犬黑皮質(zhì)素受體-4突變體D298N真核表達載體的構(gòu)建及其在MDCK細胞中的表達

宋立先，劉春紅， 王占青，高 蓉，徐學振

(濱州醫(yī)學院煙臺附院，山東煙臺 264100)

黑皮質(zhì)素受體系統(tǒng)由5個密切相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體組成(MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R)。這些受體參與包括人類在內(nèi)的多細胞動物許多重要的生物學過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黑皮質(zhì)素途徑在體重調(diào)控中起著重要作用，下丘腦黑皮質(zhì)素信號的增強導(dǎo)致食物攝入減少和能量消耗增加。單基因肥胖伴MC4R功能障礙與能量平衡調(diào)節(jié)密切相關(guān)。此外，MC4R基因突變與單基因肥胖和普通肥胖均有顯著相關(guān)。MC4R基因突變與脂肪量和肥胖相關(guān)(FTO)基因的相互作用顯著增加肥胖風險，尤其是青少年[2]。據(jù)文獻報道，在美國有近12 800名肥胖患者與MC4R的缺陷有關(guān)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，有超過15億的成人和兒童面臨肥胖的困擾，肥胖已經(jīng)作為公共健康問題受到人們的廣泛關(guān)注，嚴重威脅人類健康[4]。全球疾病負擔小組估計，2015年BMI值升高導(dǎo)致400萬人死亡，其中2/3的人死于心血管疾病(CVD)[5]。肥胖與2型糖尿病的關(guān)系早已被人們所認識，并清楚地解釋了許多國家2型糖尿病的高患病率。許多肥胖高?；颊叩奶卣魇谴x和心血管危險因素并存[6]。眾所周知，過度肥胖對流感易感性增加，包括近年在全世界范圍流行的新型冠狀病毒，對人類的危害堪稱是災(zāi)難性的。人們通常認為，飲食結(jié)構(gòu)不恰當和缺乏運動是導(dǎo)致肥胖的主要原因，但是有些人即使是健康的生活方式，仍然會面臨肥胖的困擾,因為導(dǎo)致肥胖的原因除了生活方式，還有基因因素參與[7]。有學者在對UK生物銀行的0.5億份樣本進行篩查，發(fā)現(xiàn)了61個MC4R突變體，通過分析發(fā)現(xiàn)，均與BMI、肥胖相關(guān)代謝性心肌病密切相關(guān)[8]。因此，迫切需要深入探究MC4R突變導(dǎo)致的肥胖。

MC4R是一個有996個堿基配對的七次跨膜受體，定位染色體18Q21.3上，主要分布于下丘腦[7]。犬被認為是研究人類疾病和包括肥胖在內(nèi)的功能失調(diào)機制的理想生物醫(yī)學模型[9]。犬MC4R基因由編碼332個氨基酸的單一外顯子組成，定位在1號染色體上，在各物種之間存在高度同源性[10]。為了探討MC4R突變和肥胖之間的關(guān)系，筆者成功構(gòu)建了犬 D298N突變體的真核表達載體，后將其導(dǎo)入MDCK細胞內(nèi)，旨在為進一步探討MC4R突變引起的蛋白功能變化提供信息，同時也為人類肥胖的基因治療提供科研數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及細胞系。帶His標簽的pcDNA3.1載體、DH5α、PMD18-T Vector、MDCK細胞。

1.1.2主要試劑。Beagle犬新鮮血液；聚合酶rTaqDNA、X-Gal、異丙基硫代半乳糖苷、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ和BamHI)、DNA Marker、T4-DNA 連接酶、RNA PCR提取試劑盒；Trizol Reagent、培養(yǎng)基、Anti-myc 抗體；G418抗生素、FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒；胎牛血清等。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計。根據(jù)GenBank犬MC4R基因，設(shè)計引物序列：上游引物A，5′-CGGGATCCGCCAGGATGAACTCCACCCTTCAGC-3′；中間引物B，5′-ATGAGAGGGTTGATGATGGAG-3′；中間引物C，5′-CTCCATCATCAACCCTCTCAT-3′；下游引物D，5′-CCGCTCGAGGTATCTGCTAGACAAGTCAC-3′。引物AB擴增基因長度為115 bp,引物 CD擴增基因長度為902 bp,引物AD擴增基因長度為1 019 bp。

1.2.2提取犬血DNA，擴增D298N突變體基因PCR。

(1)以引物AB、CD進行PCR反應(yīng)獲得基因片段，分別命名為產(chǎn)物AB、CD。擴增完畢取目的產(chǎn)物20 μL，用凝膠電泳進行檢測，然后將凝膠進行回收、純化，取2 μL進行電泳檢測。

(2)以引物AB、CD產(chǎn)物為模板，用引物A、D進行PCR反應(yīng)獲得突變體的DNA片段。擴增完畢取目的產(chǎn)物20 μL，用凝膠電泳進行檢測，然后將凝膠進行回收、純化，取2 μL進行電泳檢測。

