一個新合成化合物對煙草誘抗煙草花葉病毒的影響

崔順艷，王 悅，辛雪成，張文軍，魏婷婷

(沈陽化工研究院有限公司，遼寧沈陽 110021)

植物體內的免疫機制，如同人類注射疫苗，經(jīng)誘導因子處理后，植物體內的免疫體系被快速激活來防御外源病原體的侵染。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是一種RNA病毒，在煙草生長過程中，一類最為普遍發(fā)生的病害，對煙草質量造成嚴重影響。近年來，各國學者對TMV的防治進行了大量研究，與化學藥劑防治措施相比，作物免疫調控抗病有諸多優(yōu)點，引起各界的廣泛重視。茉莉酸甲酯是一種植物生長調節(jié)劑，對植物的生長發(fā)育極為重要，涉及多種生理過程，如生長、發(fā)育、代謝等，且是植物抗病信號的傳遞體之一[1 - 2]。禹艷紅等[3]研究表明用茉莉酸甲酯處理,能提高抵抗黃瓜花葉病毒的侵染，還指出煙草對黃瓜花葉病毒的抗性與SOD活性有較強的相關性。賓金華等[4]指出茉莉酸甲酯的施用能明顯提高煙草的LOX活性、病源相關蛋白含量等，這些指標的變化與提高抗性密切相關。

筆者研究了新合成的化合物——茉莉酸甲酯類似物B2對TMV侵染煙草的抑制效果，通過測定調控茉莉酸信號途徑的NtRab11基因、茉莉酸信號通路中的關鍵基因COI1、植物抗病基因PR-1a和PR-1b的相對表達量探討了新合成化合物B2的誘導抗病機制。

1 材料與方法

1.1 材料供試品種為普通煙NC89; 煙草花葉病毒(TMV)由沈陽中化農藥化工研發(fā)有限公司生測研發(fā)部提供。

試驗藥劑為新合成的化合物，為N-(4-甲基苯基)-2-(3-氧代-2-戊基環(huán)戊基)乙酰胺。該化合物為茉莉酸甲酯類似物，因此該研究選取茉莉酸甲酯作為陽性對照藥劑，其結構式見圖1。

圖1 茉莉酸甲酯結構式

1.2 方法

1.2.1試驗前處理。將新化合物B2和陽性對照藥劑——茉莉酸甲酯先用二甲基亞砜溶解，然后配制成500 mg/L的溶液，選取長勢一致的5 ～ 6片葉齡的煙草植株上施藥，對照噴灑清水。

于藥劑處理3 d后接種煙草花葉病毒，每株接種施藥葉片以上的第一片葉片。接種方法為摩擦接種，制備接種毒液：稱取1 g新鮮帶病毒葉片，以100 mL (pH 7.0) 的磷酸緩沖液進行研磨，然后過4層紗布即得濾液，接種時加入少量60目的石英砂，用手指蘸取少量接種液，在煙草葉片正面輕輕摩擦，力度掌握在剛剛能在葉面造成微傷口即可，每個處理8個平行樣，2次重復，將接種后的植株放置在日光溫室中培養(yǎng)。分別于接種病毒7、10和13 d后按照煙草病害分級及調查方法(YC/T 39—1996)進行調查，計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)計算公式：

式中,X為病情指數(shù)，Ni為各級病葉數(shù)，i為相對級數(shù)，N為調查總葉數(shù)。

1.2.2煙草花葉病毒含量測定。TMV接種后，分別于5、6、7、8、9 d取不同處理的煙草葉片，用液氮進行研磨勻質后，稱取0.2 g，利用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物)測定TMV含量。

1.2.3酶活性測定。TMV接種后，分別于0、2、4、6、8、10 d取不同處理的煙草葉片，用液氮研磨成粉末狀態(tài)，稱取1 g，加入各自待測酶的緩沖液研磨勻質后，離心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)，上清液測定酶活性。按照宋鳳鳴等[5]的方法測定超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性,參照Koch等[6]方法測定脂氧酶(Lipoxygenase，LOX)活性。

