豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用

楊 俊，聶福平，王 昱，史梅梅，謝曉倩，王國民，李賢良，吳 蕊，張 歡，唐昌杰，李應(yīng)國

(重慶海關(guān)技術(shù)中心，重慶 400020)

豬瘟，又被稱為古典豬瘟(classical swine fever,CSF)、爛腸瘟，是一種感染了豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)而引起的高度接觸性的急性傳染病。該病流行廣泛，發(fā)病率和死亡率高，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的通報(bào)類傳染病[1]，在我國《進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》中列為一類傳染病。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，在較低溫度下，15～30 min即可完成檢測，具有反應(yīng)條件溫和、擴(kuò)增效率高的優(yōu)點(diǎn)，并且通過在反應(yīng)體系中加入熒光探針可實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增對象的實(shí)時(shí)檢測。該研究基于RPA檢測技術(shù)，針對CSFV基因組的5′端非編碼區(qū)高度保守序列設(shè)計(jì)并合成了特異性的引物和exo探針，成功建立了實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測豬瘟病毒的方法，以期為豬瘟快速診斷提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1毒株。豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)疫苗株(石門株)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis，TGEV)(IND型)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)(AP76)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)(SH0165)、豬肺炎支原體(mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)(168-L)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)(BIAH-001)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine cirovirus Type 2，PCV-2)(PM167)、豬水皰病病毒(swine vesieular virus，SVDV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)疫苗株(cp99)，由重慶海關(guān)技術(shù)中心動物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit、Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit、PMDTM19-T Vector Cloning kit、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification kit,購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；Twist Amp exo kit,購自英國Twist Dx 公司。

1.1.3主要儀器。Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(英國OptiGene)；NanoDrop oneC 微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo Scientific);Veriti 96多功能梯度PCR儀器(美國Applied Biosystems);GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad);Centrifuge 5417R高速離心機(jī)(德國Eppendorf)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物和探針。CSFV 5′NTR由360～374個(gè)堿基組成，具有高度保守性。該研究選擇該部分序列作為擴(kuò)增對象，從NCBI下載CSFV基因組5′NTR序列進(jìn)行分析，參考Twist Amp exo kit關(guān)于RPA引物和exo探針的設(shè)計(jì)要求，利用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)RPA引物和exo探針，委托TAKARA公司合成。引物及探針序列如下：CSFV-RPA-F：5′-GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGAC-3′；CSFV-RPA-R：5′-CTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGA-3′；CSFV-RPA-P：5′-GTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGTTCTAAGT(FAM)-(THF)CT(BHQ1)-GAGTACAGGACAG-(P)-3′；其中，F(xiàn)AM為羧基熒光素，THF為四氫呋喃，BHQ1為黑洞猝滅劑 1，P為磷酸鹽基團(tuán)。

1.2.2病毒核酸的提取。使用TaKaRa公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒分別提取CSFV、TGEV、PRRSV、SVDV的RNA以及PCR-2和PPV的DNA，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取APP、HPS和Mhp的DNA，以上操作過程均在生物安全柜中進(jìn)行。RNA提取完成后立即使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。cDNA和DNA均置-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建。CSFV核酸RNA提取后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以該cDNA作為模板，用設(shè)計(jì)的CSFV RPA引物(CSFV-RPA-F/CSFV-RPA-R)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定得到預(yù)期大小的擴(kuò)增子并回收，連接到PMDTM-19T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從陽性克隆中提取質(zhì)粒，利用紫外可見核酸蛋白分析儀(NanoDrop oneC) 測定其濃度，根據(jù)公式：拷貝數(shù)=[濃度(ng/μL)×6.02×1023×10-9]/(DNA長度×660)計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化。Twist Amp exo kit提供的反應(yīng)管中已經(jīng)預(yù)混了各種酶，按其說明書要求，向反應(yīng)管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、ddH2O 8.2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL，10 μmol/L探針0.6 μL，模板5 μL，向反應(yīng)管的蓋子中加入Mg2+2.5 μL，蓋上蓋，瞬時(shí)離心后立即將反應(yīng)管置于OptiGene Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，分別在35、37、39、40、42 ℃下反應(yīng)40 min，根據(jù)擴(kuò)增曲線，確定最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA特異性試驗(yàn)。RPA引物長度為30～35 nt，exo探針長度為46～52 nt，比普通PCR和熒光定量PCR的引物、探針都更長，理論上具有更高的特異性。為了驗(yàn)證CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA的特異性，選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、PCV-2、SVDV、PPV的cDNA或DNA作為模板，以無菌去離子水作為陰性對照，在確定的最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行檢測，評價(jià)方法的特異性。

1.2.6CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA敏感性試驗(yàn)。為測試CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的敏感性，將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒并測定濃度，計(jì)算拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，取各個(gè)稀釋度的質(zhì)粒分別作為模板，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RPA擴(kuò)增，確定該方法的最低檢出限。

