樣和炎癥的潛力[8]。本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)高血壓大鼠以建立腦動脈粥樣硬化模型，研究腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN的表達(dá)水平，并探討其表達(dá)與磁共振成像技術(shù)參數(shù)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗大鼠：30只SD大鼠(6～8周齡，SPF級，雌性，300 g左右)斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2022-0075]。所有大鼠被適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(自由進(jìn)食飲水，晝夜各半，22 ℃)后被用于本研究。

1.1.2 試劑與儀器：基礎(chǔ)飼料和高脂飼料均購買自北京博奧派克生物科技有限公司；CTRP12酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司(批號202010)；脂聯(lián)素(APN)酶聯(lián)免疫試劑盒購自Merck公司(批號RAB1136)；小動物核磁共振成像儀購自蘇州紐邁分析儀器股份有限公司(型號NM21-040H-I)。

1.2 研究方法

1.2.1 腦動脈粥樣硬化模型制作：參考文獻(xiàn)[9]建立高血壓、高血脂誘導(dǎo)的腦動脈粥樣硬化大鼠模型。兩組大鼠均禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，在無菌條件下切開腹部皮膚，分離雙側(cè)腎動脈，使用手術(shù)縫合線以適度的松緊度結(jié)扎雙側(cè)腎動脈(血液可流動)，造成雙側(cè)腎動脈狹窄，即建立高血壓模型。正常大鼠血壓為85～115 mmHg，造模后血壓若≥正常血壓20 mmHg且>115 mmHg說明高血壓模型制作成功。對照組大鼠僅開腹不結(jié)扎雙側(cè)腎動脈。術(shù)后模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，而對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)16周。高脂飼料可造成大鼠高血脂，進(jìn)而誘導(dǎo)動脈粥樣硬化，在高血壓基礎(chǔ)上，可加速腦動脈粥樣硬化形成。當(dāng)觀察到大鼠血管內(nèi)皮表面粗糙、凹凸不平，細(xì)胞排列不齊，內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞增生明顯，且與大量堆積的泡沫細(xì)胞形成典型的動脈粥樣硬化斑塊，說明腦動脈粥樣硬化大鼠模型造模成功。

1.2.2 頭顱磁共振掃描：模型組在術(shù)后喂養(yǎng)16后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，使用核磁共振成像儀對所有大鼠大腦中動脈進(jìn)行整體掃描，將掃描數(shù)據(jù)上傳工作站，并在3D-TOF 原始圖及重建圖上確定動脈狹窄位置，依此使用軟件直接計算大鼠腦動脈斑塊個數(shù)、斑塊厚度和斑塊體積。

1.2.3 血清學(xué)指標(biāo)：大鼠在完成頭顱磁共振成像掃描后，通過頸椎脫臼法處理所有大鼠，手術(shù)切開胸腔，暴露心臟，使用無菌注射器吸取血液3～5 ml，室溫條件下1000 g離心10 min以分離血清，使用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量，并使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清CTRP12和APN水平。

1.2.4 血壓測量：于術(shù)前、術(shù)后1周將清醒狀態(tài)的大鼠置于固定器內(nèi)，露出鼠尾，于37 ℃水中浸泡30 min，將鼠尾放進(jìn)套袖，待大鼠安靜后充氣，測定收縮壓，重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血壓和血脂水平比較 模型組大鼠收縮壓和血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著高于對照組大鼠(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠收縮壓和血脂指標(biāo)比較

2.2 兩組大鼠血清CTRP12和APN水平比較 模型組大鼠血清CTRP12和APN水平均顯著低于對照組正常大鼠(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠血清CTRP12和APN水平比較

2.3 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊個數(shù)相關(guān)性 應(yīng)用磁共振成像技術(shù)檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊個數(shù)，并分析其與血清CTRP12和APN相關(guān)性，結(jié)果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊個數(shù)與CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.692，P<0.05)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，見圖1。

圖1 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊個數(shù)與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關(guān)性散點圖

2.4 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊厚度相關(guān)性 應(yīng)用磁共振成像技術(shù)檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊厚度，并分析其與血清CTRP12和APN相關(guān)性，結(jié)果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊厚度與CTRP12(r=-0.622，P<0.05)、APN(r=-0.577，P<0.05)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，見圖2。

圖2 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊厚度與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關(guān)性散點圖

2.5 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊體積相關(guān)性 應(yīng)用磁共振成像技術(shù)檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊體積，并分析其與血清CTRP12和APN相關(guān)性，結(jié)果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內(nèi)斑塊體積與CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.612，P<0.05)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，見圖3。

圖3 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊體積與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關(guān)性散點圖

