根際促生菌S1菌株的分離鑒定及促生效果

呂朝陽(yáng)，王 威，楊淼泠，施李鳴，張 維，張克誠(chéng)，葛蓓孛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

根際土壤是土壤中各種物質(zhì)和養(yǎng)分從無(wú)機(jī)環(huán)境進(jìn)入植物的重要媒介，它受植物根系分泌物、微生物與土壤之間的相互作用[1]，根際土壤微生物作為土壤-植被生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一，不僅能夠參與并調(diào)節(jié)植物在生長(zhǎng)發(fā)育中的各個(gè)環(huán)節(jié)[2-3]，還在土壤的能量流動(dòng)、養(yǎng)分循環(huán)及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用。其中，根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在植物體內(nèi)，附生于根系或根際土壤中的一類對(duì)病原菌有生防作用，能夠促進(jìn)植物吸收礦物質(zhì)等無(wú)機(jī)物，并產(chǎn)生有利于植物生長(zhǎng)的化合物的有益菌，這類土壤益生菌通常也具有生物固氮、產(chǎn)生植物激素和抗生素等能力[4-6]。PGPR由于對(duì)植物病害具有顯著防效，并能夠促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育及增加產(chǎn)量而受到研究者的關(guān)注，成為根際微生物研究的熱點(diǎn)。引入外來(lái)微生物定植到根際能夠直接影響根際微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，或者通過調(diào)控植物的代謝和根分泌物組分而間接影響植物根際微生物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗病原微生物的能力等[7-10]。

互花米草(Spartinaalterniflora)，禾本科米草屬多年生植物，其莖稈粗壯且根部發(fā)達(dá)，能夠深扎于土壤中以促進(jìn)泥沙的快速沉降和淤積，因此被許多國(guó)家地區(qū)引進(jìn)[11]。但互花米草的過度擴(kuò)散對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響，已成為生物入侵研究的焦點(diǎn)之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，互花米草能夠改變土壤微生物群落，提高根際微生物的豐富度[13-15]。因此，在互花米草根際土壤中更有可能篩選出更多種類的根際促生菌，為研發(fā)新型綠色微生物肥料和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1土壤樣品。試驗(yàn)土樣采集于廣西北?；セ撞莞H土壤，撥去表層約5 cm厚的土壤，用小鏟采集根際土壤并將其裝入無(wú)菌采樣袋中，標(biāo)注好采樣時(shí)間和地點(diǎn)，帶回實(shí)驗(yàn)室置于冰箱中-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2番茄品種。試驗(yàn)所用番茄品種為改良毛粉802，購(gòu)自山東安信種苗股份有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基。生長(zhǎng)素產(chǎn)出菌篩選培養(yǎng)基：R2A(M1)；菌株溶磷能力篩選培養(yǎng)基：蒙金娜無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(M2)；微生物分離培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基(M3)；菌株產(chǎn)IAA能力篩選培養(yǎng)基：Salksowski 比色液(M4)。培養(yǎng)基的配制成分與含量見表1[14]。

表1 培養(yǎng)基及其組分

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1根際微生物的分離與篩選。

1.2.1.1菌株的富集和分離。取2 g土壤樣品加入18 mL無(wú)菌水，在搖床上振蕩培養(yǎng)1 h后靜置10 min，使形成的土壤懸浮液分層。取2 mL上清液于LB液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩24 h進(jìn)行富集培養(yǎng)。取1 mL富集后的菌株懸浮液，用無(wú)菌水將懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×10-2CFU/mL，之后采用梯度稀釋法將濃度稀釋至1×10-7CFU/mL，分別吸取各梯度土壤懸浮液 200 μL，依次滴加至ACC篩選平板上，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布至干燥，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將完成涂布分離的平板倒置培養(yǎng)在34 ℃的培養(yǎng)箱中2～3 d。

