紫杉醇促進(jìn)心肌細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上調(diào)HO-1表達(dá)預(yù)防再灌注損傷的機(jī)制研究

周 樂(lè)，徐佩爾，鄭玉婷，陸瑾玥，顧佳妮，胡 牽，宮悅?cè)A，顏雪蕓，曹華明

(1.上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院心內(nèi)科，上海200435;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教育基地,上海201203)

據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，缺血性心臟病是全球第一主要死因。心肌缺血組織的及時(shí)再灌注是治療干預(yù)的關(guān)鍵步驟。然而，突然再灌注可導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌損傷，稱為心肌缺血/再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷[1-3]。MI/R的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)鈣過(guò)載、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損傷、細(xì)胞凋亡和自噬、炎癥等[4]。在MI/R損傷后的心臟功能障礙期間，氧化應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生有害影響。氧化應(yīng)激是高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮、超氧陰離子、羥基自由基和過(guò)氧亞硝酸鹽的過(guò)度積累或去除不足導(dǎo)致的[5-6]。在心臟正常生理?xiàng)l件下，98%耗氧用于產(chǎn)生三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，缺氧情況下，心肌能量代謝發(fā)生紊亂，ATP生成不足并迅速耗竭，并產(chǎn)生大量ROS。ROS的過(guò)度產(chǎn)生和積累不僅會(huì)引起線粒體膜氧化損傷，還會(huì)誘導(dǎo)微管等細(xì)胞骨架的破壞。心肌細(xì)胞中的微管可以通過(guò)某些陰離子通道控制線粒體外模對(duì)代謝物的通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝[7]。微管若損傷，不能對(duì)心肌細(xì)胞起到支撐定型作用，會(huì)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成極大的損傷，降低心肌細(xì)胞穩(wěn)定性，增加細(xì)胞脆性。導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡等[8]。因此，抑制氧化應(yīng)激可能對(duì)預(yù)防MI/R具有重要意義。

有研究[9-10]表明，紫杉醇(Paclitaxel,PTX)能夠作為微管穩(wěn)定劑，能夠抑制微管解聚，減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。而血紅素加氧酶(Heme oxygenase，HO)是血紅素降解的限速酶，HO通過(guò)對(duì)催化血紅素環(huán)裂解形成亞鐵、一氧化碳和膽綠素的過(guò)程進(jìn)行限速來(lái)保護(hù)細(xì)胞，防止MI/R損傷。HO有三種異構(gòu)體，其中HO-1 受到多種生理和病理生理刺激的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，包括血紅素、炎性細(xì)胞因子和一氧化氮等。Lee等[11]的研究證實(shí)，HO-1的調(diào)控與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路密切相關(guān)，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)和氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和 p38 MAPK 途徑。而MAPK在細(xì)胞過(guò)程中影響細(xì)胞的增殖、應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡和免疫防御[12]。因此本次研究旨在探討促進(jìn)心肌細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上調(diào)HO-1表達(dá)是否能夠預(yù)防心肌的再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只6周齡雄性SD大鼠，體重230～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司[生產(chǎn)使用合格證號(hào)：SCXK(京)2018-0013]。使用標(biāo)準(zhǔn)籠和常規(guī)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)用鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2 心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建 大鼠腹腔注射0.2 ml/100 g戊巴比妥鈉麻醉后，迅速?gòu)拇笫篌w內(nèi)分理出心臟置入0 ℃ K-H緩沖液中漂洗停跳。然后將心臟快速固定于 Langendorff灌流裝置，進(jìn)行主動(dòng)脈常氧恒流灌流。灌流液采用95% O2和5% CO2鼓泡式氧合的K-H緩沖液，灌注壓維持75 mmHg，pH=7.35～7.45，37 ℃持續(xù)20 min。平衡灌注后觀察心臟搏動(dòng)情況[13]，對(duì)于符合《離體心臟缺血再灌時(shí)間與損傷模型的合理評(píng)價(jià)》[14]入選標(biāo)準(zhǔn)的大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。對(duì)于心肌缺血再灌注大鼠進(jìn)行前降支結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈30 min誘導(dǎo)缺血。若冠脈流量降低25%則說(shuō)明結(jié)扎成功阻斷血流[15]。

1.3 分組和干預(yù) 30只大鼠被隨機(jī)均分為對(duì)照組、缺血組和PTX組，每組共10只大鼠。對(duì)照組：20 min平衡期后，接受常氧灌注120 min；缺血組：20 min平衡期后，進(jìn)行30 min缺血前降支結(jié)扎，隨后接受常氧灌注120 min；PTX組：20 min平衡期后，進(jìn)行30 min缺血前降支結(jié)扎，隨后加入就含有1 μmol/L的PTX常氧灌注液灌注120 min。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 微管損傷檢測(cè)：灌流結(jié)束時(shí)用高碘酸賴氨酸多聚甲醛固定劑灌注心肌組織，然后剪下左心室肌在PBS中清洗，制成冰凍切片并進(jìn)行微管和肌絲蛋白雙染色。加入1∶300 稀釋的單克隆抗體-β微管蛋白抗體及1∶300 稀釋的熒光異硫氰酸酯標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白進(jìn)行溫育。其他切片在室溫下用1∶70稀釋的鬼筆環(huán)肽溫育20 min，然后用PBS沖洗。在熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.4.2 信號(hào)通路的藥理學(xué)抑制實(shí)驗(yàn)：為了研究PTX治療有效的相關(guān)分子機(jī)制，另選30只大鼠隨機(jī)分為三組：缺血組2組、PTX2組 (1 μmol/L) 和秋水仙堿組(1 μmol/L)，每組10只。用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉動(dòng)物。同1.2方式進(jìn)行造模。將三組大鼠灌流液中分別加入1 μmol/L的JNK抑制劑JNK-IN-8、10 μmol/L的 p38 MAPK抑制劑Adezmapimod、10 μmol/L的MEK1抑制劑AZD6244。再灌注結(jié)束后，迅速分離心肌組織，收集心肌細(xì)胞在室溫下被儲(chǔ)存在含1 μmol/L氯化鈣的臺(tái)氏液中。溫育后，用PBS沖洗，然后用含有蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解。用BCA蛋白定量分析試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行分析，等量的總細(xì)胞裂解物通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離，然后轉(zhuǎn)移到聚乙烯膜PVDF上。室溫下封入BSA封閉液(5% PBS緩沖液+0.1%吐溫20)1 h。加入初級(jí)抗體，在室溫下按1∶1000～1∶2000 的體積比，將適當(dāng)次級(jí)抗體加入PBS+0.1%吐溫20中1 h，用通過(guò)ECL試劑盒探測(cè)信號(hào)。