1.2.4RNA 提取和qRT-PCR測定相關基因的表達。B2處理后，在24、48、72 h 取不同處理的煙草葉片，用液氮處理后，保存在-80 ℃冰箱中，以備檢測相關基因的表達。

總RNA按照 TRIzol試劑盒(Invitrogen,San Diego,CA)的用戶手冊提取，并根據(jù)Super Smart cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser) 的說明反轉錄cDNA。qRT-PCR在CFX Connect1M Real-Time System (Bio-Rad,USA) 根據(jù) SYBR Green I Master mix kit (Takara)的說明進行。以β-actin為內參， 采用2-△△CT法計算相對表達水平。使用的基因特異性引物：對于NtCOI1,5′-TGCTTGACCGAGAGGAGAGA-3′ 和5′-CGCCCGACATAACTGAGACC-3′; 對于acidicPR-1,5′-GTCCATACTAATTGAAACGACCTAC-3′和 5′-CCACTTCAGAGGATTACATATATAGTAC-3′; 對于basicPR-1,5′-TTTTGGTGGTATTATGGAGGTGTG-3′和 5′-ACAATTAACTGCCGTTGACTCATC-3′; 對于NtRab11,5′-GACATCAACGGAAAGGAGGTTA-3′ 和 5′-GCTCCAACTGCACTCCTATAAT-3′；以β-actin(5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′ 和 5′-GGTGCAACGACCTTAATCTTCAT-3′) 用作內部對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析，結果用平均值±標準偏差來表示。

2 結果與分析

2.1 新合成化合物B2抑制感染煙草花葉病毒的效果從接種病毒后7、10和13 d的調查結果看出，用新合成化合物B2處理后的煙草，與清水(空白對照)相比，病情指數(shù)明顯降低。由表1可知，以接種病毒后10 d調查結果為例，B2和茉莉酸甲酯處理后，病情指數(shù)明顯小于清水處理，清水處理后的病情指數(shù)為 47.22；新合成化合物B2處理后，病情指數(shù)為20.39，茉莉酸甲酯處理后，病情指數(shù)為24.31，表明茉莉酸甲酯和B2可顯著抑制煙草植株感染TMV。茉莉酸甲酯與B2處理后的病情指數(shù)無明顯區(qū)別，但B2處理后抑制TMV感染效果略優(yōu)于茉莉酸甲酯的處理效果。

表1 新合成化合物B2對煙草抗煙草花葉病毒的影響

2.2 B2對TMV的抑制效果通過采用間接ELISA法測定TMV的結果顯示(圖2)，用B2處理的煙草在接種TMV病毒5 d后，處理組的OD492為2.84，而對照組的OD492為9.76，之后對照組的OD492迅速上升，9 d后對照組的OD492達到處理組的2.8倍，5 ～ 9 d的檢測結果顯示，對照組與B2處理組均達顯著差異。ELISA法的測定結果證明了新合成化合物B2對TMV侵染煙草的抑制效果。

圖2 新合成化合物B2對TMV侵染煙草的抑制作用

2.3 B2處理后接種葉片中SOD和LOX活性變化由圖3可知，B2處理后，煙草葉片中SOD活性迅速增加，且顯著高于對照組。處理組和對照組中SOD活性的峰值均出現(xiàn)在B2處理2 d后，之后緩慢降低。

圖3 B2處理后接種葉片SOD活性變化

由圖4可知，對照組的脂氧酶活性在接種TMV后無明顯變化，而B2處理組的脂氧酶活性在接種TMV后迅速升高，在接種病毒第2天時達到峰值，其活性為4.3 μg/(mg·h)，是對照組的4.8倍。之后，第4天開始處理組的脂氧酶活性有所降低，但均高于對照組。

圖4 B2處理后接種葉LOX活性變化

2.4 B2處理對NtRab11基因表達量的影響研究發(fā)現(xiàn),作為水稻中茉莉酸介導的關鍵基因，OsRab11和茉莉酸信號途徑中的OsOPR8基因有互作效應，水稻中的OsRab11基因可通過調節(jié)茉莉酸生物合成作用于茉莉酸信號通道[7]。由圖5可知，B2處理2 h后，NtRab11基因的表達量有明顯的上調趨勢，在6 h時，NtRab11基因的相對表達量為空白對照的6.2倍，之后，NtRab11的相對表達量緩慢降低，在12 h時，相對表達量為空白對照的4.0倍。