1.2.1.2菌株的篩選。觀察菌落生長(zhǎng)情況，依據(jù)菌落的生物特征、氣生菌絲等特點(diǎn)篩去重復(fù)菌株。將篩選的單菌落挑取至含色氨酸的R2A液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃ 200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24 h。

(1)細(xì)菌溶磷能力的篩選。振蕩培養(yǎng)后分別吸取1 μL孢子懸浮液，點(diǎn)接在蒙金娜無(wú)機(jī)磷平板中央，于34 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶磷圈，溶磷圈越大，則該菌株溶磷效果越強(qiáng)。

(2)細(xì)菌產(chǎn)IAA(吲哚乙酸)能力的篩選。將待測(cè)菌株在含有色氨酸的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，取上清液離心10 min，將離心后的上清液與Salksowski比色液在96孔板上1∶1混合進(jìn)行顯色反應(yīng)，將96孔板置于38 ℃條件下避光保溫40 min，觀察顏色變化，顏色越深說明該菌株產(chǎn)IAA的能力越強(qiáng)。

將篩選出的既有產(chǎn)IAA能力又有溶磷效果的菌株，采用平板劃線法進(jìn)行純化，并保存在甘油中，放置在-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌株生理生化鑒定。采用平板劃線法將菌株S1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)出單菌落，觀察菌落顏色、形態(tài)及菌體的形態(tài)，并采用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)菌株S1進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.2.3菌株分子水平鑒定。

1.2.3.1總DNA提取及PCR擴(kuò)增。使用細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒及細(xì)菌通用引物提取S1菌株的總DNA。

1.2.3.2PCR產(chǎn)物檢測(cè)、純化與測(cè)序。用移液槍取5 μL擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混勻，加樣于凝膠樣孔中進(jìn)行電泳。約30 min后，將電泳好的凝膠取出放置在紫外透射儀下進(jìn)行檢測(cè)，在約1 300 bp處看到1條亮帶，說明擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增后的序列送至擎科科技有限公司測(cè)序。

將測(cè)序得到的結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似度最高的一些種屬并下載其16S rRNA基因序列，利用這些序列在MEGA 7.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4菌株發(fā)酵液的制備及計(jì)數(shù)。將菌株接種在LB固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后，接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 220 r/min 振蕩培養(yǎng)1 d，然后在離心機(jī)中28 ℃ 6 000 r/min離心6 min，得到的上清液即為細(xì)菌發(fā)酵液。

用梯度稀釋法將細(xì)菌發(fā)酵液濃度依次調(diào)節(jié)至1×10-9CFU/mL，每個(gè)濃度吸取100 μL細(xì)菌發(fā)酵液，依次滴加在LB固體培養(yǎng)皿上均勻涂布，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布至干燥，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將完成涂布分離的平板倒置在28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，找出在培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出10～100菌落數(shù)的處理，計(jì)數(shù)并求平均值。

1.2.5菌株對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響。用無(wú)菌水將番茄種子洗凈并浸泡4 h，控干水分后，用0.4%高錳酸鉀浸泡10 min，之后用無(wú)菌水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分。取5個(gè)50 mL無(wú)菌離心管，每個(gè)離心管放入50粒處理后的番茄種子，將已過濾的濃度為1×107CFU/mL菌株發(fā)酵液按10、100、500、1 000、2 000倍稀釋后分別得到濃度為1×106、1×105、2×104、1×104、5×103CFU/mL的發(fā)酵液，以添加相同體積、稀釋倍數(shù)相同的LB液體培養(yǎng)基和無(wú)菌水浸泡作為對(duì)照組，每處理重復(fù)3次。將各處理放置在25 ℃、相對(duì)濕度為90%的光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置光照為12 h/d。為確保種子濕潤(rùn)，每天定期噴少量無(wú)菌水。以發(fā)芽試驗(yàn)當(dāng)天記作0 d，8 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，10 d后計(jì)算發(fā)芽率，利用公式計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[16]。

發(fā)芽率=前10 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=前8 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