1.2.7臨床樣品檢測。從重慶某養(yǎng)豬場采集20份血清樣本、5份淋巴結(jié)樣本、5份肝臟樣本和3份腎臟樣本，分別提取核酸，用建立的CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行豬瘟病毒核酸檢測，以評價(jià)其在實(shí)際檢測中的效果，同時(shí)，采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16551—2020對所有樣本進(jìn)行豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，比較2種方法的符合性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備將CSFV擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取含有CSFV核酸片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，插入的核酸片段大小為124 bp，與預(yù)期一致，與CSFV具有高度同源性，相似度達(dá)到99%以上。經(jīng)紫外可見核酸蛋白分析儀測定，該質(zhì)粒濃度為25.5 ng/μL，A260/A280值為1.87，計(jì)算出拷貝數(shù)為8.3×109copies/μL。

2.2 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化將配制好的反應(yīng)體系分別在35、37、39、40、42 ℃下進(jìn)行RPA反應(yīng)，檢測熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，隨著反應(yīng)溫度升高，檢測到熒光信號所需的時(shí)間更短，且最終的熒光強(qiáng)度也更高，但當(dāng)反應(yīng)溫度超過39 ℃后，熒光信號反而出現(xiàn)下降；隨著時(shí)間延伸，熒光信號不斷積累，但30 min以后，熒光強(qiáng)度不再升高，說明反應(yīng)進(jìn)入平臺期。綜上，CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為39 ℃、30 min。

圖1 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的優(yōu)化

2.3 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA特異性試驗(yàn)為了驗(yàn)證CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的特異性，選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、SVDV、PPV、PCV-2等豬場常見的豬病作為研究對象，提取核酸后分別用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，CSFV陽性樣品在反應(yīng)開始6 min后熒光強(qiáng)度逐漸升高，相比之下，其他樣本和陰性對照在30 min之內(nèi)都無熒光信號產(chǎn)生，說明該方法對上述除CSFV之外的常見豬病病原無反應(yīng)，特異性良好。

注：1.豬瘟病毒;2～10.豬傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬水皰病病毒、豬細(xì)小病毒、陰性對照

2.4 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA敏感性試驗(yàn)經(jīng)測定CSFV重組質(zhì)粒濃度為8.3×109copies/μL，將該質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，取每個(gè)稀釋度的質(zhì)粒5 μL分別作為模板，用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖3)，隨著質(zhì)粒濃度的降低，能夠檢測到熒光信號的時(shí)間也隨之延后，而且最終的熒光信號強(qiáng)度也相應(yīng)降低，當(dāng)CSFV重組質(zhì)粒濃度降至8.3×102copies/μL 以下，檢測不到熒光信號，因此，該CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法最低檢出限為8.3×102copies/μL，靈敏度較好。

注:1～6為8.3×107～8.3×102 copies/μL

2.5 臨床樣品檢測從重慶某養(yǎng)豬場采集了33份樣本，同時(shí)使用建立的CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法對這些樣本進(jìn)行豬瘟病毒核酸檢測，結(jié)果顯示(表2)，RPA方法從20份血清樣本中檢出2份CSFV核酸陽性，從5份淋巴結(jié)樣本中檢出2份CSFV核酸陽性，從5份肝臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性，從3份腎臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性，與國家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果完全一致。

表2 豬瘟病毒臨床樣本檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

我國于1954年研制出豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)，并大規(guī)模地進(jìn)行疫苗接種，現(xiàn)成功控制了該病的大流行，但目前豬瘟仍呈散發(fā)流行的新態(tài)勢，增大了豬瘟防控的難度。此外，家豬和野豬都是CSFV的宿主，野豬可能在CSF的流行和傳播中發(fā)揮重要作用。即便某地區(qū)的家豬中已經(jīng)根除了CSF，如果同地區(qū)的野豬群中仍有該病流行，仍有可能將病毒傳入養(yǎng)殖場中[2]。

