辛伐他汀對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠繼發(fā)性炎癥抑制作用及機制研究

李張珂，馬 濤，滿明昊，田 博

(1.西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院，陜西 西安 710100；2.空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710038)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是戰(zhàn)爭時期及現(xiàn)代社會生活中一種臨床常見創(chuàng)傷類型，具有發(fā)生率高、致殘率高和病死率高的特點[1]。TBI的病理過程包括原發(fā)機械性損傷與復雜的生化代謝機制改變而起的繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷即因外力所致的腦組織挫裂傷、出血和神經(jīng)元丟失等；繼發(fā)性損傷的病理機制，包括代謝毒物產(chǎn)生、氧化應激、炎性反應和細胞凋亡等[2]?，F(xiàn)有研究[3]表明，炎性反應與TBI后繼發(fā)性腦損傷的進展密切相關，對損傷的范圍與程度均有較大影響。因此，探索TBI后如何減輕繼發(fā)性炎性反應，對改善患者的臨床結局有重要的意義和價值。辛伐他汀是一種半合成的他汀類降脂藥物，由土曲霉素降解產(chǎn)物衍生而來，作為一種內(nèi)源性膽固醇抑制劑，可達到減少炎癥因子表達的效果，實現(xiàn)抗炎、抗凋亡、保護神經(jīng)功能、減少腦組織水腫的作用[4-5]。有研究[6]證實，辛伐他汀通過降低TLR4介導的NF-κB通路，進而抑制白細胞介素1β (IL-1β)表達水平，實現(xiàn)降低腦出血后過度炎性反應的效果。也有研究[7]發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對抑制平滑肌細胞增殖和轉移具有積極意義，能促使內(nèi)皮一氧化氮合成水平不斷上升，有效調(diào)節(jié)血管緊張度和內(nèi)皮功能，保護神經(jīng)細胞。而在對于顱腦疾病的作用中，有研究[8-9]表明，辛伐他汀在腦出血患者的神經(jīng)功能恢復過程中可以起到積極作用。然而，關于辛伐他汀在TBI后炎性反應的作用卻仍不明確。鑒于此，本研究通過觀察辛伐他汀對TBI小鼠預后的影響，探討辛伐他汀對于TBI的抗炎和神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 36只6～8周成年雄性C57小鼠，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，體重20～25 g。在室溫23～28 ℃、濕度45%～50%、12 h明暗交替環(huán)境中適應性飼養(yǎng)4周。辛伐他汀(鈉鹽形式)購自默克公司；各種手術器械購買自西安福鑫醫(yī)療科技有限公司；0.9%氯化鈉溶液購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；水合氯醛購自上海譜振生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和模型建立：將36只小鼠隨機均分成三組：損傷組(TBI組)、損傷后應用辛伐他汀組(DI組)和假手術組(Sham組)。各組均以10%的水合氯醛(10 mg)麻醉小鼠，手術區(qū)消毒剃毛，并沿中軸切開頭皮；在左頂葉上方開放直徑約3 mm的骨窗，放置墊片與直徑2 mm的撞針，在此期間注意保護硬膜的完整；進而對TBI組和DI組小鼠進行改良Feency自由落體撞擊造模，小鼠俯臥固定于撞擊器定位儀，40 g砝碼自35 cm沿長管自由落體撞擊撞針；止血后，清洗傷口后縫合頭皮。Sham組的小鼠僅以相同操作開骨窗后縫合，不進行打擊。若小鼠在暫發(fā)的呼吸暫停和四肢抽搐后持續(xù)昏迷2 h以上，則判斷此次造模成功。

1.2.2 藥物干預：選用羧甲基纖維素鈉(0.5%)配置1.5 mg/ml辛伐他汀溶液，4 ℃保存。判斷造模成功后，DI組小鼠立即通過腹腔注射給藥，用量為20 mg/kg，Sham組和TBI組小鼠在同一時間點注射等體積量的0.9%氯化鈉溶液，每24 h注射1次，連續(xù)7次。

1.2.3 神經(jīng)損傷評分：TBI后第1、3、7天對各組小鼠進行行為學評分，本研究采用神經(jīng)損傷評分(mNSS)，依照測試量表操作，滿分為18分，試驗小鼠所得評分越高即說明神經(jīng)損傷越重。

1.2.4 腦組織含水量檢測：每組中隨機取3只小鼠，處死后取左側腦半球，過程中注意剔除腦膜和血塊；稱重后于烤箱中60 ℃烤至質(zhì)量不再改變，再次稱重，含水量即為烘烤過程中的腦組織質(zhì)量之差占原質(zhì)量的百分比。

