輔酶Q10對(duì)小鼠腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

李寶福，劉柏麟，袁 興，郝璞珩，鄧齊奇，孫皖秦

(西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710100)

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH) 是指原發(fā)性非外傷性的腦實(shí)質(zhì)血管破裂出血，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞供血不足以及周圍神經(jīng)組織受壓，進(jìn)而引發(fā)一系列代謝及功能障礙[1]。ICH作為臨床工作中的一種常見的腦卒中亞型，病情兇險(xiǎn)，病死率、致殘率高，患者即使存活也會(huì)出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損害[2-4]。近年來，有研究報(bào)道ICH后繼發(fā)性腦損傷是影響存活患者生活質(zhì)量的重要因素[5]。因此，ICH后及時(shí)干預(yù)繼發(fā)性損傷對(duì)患者的最終預(yù)后有重要意義[6]。繼發(fā)性損傷包括顱內(nèi)血腫、腦水腫、炎性反應(yīng)、鈣超載、自由基反應(yīng)等[7]。既往研究[8]表明，ICH后血腫壓迫效應(yīng)及周圍組織的炎性反應(yīng)是造成繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一。輔酶Q10(CoQ10)作為呼吸鏈中不可或缺的遞電子體，亦是胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)[9-11]。研究[12-15]發(fā)現(xiàn)，CoQ10有著清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫等作用。但其在神經(jīng)保護(hù)及ICH后繼發(fā)性腦損傷方面的研究仍然較少，所得結(jié)論還不足以說明CoQ10的治療效果。本研究采用膠原酶注射法建立小鼠腦出血模型，研究CoQ10對(duì)ICH小鼠的神經(jīng)功能、周圍組織水腫及炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用無特定病原體級(jí)動(dòng)物C57WT小鼠54只，8周齡，體重20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司；立體定位儀購自北京眾實(shí)迪創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；CoQ10購于上海鼓臣生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 模型建立及分組 采用膠原酶注射法建立小鼠腦出血模型[16]。給予腹腔注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)麻醉，將麻醉后的小鼠剪開頭皮，暴露顱骨，于前囟前方0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm進(jìn)行顱骨鉆孔，小鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，垂直鉆孔入針，深度約3.5 mm,在小鼠基底神經(jīng)節(jié)的部位注射1 μl Ⅳ型膠原酶，在實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí)間處死模型小鼠，觀察其顱內(nèi)出血情況。將小鼠分為Sham組(Sham組小鼠只暴露顱骨，不進(jìn)行鉆孔和注射)、ICH組和CoQ10組，每組18只，其中6只用于檢測(cè)腦組織水含量和mNSS評(píng)分，6 只用于酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)炎癥因子水平，6只用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。CoQ10組腦出血模型建立6 h后，用30 mg/(kg·d)CoQ10灌胃，ICH組和Sham組用等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，共1周。過程中出現(xiàn)小鼠死亡要及時(shí)補(bǔ)充。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 模型建立7 d后，對(duì)三組小鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，分別從運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡、反射方面測(cè)試小鼠的神經(jīng)功能，不能完成某項(xiàng)測(cè)試項(xiàng)目則記1分，即得分越高，小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。mNSS評(píng)分為0～18分，0分為正常。

1.4 腦水含量計(jì)算 造模7 d給藥后，處死麻醉后小鼠，取出腦組織，立即稱量濕重，在120 ℃烘箱烘干至恒重，稱量干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重 ×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)腦組織炎癥因子表達(dá)水平 取損傷區(qū)周圍大腦皮層組織并勻漿，然后在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液用于檢測(cè)。根據(jù)制造商說明，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。先使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將樣品測(cè)得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算小鼠腦組織中IL-6及TNF-α水平。

1.6 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 灌注取腦后，將腦樣品浸泡在30%的蔗糖中，直至沉到底部。然后冰凍切片，切片厚度20 μm。4%的多聚甲醛在室溫固定 15 min后，用 PBS 在室溫漂洗三次×10 min。 然后切片在含 0.1% Triton-X-100 的 PBS 孵育15 min。 再次 PBS 室溫漂洗三次× 10 min，用5%的BSA封閉1 h。采用商業(yè)試劑盒進(jìn)行TUNEL染色，根據(jù)廠商說明，配制TUNEL溶液并避光孵育10 min，PBS清洗后用DAPI覆蓋切片，再次清洗、封片。切片在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞百分比。TUNEL陽性細(xì)胞百分比=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量×100%。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 于給藥7 d后進(jìn)行mNSS評(píng)分，結(jié)果顯示ICH組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯高于Sham組(P<0.001)，表明建模成功，而經(jīng)CoQ10治療的小鼠神經(jīng)功能缺損均得到明顯改善(P<0.05)，見圖1。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001；CoQ10組與ICH組比較，*P<0.05