3 討 論

顱內(nèi)動脈粥樣硬化性狹窄(Intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS)不僅是缺血性卒中(中風(fēng))最常見原因之一，同樣也是卒中復(fù)發(fā)的高風(fēng)險因素，當(dāng)前呈現(xiàn)出高發(fā)病率及高病死率的特點。流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)[10-11]顯示，超過一半的東南亞缺血性腦卒中是由ICAS引起，并且ICAS患者不僅終生卒中發(fā)病風(fēng)險升高，而且1年內(nèi)再發(fā)卒中概率可高達(dá)20%。此外，研究[12]還指出，無論是癥狀性ICAS還是無癥狀I(lǐng)CAS患者，血管風(fēng)險因素均與其狹窄嚴(yán)重程度、卒中發(fā)病風(fēng)險呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，因此對血管風(fēng)險因素進(jìn)行有效管理至關(guān)重要。盡管目前多種影像學(xué)技術(shù)，比如彩超、CT血管造影、數(shù)字減影血管造影以及磁共振血管成像等，都可以有效地對血管壁狀態(tài)和斑塊穩(wěn)定性進(jìn)行評估，但較高的成本使其不能被推廣。因此，篩選出與動脈血管壁狀態(tài)和斑塊穩(wěn)定性有關(guān)的生物標(biāo)志物意義重大。

本文研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN水平均顯著低于對照組正常大鼠，這表明血清CTRP12和APN可能與腦動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步分析可知：脂肪因子是由脂肪組織分泌的具有生物活性的細(xì)胞因子及激素，與胰島素抵抗冠狀動脈粥樣硬化等代謝過程密切相關(guān)，CTRP12和APN都是脂肪因子[13]。脂聯(lián)素是外周血中含量最高的脂肪因子，通過與其受體結(jié)合后，通過激活腺苷酸活化蛋白激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶和過氧物酶體增殖物激活受體等信號分子發(fā)揮抗炎、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化等多種生物學(xué)作用[14]。CTRP12作為脂聯(lián)素的旁系同源物，由信號肽、短N端結(jié)構(gòu)域、膠原樣結(jié)構(gòu)域和球狀C1q樣結(jié)構(gòu)域組成。與脂聯(lián)素一樣，CTRP12也被發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并被發(fā)現(xiàn)在與炎性細(xì)胞因子和胰島素抵抗有關(guān)的冠狀動脈疾病患者血清中表達(dá)降低[15-16]。綜上并結(jié)合本研究結(jié)果可知，CTRP12和APN在腦動脈粥樣硬化大鼠血清中表達(dá)降低，并可能與腦動脈粥樣硬化的發(fā)展有關(guān)。

高分辨磁共振成像(High-resolution magnetic resonance imaging，HRMRI)是當(dāng)前明確動脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)最為可靠的無創(chuàng)檢查之一，其可以清晰地看到血管壁的情況，尤其對于硬化斑塊的形態(tài)及組織成分的分析有著較大的優(yōu)勢[17]。此外，HRMRI不僅可以評判出斑塊的性質(zhì)，而且可以判斷出斑塊分型，并且可以顯示斑塊形態(tài)、斑塊體積，可以分析斑塊性質(zhì)、斑塊纖維帽、脂質(zhì)核心大小、斑塊鈣化、斑塊內(nèi)出血[18-19]。雖然高分辨磁共振成像能較準(zhǔn)確地分析斑塊的內(nèi)部組成，是目前判定斑塊性質(zhì)最好的無創(chuàng)檢查，但是高分辨磁共振成像對于設(shè)備要求較高、檢查時間長、價格較為昂貴，這限制了它在臨床上的普及。本研究發(fā)現(xiàn)，血清CTRP12、APN與磁共振成像技術(shù)確定的腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈斑塊個數(shù)、厚度和體積均呈負(fù)相關(guān)，提示血清CTRP12、APN具有代替磁共振成像技術(shù)用于評估腦動脈斑塊的潛力。進(jìn)一步分析可知[15,20]：動脈斑塊是由血液中的血脂加上局部炎癥細(xì)胞等物質(zhì)沉積在血管壁上而引起動脈血管壁變厚、血管變硬，所以脂質(zhì)代謝紊亂和慢性炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。而作為脂肪因子的CTRP12和APN不僅被證實參與脂質(zhì)代謝調(diào)控，而且被發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)控多個信號通路而抑制炎癥的發(fā)生，所以但CTRP12和APN在血清中的含量減少時，外周血脂代謝將出現(xiàn)異常以及炎癥反應(yīng)增高，進(jìn)一步導(dǎo)致動脈斑塊的形成和發(fā)展。

綜上所述，腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN的表達(dá)水平降低，并且其與磁共振成像檢測的腦動脈斑塊個數(shù)、厚度和體積均呈負(fù)相關(guān)，具有代替磁共振成像技術(shù)用于評估腦動脈斑塊的潛力。