1.2.3獲得的DNA片段進行TA克隆、測序。將突變體D298N的DNA片段連接到pMD18-T載體，命名pMD18-T-cMC4R-D298N,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，用BamHI、XhoI進行酶切鑒定，篩選陽性質(zhì)粒送測序，并與犬MC4R基因序列進行比較。

1.2.4重組真核表達載體構(gòu)建、測序。用BamHI、XhoI將TA克隆陽性質(zhì)粒和帶His標簽的pcDNA3.1真核表達載體進行雙酶切、電泳，回收目的片段。用T4 DNA連接酶將帶His標簽的pcDNA3.1真核表達載體和MC4R片段在16 ℃條件下14 h進行連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α細胞，用抗生素平板篩選，挑取單克隆菌落鑒定。測序正確后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。

1.2.5將基因轉(zhuǎn)染到MDCK細胞。將處于對數(shù)生長期的MDCK細胞重懸在培養(yǎng)基中，接種細胞，培養(yǎng)24 h，使細胞融合率達75%，把空質(zhì)粒及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MDCK細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h后，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，收集細胞。

1.2.6用RT-PCR方法檢測基因的表達。轉(zhuǎn)染3 d后，提取未轉(zhuǎn)染細胞、空載體轉(zhuǎn)染細胞、重組體轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，進行凝膠電泳檢測。用RNA PCR 試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄。用cDNA做模板，引物A和D進行PCR反應(yīng)。取20 μL PCR產(chǎn)物，用凝膠電泳檢測。

1.2.7用Western blot方法檢測蛋白的表達。轉(zhuǎn)染3 d后，用EDTA-胰酶對未轉(zhuǎn)染的細胞、空載體轉(zhuǎn)染細胞、重組體轉(zhuǎn)染細胞進行消化，并提取蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)進行定量檢測(分光光度計)，然后灌膠、點樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入His抗體，孵育過夜，與羊抗鼠二抗反應(yīng)、顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬的基因組DNA條帶用Beagle犬的新鮮全血提取DNA，結(jié)果見圖1。

圖1 犬基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠分離結(jié)果

2.2 犬突變體D298N-MC4R目的片段電泳結(jié)果用overlap PCR技術(shù)首先擴增115和902 bp 2個片段，再以這2個擴增得到的片段為模板，擴增D298N-cMC4R目的片段，擴增產(chǎn)物約1 000 bp(圖2) 。

注：1.犬MC4R 115 bp目的產(chǎn)物；2.犬MC4R 902 bp目的產(chǎn)物；3.D298N-cMC4R目的產(chǎn)物；M.DNA Marker 100 bp

2.3 載體pMD18-T-cMC4R-D298的酶切、測序載體pMD18-T的分子量約2.7 kb，擴增PCR產(chǎn)物約1.0 kb，預(yù)測pMD18-T-cMC4R-D298N 的大小約為3.7 kb,提取pMD18-T-cMC4R-D298N 酶切、凝膠電泳回收產(chǎn)物(圖3)。測序結(jié)果重組表達質(zhì)粒2處堿基不同，堿基T(777位)→C，堿基G(892)→A(引入的突變位點)。

注：1.pMD18-T-cMC4R-D298N 3 700 bp目的產(chǎn)物；2.pMD18-T 的2 700 bp條帶和犬cMC4R-D298N的1 000 bp目的產(chǎn)物；M.DNA Marker

2.4 重組體酶切、測序pcDNA3.1-myc-His/A分子量約5.5 kb,PCR擴增產(chǎn)物大小約1 000 bp，可以預(yù)測pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R的大小6.5 kb，提取的重組體酶切、凝膠電泳回收產(chǎn)物見圖4。測序結(jié)果同T—A克隆結(jié)果見圖5，第298位的天冬氨酸變成天冬酰胺，表明成功構(gòu)建帶突變位點的目的載體。

注：1.pcDNA3.1- myc-His/A-cMC4R重組體;2.pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R經(jīng)Xho I/BamH 酶切產(chǎn)物;M.100～6000 bp DNA分子量對照

圖5 犬MC4R-D298N測序結(jié)果

2.5 重組體轉(zhuǎn)染MDCK細胞、RT-PCR檢測目的基因表達將重組表達載體pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N轉(zhuǎn)染入MDCK細胞(圖6)培養(yǎng)3 d，提取細胞總RNA并檢測，結(jié)果見圖7。用RT-PCR進行反轉(zhuǎn)錄，凝膠電泳結(jié)果見圖8。從圖8可見，空載體轉(zhuǎn)染細胞組、未轉(zhuǎn)染細胞組在1 000 bp處無條帶，表明無目的基因表達；轉(zhuǎn)染重組體細胞組在約1 000 bp處有亮帶，表明目的基因成功表達。

注：1.100倍光鏡下未轉(zhuǎn)染細胞；2.100倍光鏡下轉(zhuǎn)染3 d后細胞Note:1.The cells without transfection(100×); 2.The cells were transfected with recombinant plasmid after 3 days(100×)