2 結(jié) 果

2.1 PTX降低微管缺血損傷 通過(guò)免疫組織化學(xué)分析微管形態(tài)(圖1)。在對(duì)照組中可見(jiàn)微管結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯斷裂；在缺血組中可見(jiàn)微管連續(xù)中斷，微管斷裂；在PTX組中可見(jiàn)微管結(jié)構(gòu)基本完整，但微管稍有粗亂。表明PTX能夠降低微管缺血損傷。

圖1 對(duì)照組、缺血組和PTX組的微管形態(tài)結(jié)構(gòu)(免疫熒光，×400)

2.2 PTX能夠誘導(dǎo)微管蛋白表達(dá)并可能通過(guò)激活JNK途徑誘導(dǎo)心臟心肌細(xì)胞中HO-1基因表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡分析缺血2組、PTX2組以及秋水仙堿組大鼠心肌細(xì)胞中微管蛋白和HO-1 相關(guān)基因的表達(dá)(圖2)。PTX2組微管蛋白的表達(dá)水平明顯高于的缺血2組和秋水仙堿組，秋水仙堿處理過(guò)的微管蛋白的表達(dá)水平最少。通過(guò)密度分析來(lái)量化蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平在三種MAPK(ERK、JNK、p38)中的活性，只有JNK磷酸化水平在PTX組中被顯著誘導(dǎo)，在秋水仙堿組中降低。這表明PTX可能借助JNK1信號(hào)誘導(dǎo)增加HO-1表達(dá)而保護(hù)心臟心肌細(xì)胞抵御MI/R損傷。

注:與缺血2組比較，*P<0.05

2.3 PTX激活JNK誘導(dǎo)HO-1表達(dá) 見(jiàn)圖3。

注:與PTX-Adezmapimod組比較，*P<0.05

AZD6244、Adezmapimod和JNK-IN-8 三種MAPK抑制劑分別用來(lái)研究被PTX激活的JNK是否調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)。發(fā)現(xiàn)AZD6244和Adezmapimod沒(méi)有改變PTX誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。相比之下，JNK-IN-8顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)。表明PTX通過(guò)激活JNK來(lái)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。

3 討 論

缺血缺氧會(huì)引起細(xì)胞離子通道改變、鈣超載，破壞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨架蛋白損傷或缺失，在缺氧或缺血期間，細(xì)胞骨架的紊亂引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性改變。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞重建過(guò)程中，細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白和離子通道蛋白的表達(dá)上調(diào)。 Wei等[16]研究證明增加熱休克蛋白的表達(dá)，能夠與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合并穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架，從而心肌增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)MI/R的抵抗力[17-18]。

p38MAPK、ERK1/2和JNK三種激酶是絲裂原活化蛋白激酶重要組成部分，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)時(shí)有著十分重要的作用，其廣泛存在于細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、分裂死亡以及細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)信號(hào)的變化過(guò)程中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和死亡等生物過(guò)程[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，JNK和p38MAPK的激活會(huì)促使細(xì)胞凋亡，而ERK1/2的激活會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在心臟心肌細(xì)胞中PTX能激活被證實(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的JNK，介導(dǎo)HO-1表達(dá)。JNK-IN-8(JNK特異性抑制劑)，能顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)作為微管穩(wěn)定劑能有效地減少M(fèi)I/R損傷時(shí)的ROS水平，這與以前的研究結(jié)果一致。線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ是產(chǎn)生細(xì)胞ROS的主要來(lái)源，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTX能顯著保護(hù)缺血時(shí)這兩種酶活性。此外，既往研究中，發(fā)現(xiàn)HO-1能顯著增加大腦對(duì)缺血性氧化應(yīng)激的抵抗[21]，HO-1的過(guò)表達(dá)也顯示出對(duì)MI/R損傷的保護(hù)作用。本研究中，我們對(duì)缺血時(shí)PTX是否誘導(dǎo)HO-1進(jìn)行了研究，結(jié)果證實(shí)缺血時(shí)PTX能誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。JNK-IN-8，一種JNK特異性抑制劑，能顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)，這或許是PTX在MI/R損傷期間能保護(hù)但不能殺死心臟心肌細(xì)胞的原因之一。

在MI/R中，細(xì)胞骨架損害會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂和誘發(fā)凋亡，因此從保護(hù)細(xì)胞骨架穩(wěn)定或加強(qiáng)受損細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白的修復(fù)來(lái)進(jìn)行心臟保護(hù)，可能是今后治療缺血型心臟病的有效靶點(diǎn)及研究方向。對(duì)進(jìn)一步探討心肌缺血的機(jī)制研究具有重要意義。