式中，Gt為發(fā)芽試驗(yàn)終期每日發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)。

活力指數(shù)V=GP×GI

式中，GP為幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)，該試驗(yàn)以幼苗平均根質(zhì)量計(jì)。

1.2.6菌株對(duì)盆栽番茄幼苗生長(zhǎng)的影響。將番茄種子催芽后播種于裝有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的盆中，每盆1株，待番茄苗長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，將發(fā)酵好的濃度為1×104、2×104CFU/mL的菌液和濃度為1×104、2×104CFU/mL的LB液體培養(yǎng)基每株 10 mL 緩慢灌入番茄苗根部；將10 mL清水注入番茄苗根部土壤中作為空白對(duì)照，每處理20株苗，每處理設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，處理完畢后放置在30 ℃溫室中培養(yǎng)。每隔7 d各處理再分別進(jìn)行一次灌根處理，累計(jì)灌根5次后取樣，小心清洗根部土壤，統(tǒng)計(jì)株高、根長(zhǎng)和鮮重。測(cè)量完畢后將番茄幼苗置于60 ℃烘箱中，烘干水分后測(cè)量干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用 MEGA 7.0軟件和鄰接法(Neighboring-Joinning，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；采用SPSS 24.0(IBM，Armok，NY，USA)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)番茄農(nóng)藝指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草根際土壤細(xì)菌菌株分離結(jié)果通過前期初篩并純化獲得了10株細(xì)菌菌株(表2)。測(cè)量各細(xì)菌菌株在蒙金娜無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中溶磷圈直徑，發(fā)現(xiàn)Gx-Ⅰ7菌株的溶磷圈直徑最大，為3.35 cm，其次為Gx-Ⅰ1，為3.24 cm。利用IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線基于各菌株發(fā)生顯色反應(yīng)后的OD530值計(jì)算得到IAA濃度，結(jié)果表明，菌株-Gx-Ⅰ1和Gx-Ⅰ5 IAA濃度相對(duì)較高，IAA濃度分別為7.20和6.81 μg/mL。綜合溶磷及分泌IAA能力2個(gè)指標(biāo)，選取溶磷及產(chǎn)IAA能力均較強(qiáng)的菌株Gx-Ⅰ1進(jìn)行深入研究，并將其命名為菌株S1。

表2 互花米草根際土壤細(xì)菌溶磷及產(chǎn)IAA能力篩選

2.2 菌株S1的鑒定

2.2.1形態(tài)及生理生化特征。菌株S1在LB培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，圓形，表面光滑、濕潤(rùn)，革蘭氏染色結(jié)果為陰性，菌體形態(tài)為桿狀。細(xì)菌微量生化鑒定檢測(cè)結(jié)果表明(表3)，菌株S1對(duì)尿素、枸櫞酸鹽、動(dòng)力、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、葡萄酸鹽、產(chǎn)氣試驗(yàn)呈陽(yáng)性，對(duì)甲基紅、靛基質(zhì)、硫化氫、苯丙氨酸、側(cè)金盞花醇 、賴氨酸、木糖、革蘭氏染色均為陰性。

表3 互花米草根際土壤分離的細(xì)菌菌株S1的生理生化特征

2.2.2分子生物學(xué)鑒定。將細(xì)菌S1的16S rRNA片段擴(kuò)增后長(zhǎng)度約1 300 bp(圖1)。擴(kuò)增后的片段測(cè)序后將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索和比較，得到相近種屬的16S rRNA序列，利用這些序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，該分離菌株與陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)同屬于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)到99%，結(jié)合生理生化鑒定將該菌株暫定為陰溝腸桿菌。