圖5 B2處理對NtRab11的相對表達量的影響

2.5 B2處理后COI1、PR-1a和PR-1b的相對表達量的變化由圖6可知，經(jīng)B2處理后，隨著誘抗時間的增加，茉莉酸信號通路中的關鍵基因COI1、植物抗病基因介導的系統(tǒng)抗性中的標志基因PR-1a和PR-1b的表達量均表現(xiàn)出增加趨勢。COI1相對表達量穩(wěn)步提高，在72 h時達到4.8倍。PR-1a和PR-1b基因的表達量與對照相比均有提高，且隨著誘抗時間的增加而提高，在72 h時PR-1a和PR-1b基因的相對表達量為空白對照的5.2和3.1倍。

圖6 B2處理后COI1、PR-1a和PR-1b 的相對表達量

3 結論與討論

煙草花葉病毒為RNA病毒，可侵染許多植物，尤其對煙草及茄科植物的生產(chǎn)帶來了極大的危害。該試驗主要研究了新合成的化合物——茉莉酸甲酯類似物B2(500 mg/L)對煙草花葉病毒侵染煙草的抑制效果及相關誘導抗病機理。結果顯示，施用B2，能顯著降低煙草的病情指數(shù)。相關機理研究表明B2處理后，煙草中的SOD活性和LOX活性與對照相比均有提高，且茉莉酸信號途徑的NtRab11基因、茉莉酸信號通路中的受體蛋白關鍵基因COI1、植物抗病基因PR-1a和PR-1b的表達均有顯著提高。

Fodor等[8]研究表明，煙草植株的抗性提高時，SOD的活性增加，因此，認為SOD活性在煙草植株的抗病過程中起重要作用。該試驗中，B2處理樣品與對照相比，SOD活性顯著提高，表明茉莉酸甲酯類似物B2能有效提高煙草植株內的SOD活性。Aranda等[9]研究黃瓜子葉中黃瓜花葉病毒的復制時，黃瓜子葉相關LOX的基因表達被抑制，說明可能LOX對黃瓜花葉病毒的復制有抑制效果。該研究中茉莉酸甲酯類似物B2能明顯誘導煙草中的LOX活性，且降低處理樣品中的TMV含量。以上結果表明用B2處理，LOX的活性增加，且LOX可能對TMV的積累有不利作用。

Rab11基因影響植物的生長發(fā)育通過調節(jié)細胞內的囊狀小泡的運輸[10]，豆科植物中根毛的發(fā)育[11]，擬南芥中花粉的發(fā)育均可受該基因的影響[12]。經(jīng)過MeJA處理之后，本氏煙中Rab11有所上調，表明該基因對于茉莉酸甲酯的反應具有一定的相關性。作為植物體內的一種內源生長調節(jié)物質，茉莉酸能夠誘導激發(fā)植物體內的系統(tǒng)性抗性，研究顯示水稻 OsRab11是MeJA介導的防衛(wèi)信號所必需的基因，酵母篩庫的試驗表明，茉莉酸途徑中的OsOPR8基因和水稻OsRab11基因有互作效應，OsRab11基因能夠調節(jié)茉莉酸信號途徑，且擬南芥植株中超表達OsRab11能夠提高丁香假單孢菌的侵染抗性[7]。據(jù)此推測，B2處理后的煙草植株提高TMV的侵染抗性可能是因為Rab11基因的高表達增強了與茉莉酸途徑中的OsOPR8基因相互作用，提高了茉莉酸的生物合成，從而增強了茉莉酸介導的系統(tǒng)性防御反應，提高了TMV侵染的抑制效果。具體機理還需要進一步探究。

綜上所述，新合成的茉莉酸甲酯類似物B2處理煙草植株后，促進SOD、LOX的活性，抑制TMV在煙草植株中的積累，且茉莉酸信號通路中的相關基因和植物抗病相關基因NtRab11、COI1、PR-1a和PR-1b的相對表達量都有所提高。以上結果表明，B2對TMV侵染煙草植株有抑制效果。