針灸對帕金森病小鼠黑質(zhì)白細(xì)胞介素-17受體A/核因子κB信號通路的影響

高 崚 陳王璐 陳奕奕 張瀟文 王照欽, 劉慧榮,

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，鄭州，450003；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437；4 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030)

帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)是一種起病隱匿、病情呈進展性加重的神經(jīng)退行性疾病，其病理主要是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺(Dopamine，DA)神經(jīng)元變性壞死伴胞質(zhì)內(nèi)嗜酸性包涵體-路易小體(Lewy Body，LB)的形成[1]。LB的主要成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)。研究表明病理性α-syn具有神經(jīng)毒性，異常聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會損傷其正常生理功能，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元進行性壞死，進而神經(jīng)元內(nèi)多巴胺合成限速酶——酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase，TH)水平下降，引起各種臨床癥狀[2-6]。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，針灸可以改善PD患者臨床癥狀，并對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)的PD模型小鼠腸道菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用[7-8]。白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)是促炎癥介質(zhì)，研究表明，PD患者腦內(nèi)生產(chǎn)IL-17的T淋巴細(xì)胞(Th17細(xì)胞)和IL-17在PD相關(guān)的神經(jīng)元死亡中有重要作用，IL-17受體及下游的核因子κB通路激活是神經(jīng)元死亡的主要原因，且IL-17受體在PD患者腦黑質(zhì)致密部(Substantia Nigra Pars Compacta，SNpc)神經(jīng)元中上調(diào)可能是該通路具有較高活性的重要因素[9]。因此本研究采用行為學(xué)檢測方法、免疫組織化學(xué)法、蛋白質(zhì)免疫印跡法，探討針灸對MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運動遲緩的作用，并探索其對PD小鼠黑質(zhì)IL-17受體A/核因子κB信號通路中相關(guān)因子活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0012。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境內(nèi)(倫理審批號：YYLAC-2019-060-2)。在室溫22～25 ℃，光周期為12 h光照及12 h黑暗條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實驗過程嚴(yán)格按照中華人民共和國科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.1.2 主要試劑與儀器 MPTP(Sigma公司，美國，批號：M0896)，甲磺酸雷沙吉蘭(Sigma公司，美國，批號：SML0124)，氯仿(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，批號：151823)，異丙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：A451-4)，無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：111727)，mRNA抽提Trizol(Invitrogen公司，批號：15596018)。疲勞轉(zhuǎn)棒儀(成都泰盟軟件有限公司，型號：ZB-200)，Gilson移液器(Gilson Inc.公司，法國，型號：F144055P)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國，型號：5424R)，超細(xì)電動勻漿機(Fluko公司，德國，型號：F6/10-6G)，WB Bio-Rad電泳儀(伯樂公司，型號：1658001)，WB電泳轉(zhuǎn)膜儀(大連競邁科技有限公司，型號：PS-9)，凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司，美國，型號：ChemiDoc XRS+)，定時水平搖床(Crystal公司，美國，型號：OS-03U)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將實驗小鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組，每組10只。每天稱重小鼠體質(zhì)量并記錄，于同一時間以MPTP腹腔注射給藥進行造模，腹腔注射的部位選擇在腹膜區(qū)略向上，以避免略向右上穿刺小腸和膀胱，將35.1 mg MPTP·HCl溶解于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中，以10 μL/(g·d)的劑量，空白組注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)注射5 d。

1.2.2 給藥方法 1)針刺組：模型制備成功后，次日起每日將小鼠固定在特制鼠架上，采用0.25 mm×13 mm規(guī)格一次性無菌針灸針(蘇州華佗)，取百會、陽陵泉進行針刺，捻轉(zhuǎn)15 s后每間隔5 min捻轉(zhuǎn)15 s，共留針15 min，干預(yù)1次/d，共干預(yù)14 d。穴位定位參照《針灸實驗學(xué)》和《實驗動物針灸手冊》中“常用實驗動物針灸穴位”的規(guī)定，并結(jié)合動物比較學(xué)方法，根據(jù)比較解剖學(xué)進行取穴[10]。