注：1.轉(zhuǎn)染重組體MDCK細胞總RNA;2.轉(zhuǎn)染空載體MDCK細胞總RNA;3.未轉(zhuǎn)染MDCK細胞總RNA

注：1.轉(zhuǎn)染重組體的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果;2.轉(zhuǎn)染空載體的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果；3.未轉(zhuǎn)染的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果；M.100 bp DNA 分子量對照

2.6 Western blot檢測蛋白表達犬的MC4R基因由332個氨基酸組成，編碼蛋白的分子量為36.9 kD。載體融合標簽分子量大小約為3 kD，重組體表達的融合蛋白預(yù)期大小約為40 kD。Western blot檢測蛋白表達結(jié)果見圖9，可見融合蛋白在40 kD處顯示亮帶，空載體和未轉(zhuǎn)染組處無亮帶，原因為myc基因作為癌基因，細胞本身也有少量表達，因此空載體和未轉(zhuǎn)染細胞組在40 kD處有暗帶。

注：A,1.D298N重組體轉(zhuǎn)染細胞組；2.空載體轉(zhuǎn)染細胞組； 3.轉(zhuǎn)染野生型重組體細胞組;4.未轉(zhuǎn)染細胞組。B,Beta actin 內(nèi)參

3 討論

隨著肥胖病例逐年上升，迫切需要找到一種能調(diào)節(jié)體重和食欲的治療方法。MC4R是新療法的一個有吸引力的潛在靶點，MC4R被激活后，MC4R調(diào)節(jié)能量平衡并減少脂肪生成。同時可以識別多種細胞外刺激物，包括小分子、離子、光子、肽和蛋白質(zhì)，并將刺激物穿過不滲透的膜屏障傳遞到細胞內(nèi)區(qū)域，從而影響細胞功能的變化。信號通過蛋白質(zhì)相互作用和激活事件的級聯(lián)傳遞，從而引起細胞功能的細胞內(nèi)生化介質(zhì)(如第二信使)水平的變化，從而調(diào)節(jié)多種生理功能。MC4R調(diào)節(jié)脂肪組織的形成和能量平衡，被認為是新型肥胖治療的單基因靶點[11]。

MC4R作為瘦素-黑素皮質(zhì)素途徑的一部分，在下丘腦體重調(diào)節(jié)和能量消耗中起著關(guān)鍵作用。MC4R突變可導(dǎo)致各種MC4R信號通路發(fā)生截然不同的變化，并突出了受體突變綜合表征的重要性,是單基因肥胖最常見的原因。迄今為止，在肥胖患者中發(fā)現(xiàn)的許多突變在體外系統(tǒng)的過度表達中具有功能特征，其中大部分缺少Gs信號途徑[12]。近年來，有對牛、雞、豬、犬的MC4R基因的相關(guān)研究，其中研究較多的為豬和犬。黑皮質(zhì)素受體所有亞型中位于第298位的Asp298的基因序列高度保守[13]。有文獻報道，在豬MC4R基因298位氨基酸突變與豬背膘的肥厚呈相關(guān)性[14]，而犬的該位點是否存在突變及突變后對蛋白功能是否有影響，目前尚鮮見文獻報道。然而，今后要想深入研究蛋白功能，載體構(gòu)建即是第一步工作。

筆者所在課題組曾在前期研究中成功構(gòu)建犬MC4R-D90N突變體的真核表達載體，并在融合蛋白中成功表達[15]。目前國內(nèi)有關(guān)犬MC4R-D298N氨基酸突變的研究較少，基于此，筆者構(gòu)建了突變體MC4R-D298N重組真核表達載體，第298位的天冬氨酸變成天冬酰胺，后轉(zhuǎn)染到犬的細胞中并獲得成功表達。更多突變位點的發(fā)現(xiàn)，尤其是高度保守區(qū)域氨基酸突變能否導(dǎo)致蛋白功能變化為進一步探索肥胖的原因提供了更多信息。針對肥胖患者飲食調(diào)控的治療過程中，手術(shù)治療并未在長期臨床效果中獲益，更加強調(diào)了MC4R激動劑藥物治療的重要性，且只有通過基因篩查后才可以評估患者是否適合手術(shù)治療。因此，針對治療肥胖患者的藥物研發(fā)更加重要。篩選導(dǎo)致肥胖的危險基因，當前不僅是為了研究常規(guī)治療肥胖藥物，甚至可為兒科內(nèi)分泌學篩選導(dǎo)致肥胖的基因提供指導(dǎo)意見[16]。因此，可以通過基因突變位點的篩查，對存在MC4R基因突變的兒童進行前期干預(yù)，包括飲食、運動及藥物干預(yù)。綜上所述，該研究為MC4R基因突變引起蛋白功能變化、MC4R與配體結(jié)合后2個信號傳導(dǎo)通路之間聯(lián)系機制提供了前期科研基礎(chǔ)，同時為臨床上研發(fā)治療肥胖藥物及從兒童期預(yù)防肥胖的前期干預(yù)提供了科研數(shù)據(jù)。