注：M.DL 5000 DNA梯帶；1～2.細(xì)菌擴(kuò)增片段；目的條帶約1 300 bp

圖2 菌株S1及相關(guān)細(xì)菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株S1對(duì)室內(nèi)番茄種子萌發(fā)的影響番茄種子萌發(fā)的測(cè)定結(jié)果見表4。表4表明，菌株發(fā)酵液浸泡處理組中，1×104CFU/mL的發(fā)酵液能夠顯著促進(jìn)種子萌發(fā)，發(fā)芽率為72.20%，發(fā)芽勢(shì)為72.22%，發(fā)芽指數(shù)為26.23，活力指數(shù)為95.48，相比于CK分別提高了88.36%、106.34%、159.19%、113.46%。發(fā)酵培養(yǎng)基浸泡處理組中，2×104、5×103CFU/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，其中5×103CFU/mL發(fā)酵培養(yǎng)基效果最好，相比于CK組發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高了41.93%、52.37%、69.47%、6.44%。以上分析表明，發(fā)酵培養(yǎng)基和菌株發(fā)酵液在一定濃度下均能促進(jìn)種子萌發(fā)，其中1×104CFU/mL菌株發(fā)酵液促進(jìn)種子萌發(fā)的效果最佳。

表4 S1菌株發(fā)酵液對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響

2.4 菌株S1對(duì)盆栽番茄幼苗生長(zhǎng)的影響發(fā)酵液對(duì)室內(nèi)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響見圖3。番茄各生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)量結(jié)果(表5)表明，經(jīng)菌株發(fā)酵液和發(fā)酵培養(yǎng)基處理過的菌株，其根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均高于CK。說明2種處理均可以促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，S1菌株發(fā)酵液濃度為1×104CFU/mL時(shí)，對(duì)番茄的促生作用最為顯著，與CK相比，根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別增加了63.79%、74.66%、155.17%和150.00%。

表5 菌株發(fā)酵液對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響

3 討論

PGPR可通過多種作用機(jī)制促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育并提高產(chǎn)量，如改善植物根際的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，增強(qiáng)植物的固氮能力；通過分泌各種植物激素、維生素或氨基酸等促進(jìn)植物生長(zhǎng)；產(chǎn)生抗生素和胞外溶解酶等抑制病原菌的生長(zhǎng)，減輕對(duì)植物的危害[17-19]。利用PGPR制成微生物肥料可緩解因化肥的過度使用而造成的環(huán)境污染問題[20]，特別是近年來(lái)農(nóng)業(yè)部提出化肥零增長(zhǎng)的要求，使得農(nóng)業(yè)上對(duì)綠色高效的微生物肥料的需求更為迫切。因此，利用PGPR研發(fā)出新型環(huán)保的微生物肥料和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。該研究從廣西北?；セ撞莞H土壤中分離獲得1株具有溶磷及分泌IAA能力的菌株陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，其發(fā)酵液在1×104CFU/mL時(shí)能夠顯著促進(jìn)番茄種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。研究表明，IAA可調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，特別是對(duì)植物次生根的發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用。因此，若接種的根際促生菌能夠產(chǎn)生大量IAA，則能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的次生根，從而建立起植物幼苗根系的穩(wěn)定發(fā)育系統(tǒng)，使幼苗能夠健康快速生長(zhǎng)[21-22]。具有溶磷功能的細(xì)菌可分泌有機(jī)酸與部分金屬離子鰲合，將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，供植物吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[23]。該研究發(fā)現(xiàn)的植物促生菌為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，隸屬腸桿菌屬，目前已報(bào)道的植物根際促生菌大多屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Psewdomonas)，此外，還包括黃桿菌屬(Xanthomornas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、伯克霍氏菌屬(Burkholderia)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)、固氮菌屬(Rhizobium)等[24]，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外鮮見將陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)作為植物根際促生菌的相關(guān)報(bào)道。綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)具有良好的生防應(yīng)用前景，可豐富植物促生菌的種類，以期為開發(fā)研制新的微生物源植物生長(zhǎng)劑及微生物肥料提供原材料。

4 結(jié)論

通過平板初篩、盆栽試驗(yàn)及16S rRNA分子鑒定技術(shù)篩選出1株根際優(yōu)良促生菌株陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，兼具溶磷、分泌生長(zhǎng)素性能，該菌株對(duì)番茄種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。