1.2.5 Western blot法檢測腦組織炎癥信號通路相關蛋白表達：腦創(chuàng)傷后7 d，每組各取3只小鼠，于腹腔注射超量的戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg)處死小鼠，分離以損傷處為圓心直徑約5 mm的皮質(zhì)區(qū)域，期間注意操作應快速進行；加入合適劑量的RIPA裂解液后完全勻漿，待樣本徹底變性后，取等量樣本進行電泳分離，等待溴酚藍位移到膠質(zhì)底部，而后電轉至孔徑為0.45 μm的硝酸纖維膜，即PVDF膜上；室溫下，采用5%的脫脂牛奶為封閉材料，封閉2 h；進而添加一抗(TBK1，1∶1000;TLR4，1∶2000)，置于4 ℃條件下孵育過夜；第2天，加入對應二抗，室溫下孵育2 h后發(fā)光拍照。

1.2.6 ELISA檢測腦組織IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達：于造模成功的第7天，從三組中各自隨機抽選3只小鼠，用過量的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)處死小鼠，在冰臺上，保證低溫條件，快速分離以損傷處為中心直徑5 mm皮質(zhì)區(qū)域；用ELISA試劑盒的規(guī)范步驟檢測腦組織TNF-α、IL-1β的表達。

1.2.7 免疫熒光檢測小膠質(zhì)細胞狀態(tài)：各組取3只小鼠，7 d 后鼠腦整體取出后放入4%多聚甲醛溶液固定12 h，分別用20%、30%蔗糖溶液對腦組織進行脫水至其可以沉于容器底部。冰凍切片厚度定為20 μm，于冰箱中-20 ℃保存，使用時復溫30 min。緩慢滴加0.3% Triton X-100溶液在切片表面，后選用10%驢血清封閉。一抗(封閉血清稀釋)混合后涂片，4 ℃層析過夜，與熒光素標記的二抗混合，然后涂片。室溫孵育2 h，并在避光環(huán)境下進行后續(xù)步驟。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min，共漂洗3次，最后滴加DAPI染液，對細胞核染色、封片、避光觀察。

2 結 果

2.1 辛伐他汀對TBI小鼠神經(jīng)行為學的影響 Sham組小鼠在TBI后第1、3、7天的mNSS評分改變差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相比于Sham組，TBI組和DI組小鼠的mNSS評分顯著升高(均P<0.001)，與TBI組小鼠相比，DI組小鼠的評分明顯降低(均P<0.001)，即辛伐他汀有改善小鼠的神經(jīng)功能的作用。見圖1。

注：各組兩兩比較，*P<0.05，△P<0.01，#P<0.001

2.2 辛伐他汀對TBI小鼠腦組織含水量的影響 相較于Sham組[(76.10±0.42)%]，損傷后TBI組小鼠腦組織含水量明顯上升[(87.38±3.12)%,P<0.001]；而對比TBI組辛伐他汀治療能夠顯著降低TBI小鼠腦組織含水量[(80.75±0.98)%,P<0.05]。見圖2。

注:各組兩兩比較，△P<0.01，#P<0.001

2.3 辛伐他汀對TBI小鼠腦組織中炎癥因子表達的影響 與Sham組比較,TBI組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β的表達上調(diào)(均P<0.001)；而對比TBI組，DI組的辛伐他汀治療可以降低小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β的表達(均P<0.01)。見圖3。

注:各組兩兩比較，△P<0.01，#P<0.001

2.4 辛伐他汀對TBI小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞活化的影響 術后7 d后對小鼠腦組織做免疫熒光檢測TBI后腦組織中小膠質(zhì)細胞的活化情況，與Sham組相比，TBI組小鼠損傷區(qū)周圍組織中出現(xiàn)了大量活化的小膠質(zhì)細胞，其特征為胞體較大突起變短，呈典型阿米巴樣；而DI組的小膠質(zhì)細胞相較TBI組數(shù)量上有明顯減少，且出現(xiàn)胞體變小突起變長的現(xiàn)象，即辛伐他汀抑制了小膠質(zhì)細胞的活化。見圖4。

圖4 三組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞形態(tài)比較(免疫熒光染色，×200)

2.5 辛伐他汀對TBI小鼠腦組織中炎癥信號通路相關蛋白表達的影響 與Sham組比較，TBI小鼠腦組織中TBK1、TLR4蛋白表達上調(diào)(均P<0.01)；相較于TBI組，DI組中的辛伐他汀治療可以降低炎癥信號通路相關的TBK1(P<0.01)、TLR4(P<0.05)蛋白含量。見圖5。