快速可靠的診斷對于及時(shí)實(shí)施CSFV控制措施至關(guān)重要，由于目前豬瘟常以非典型形式出現(xiàn)，且癥狀與豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病、豬細(xì)小病毒等相似，因此，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測來確診該病。CSFV的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有RT-PCR試驗(yàn)[3-11]，該技術(shù)目前已比較成熟，有許多商品化的CSFV核酸檢測試劑盒可供選擇。為了實(shí)現(xiàn)CSF的現(xiàn)場檢測，有研究人員開發(fā)出了便攜RT-PCR系統(tǒng)[12]、引物-探針能量轉(zhuǎn)移 RT-qPCR系統(tǒng)[13-14]等。為了替代PCR的熱循環(huán)模式還誕生了很多等溫?cái)U(kuò)增方法，如恒溫隔絕式RT-qPCR[15]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)[16-21]和RPA；CSFV也可以通過傳代細(xì)胞系，如豬腎細(xì)胞系PK15或SK6上培養(yǎng)分離而得到確診，但病毒分離對環(huán)境潔凈度要求極高，需要非常熟練的試驗(yàn)人員來操作，容易發(fā)生污染導(dǎo)致試驗(yàn)失??；此外，還可以使用血清學(xué)的方法來診斷CSFV，如熒光抗體或免疫過氧化物酶測定法等[22-23]，但有研究指出，同屬的牛病毒性腹瀉病毒-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea-mucosal dicease virus,BVDB)和綿羊邊界病病毒(border disease virus,BVD)在抗原性上與CSFV存在交叉反應(yīng)，這2種病毒都能夠感染豬，而且抗體水平通常比CSF高[24]。因此，血清學(xué)的方法在檢測豬瘟病毒方面存在敏感性低、特異性差的問題，僅適用于發(fā)病豬的檢測[25]。

RPA最早由Niall Armes于2006年提出，該技術(shù)包含3種核心蛋白、重組酶(T4 UvsX protein)、重組酶加載因子(T4 UvsY)和單鏈結(jié)合蛋白(T4 gp32)。重組酶在重組酶加載因子的協(xié)助下，尋找并侵入同源序列形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動鏈置換反應(yīng)，DNA聚合酶(Bsu或Sau)則在引物的3-OH端開始合成一條與父鏈完全一樣的子鏈，最后，實(shí)現(xiàn)類似PCR結(jié)果的目標(biāo)DNA指數(shù)擴(kuò)增。相比PCR技術(shù)，RPA的技術(shù)優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：①反應(yīng)效率高，節(jié)省時(shí)間。RPA反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，明顯減少循環(huán)加溫和降溫的等待時(shí)間；反應(yīng)具有高度的并行性，一條鏈上可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)聚合酶的擴(kuò)增。②對儀器設(shè)備的要求低，適合田間、基層實(shí)驗(yàn)室等開展核酸檢測和研究。相比其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、信號介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)(SMART)、依賴解旋酶核酸擴(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等，RPA同樣優(yōu)勢明顯，具體表現(xiàn)在：①對核酸類型無要求，可以實(shí)現(xiàn)對DNA或RNA信號的放大，而NASBA只能擴(kuò)增RNA。②容易掌握，僅需設(shè)計(jì)一對稍長的特異引物(30～35 mer)即可進(jìn)行RPA試驗(yàn)，也可以再設(shè)計(jì)一條帶熒光標(biāo)記的探針實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測；而LAMP 技術(shù)需要多對引物，設(shè)計(jì)難度高，要篩選出合適的引物需要耗費(fèi)大量工作。③RPA的產(chǎn)物是雙鏈DNA分子，可以利用許多PCR平臺成熟的試劑和技術(shù)進(jìn)行分析；LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物是一些大小不等的片段,對下游技術(shù)限制較大，無法進(jìn)行直接克隆和測序，只能用于判斷目的基因的存在，這也是LAMP方法最大的局限性。正因?yàn)镽PA的上述優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)自問世以來深受廣大科研工作者喜愛，被稱為有望替代PCR的新一代型核酸檢測技術(shù)，在疫病診斷方面得到廣泛應(yīng)用。楊俊等[26]建立了綿羊痘病毒和山羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，為綿羊痘病毒和山羊痘病毒的鑒別診斷提供了技術(shù)支持；Abd等[27]基于RPA技術(shù)，建立了可以檢測所有的7個(gè)口蹄疫病毒血清型的方法；Wang等[28]建立了PCV2實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法，靈敏度比普通PCR高10倍；王建昌等[29]針對非洲豬瘟病毒VP72保守基因序列建立的RPA檢測方法，在38 ℃恒溫反應(yīng)30 min即可獲得檢測結(jié)果。

該研究在開展過程中也發(fā)現(xiàn)RPA存在的不足，如擴(kuò)增片段不能太長，超過500 bp則會明顯降低其擴(kuò)增效率，甚至無法擴(kuò)增出目的片段；其次，由于其所需反應(yīng)溫度溫和、反應(yīng)速率快，往往在加樣過程中擴(kuò)增就已經(jīng)開始，無法控制擴(kuò)增起始時(shí)間，暫時(shí)無法實(shí)現(xiàn)熒光PCR的定量檢測功能，但對于定性檢測無任何影響。

該研究基于RPA檢測技術(shù)，針對CSFV 5′UTR高度保守的序列，設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法，實(shí)現(xiàn)了CSFV的快速診斷。該方法與APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV、SVDV、TGEV、PPV無交叉反應(yīng)，檢出限達(dá)到8.3×102copies/μL，特異性好，敏感性高，為CSFV的快速、準(zhǔn)確診斷提供了強(qiáng)有力的工具。