2.2 三組小鼠腦水腫程度比較 于給藥7 d后通過小鼠腦組織干重濕重的測(cè)量值計(jì)算腦組織水含量從而評(píng)估小鼠腦水腫的程度，結(jié)果表明，與Sham組相比，ICH組腦水腫程度顯著增高(P<0.001)；與ICH組相比，CoQ10組腦水腫程度明顯降低(P<0.01)。見圖2。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與 CoQ10組比較，**P<0.01；CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

2.3 三組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡水平比較 TUNEL染色結(jié)果表明，ICH組小鼠TUNEL陽性細(xì)胞的百分比明顯高于Sham組(P<0.001)；而經(jīng)CoQ10治療好，其百分比要明顯下降(P<0.001)，表明CoQ10可減少腦出血小鼠的細(xì)胞凋亡。見圖3。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，***P<0.001

2.4 三組小鼠腦組織炎癥因子水平比較 與Sham組相比，ICH組小鼠腦組織IL-6、TNF-α的濃度明顯增高(均P<0.001)；給予CoQ10治療后，小鼠腦組織中炎癥因子濃度降低(均P<0.01)。見圖4、5。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

3 討 論

ICH是一種常見的有著較高致殘率和病死率的腦卒中類型，由于腦出血后腦損傷的發(fā)生，患者即使幸存，也多將面臨較低的生活質(zhì)量和較重的家庭、社會(huì)負(fù)擔(dān)[17]。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

ICH后的腦損傷大致可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷[18]。在原發(fā)性損傷中，出血量的多少?zèng)Q定著血腫對(duì)臨近腦組織的機(jī)械性壓迫程度，臨床上多采用手術(shù)清除血腫，然而這種方式并不能緩解治療腦出血后的繼發(fā)性損傷[19]。繼發(fā)性損傷機(jī)制復(fù)雜，包括血腦屏障損傷、腦水腫、細(xì)胞凋亡等，此外，炎性反應(yīng)也是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要機(jī)制之一，腦出血后，小膠質(zhì)細(xì)胞等中樞神經(jīng)固有的免疫細(xì)胞激活，釋放大量炎癥因子包括IL-6、TNF-α等，進(jìn)而引起瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響患者預(yù)后[18-19]。雖然近年來有大量的研究讓人們對(duì)腦出血后腦損傷的病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大提高，但仍然缺乏有效的診治手段以改善患者預(yù)后。因此，尋找有效的臨床措施以避免ICH后腦損傷非常有研究價(jià)值。CoQ10作為一種脂溶性醌類化合物，是胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，有著清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫等作用[12-15]。CoQ10可用于治療各種與細(xì)胞能量代謝不佳或氧化損傷相關(guān)的疾病，目前其已在神經(jīng)、心血管、免疫和腫瘤疾病方面發(fā)揮作用。例如，多種心血管疾病如高血壓、心力衰竭、心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化等均與CoQ10的缺乏有關(guān)，補(bǔ)充CoQ10可在一定程度上對(duì)這些疾病產(chǎn)生治療作用[20-22]。還有研究報(bào)道，CoQ10有希望用于神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病等，但其在神經(jīng)保護(hù)及ICH后繼發(fā)性腦損傷方面的研究仍然較少[23-24]。

本研究采用膠原酶注射法建立腦出血小鼠模型，在小鼠基底神經(jīng)節(jié)的部位注射 Ⅳ型膠原酶，該法建立的模型穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，且符合臨床患者病程的進(jìn)展[25]。接著我們研究了CoQ10對(duì)于腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。我們于腦出血小鼠模型建立后7 d進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，結(jié)果表明ICH組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯高于Sham組，而經(jīng)CoQ10治療的小鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于ICH組；此外，CoQ10組腦水腫程度也明顯低于ICH組，顯示CoQ10對(duì)腦出血小鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究CoQ10對(duì)腦出血后炎性反應(yīng)的影響，我們通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)了小鼠腦組織中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平，研究表明ICH組小鼠腦組織中IL-6、TNF-α的濃度明顯增高，這與過去的研究相印證，而給予CoQ10治療后，小鼠腦組織中IL-6和TNF-α濃度顯著降低，表明CoQ10治療可抑制腦出血后炎癥因子的產(chǎn)生，降低腦出血后的炎性反應(yīng)。最后我們進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，結(jié)果顯示相較于Sham組，ICH組細(xì)胞凋亡明顯增加，而CoQ10治療較ICH組可以減輕細(xì)胞的凋亡。我們的研究表明，CoQ10具有對(duì)腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用可能由CoQ10抑制小鼠腦出血后IL-6、TNF-α的釋放，進(jìn)而起到降低腦水腫程度，減少細(xì)胞凋亡等作用。

綜上，CoQ10可減輕腦出血小鼠神經(jīng)功能障礙，降低腦水腫程度，減少炎癥因子產(chǎn)生，改善細(xì)胞凋亡，其可能在腦出血后繼發(fā)性腦損傷方面發(fā)揮治療作用，但作用機(jī)制及臨床應(yīng)用范圍的還需要進(jìn)一步探索。