注:各組兩兩比較， *P<0.05，△P<0.01

3 討 論

既往報道顯示，神經(jīng)炎性反應的機制包括腦組織中膠質(zhì)細胞激活、外周循環(huán)炎癥細胞浸潤和炎癥細胞因子(如趨化因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子)等介質(zhì)的釋放；在組織受損初期，適當?shù)难仔苑磻軌蚯宄龎乃赖慕M織細胞，為神經(jīng)修復提供相宜的微環(huán)境，起到神經(jīng)保護的作用[10]。然而，研究證據(jù)進一步揭示，隨著小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的持續(xù)異?；罨∧z質(zhì)細胞能夠通過CD14依賴途徑對神經(jīng)元直接產(chǎn)生毒性作用，而被激活的星形膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)，通過分泌TNF-a、IL-6、ApoE以及S100β蛋白等胞外酶加重炎性反應，造成神經(jīng)組織的進一步損傷；失控的神經(jīng)炎性反應可加重TBI繼發(fā)的腦組織水腫，導致顱內(nèi)壓升高，影響腦組織的供血情況，進而壓迫正常的神經(jīng)組織，最終導致神經(jīng)元死亡，限制傷后機體的恢復和相關功能的預后[11-13]。因此，TBI后抑制或減輕炎性反應對于患者神經(jīng)功能的保護及臨床結局有著重要的意義[14]。

辛伐他汀作為內(nèi)源性膽固醇抑制劑，是一種臨床上常用的他汀類降脂藥，研究[6，15-18]發(fā)現(xiàn)，其可改善血管內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、改善高血脂高血壓、調(diào)節(jié)骨代謝水平、降低哮喘癥狀和抑制炎性反應。還有研究[19]證實，辛伐他汀能夠顯著降低IL-1、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表達水平，具有改善阿爾茨海默小鼠的學習與記憶能力的作用。在急性腦梗死患者治療中，辛伐他汀也有顯著的療效，可明顯地降低患者神經(jīng)功能損傷程度，改善患者的臨床結局[20]。此外，辛伐他汀對腦動脈粥樣硬化患者具有降低炎性因子水平的作用，并且在臨床上聯(lián)合抗栓治療干預腦梗死效果顯著，能夠明顯降低血脂和炎性因子含量[21-22]。然而，有關辛伐他汀對TBI后繼發(fā)性炎性反應的治療作用仍然缺少相關實驗研究，因此，本實驗通過研究辛伐他汀對于TBI后炎性反應相關因素的影響，探討辛伐他汀對于TBI后炎性反應的抑制作用及機制。

本研究中，我們通過比較Sham組、TBI組和DI組中小鼠造模手術后第1、3、7 天的mNSS評分發(fā)現(xiàn)，造模手術后，TBI組、DI組的神經(jīng)功能受到明顯損害；而在用藥后DI組mNSS評分較TBI組有所降低，說明辛伐他汀對小鼠的神經(jīng)功能起到了一定的保護作用；進一步檢測各組小鼠腦組織含水量，結果顯示，相較于Sham組，TBI組的小鼠腦組織含水量有明顯升高，而辛伐他汀干預后，DI組小鼠的腦組織含水量明顯降低；此后我們以ELISA法對各組小鼠腦組織中炎癥因子的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)TBI組與DI組小鼠的TNF-α、IL-1β的表達水平較Sham組明顯上調(diào)，對比TBI組與DI組數(shù)據(jù)，顯示辛伐他汀的干預同時下調(diào)了該兩種主要炎癥因子TNF-α、IL-1β在DI組小鼠組織中的表達水平；進一步利用免疫熒光法觀察了各組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞的活化程度，結果證實，與TBI組相比，應用辛伐他汀干預后，DI組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)明顯發(fā)生改變，其胞體變小，突起變長，提示應用辛伐他汀后可有效抑制損傷后小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)；最后，我們以Western blot法探究炎癥信號通路相關蛋白TBK1、TLR4在受損組織中的表達，數(shù)據(jù)表明，相較于Sham組，TBI組與DI組的小鼠腦組織的蛋白表達明顯升高，對比TBI組，DI組小鼠的受損區(qū)域腦組織中TBK1、TLR4蛋白表達顯著降低。

綜上所述，本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制TBI后小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，下調(diào)TBK1、TLR4等炎癥信號通路相關蛋白表達，進一步降低下游TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，抑制了過強的炎性反應，從而有效降低TBI小鼠mNSS評分，保護了小鼠傷后的神經(jīng)功能，提高了小鼠的運動能力，其分子機制可能是通過降低TBI小鼠腦組織中TBK1、TLR4蛋白的表達水平實現(xiàn)。接下來的研究工作，應繼續(xù)探索辛伐他汀作為TBI的治療手段應用臨床的可行性，以及相應的施藥時機、使用劑量、持續(xù)時間對TBI后繼發(fā)炎性反應療效的影響，以期早日服務于臨床實踐。