2)針刺艾灸組：模型制備成功后，固定及針刺選穴、干預(yù)方法同針刺組，針刺干預(yù)結(jié)束后將小鼠腹部皮毛剃凈，以0.5 cm×12 cm規(guī)格特制細(xì)艾條溫和灸關(guān)元穴，使穴位局部皮膚溫度達到45 ℃左右，持續(xù)15 min，干預(yù)1次/d，共干預(yù)14 d。3)雷沙吉蘭組：模型制備成功后，次日起每日以甲磺酸雷沙吉蘭0.2 mg/kg的劑量進行灌胃，并記錄體質(zhì)量，1次/d，共灌胃14 d?？瞻捉M、模型組與針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組進行相同的抓取和固定，不做其他干預(yù)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 疲勞轉(zhuǎn)棒實驗評分：采用疲勞轉(zhuǎn)棒儀進行評估[11]。將小鼠放置于直徑約3 cm的轉(zhuǎn)棒上(小鼠的頭朝向轉(zhuǎn)棒儀內(nèi)，于兩側(cè)擋板之間)。5 min內(nèi)，旋轉(zhuǎn)速度從10 r/min逐漸增加至30 r/min，在MPTP注射前訓(xùn)練3 d，使之能夠在20 r/min的轉(zhuǎn)棒上維持120 s，在干預(yù)結(jié)束后當(dāng)天，轉(zhuǎn)棒測試10、15、20、25、30 r/min下保持時間，并采用梯形法計算總體轉(zhuǎn)棒評分(Overall Rotarod Performance，ORP)。

熒光染色技術(shù)檢測黑質(zhì)區(qū)TH、α-syn的表達：4%多聚甲醛固定、切片，室溫封閉60 min后，分別滴加濃度為1∶1 000的TH和α-syn一抗，于4 ℃濕盒中孵育過夜(15 h)，滴加二抗，室溫孵育1～2 h，滴加新鮮配制的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察，陽性表達為棕黃色或棕褐色。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測黑質(zhì)致密部IL-17受體A、核因子κB、p-核因子κB抑制劑(Inhibitor of Kappa B Alph,IκBα)、IκBα、p-轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶1(Transforming Growth Factor-activated Kinase 1,p-TAK1)、TAK1、激活蛋白1(Activator 1,Act1)表達：黑質(zhì)組織剪碎加裂解液勻漿離心提取總蛋白(離心半徑10 cm)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳至溴酚藍(lán)剛跑出，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，加抗體孵育并顯色，用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，蛋白質(zhì)的相對含量以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 疲勞轉(zhuǎn)棒儀評分 雷沙吉蘭組小鼠ORP與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；針刺艾灸組小鼠及針刺組小鼠ORP均高于模型組，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；雷沙吉蘭組與針刺組、針刺艾灸組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；針刺艾灸組與針刺組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠ORP比較分，n=8)

2.2 熒光染色技術(shù)檢測黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶的表達 空白組與其他組比較，TH表達更強，數(shù)量多且密度大，分布范圍廣，呈明亮的熒光綠色；模型組與空白組比較，TH數(shù)量明顯減少，分布范圍縮小，免疫熒光染色表達弱，TH成暗淡的熒光綠色；針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組與模型組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量有所增加，分布范圍擴大；針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量較多，熒光綠色信號較強；針刺艾灸組與針刺組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量較多，分布較廣，熒光綠色更明亮，更加接近空白組。與空白組比較，模型組小鼠TH黑質(zhì)表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組的表達量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中針刺艾灸組增加最明顯。見圖1、表2。

表2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH表達量比較

圖1 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH蛋白表達(免疫熒光染色,×400)

2.3 熒光染色技術(shù)檢測α-syn的表達 模型組與其他組比較，α-syn免疫熒光染色表達更強，數(shù)目多，分布范圍廣，呈明亮的熒光綠色；空白組與模型組比較α-syn數(shù)量明顯減少，分布范圍減小，免疫熒光染色表達呈暗淡的熒光綠色；針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組與模型組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細(xì)胞數(shù)量有所減少，分布范圍變小；針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細(xì)胞較少，熒光綠色信號較強；針刺艾灸組與針刺組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細(xì)胞較少，分布較少，熒光綠色更暗，更加接近空白組。與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)α-syn免疫熒光強度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組小鼠黑質(zhì)α-syn熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組與針刺艾灸組α-syn免疫熒光強度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)α-syn表達比較

圖2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)α-syn蛋白表達(免疫熒光染色，×400)

2.4 各組小鼠黑質(zhì)致密部IL-17受體A蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組IL-17受體A蛋白表達上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，針刺艾灸組IL-17受體A蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組IL-17受體A蛋白表達降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

表4 各組小鼠黑質(zhì)致密部IL-17受體A蛋白相對表達量比較

圖3 各組小鼠黑質(zhì)致密部IL-17RA蛋白表達電泳圖

2.5 各組小鼠黑質(zhì)致密部Act1相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部Act1表達下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部Act1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表5。

圖4 各組小鼠黑質(zhì)致密部Act1蛋白表達電泳圖

表5 各組小鼠黑質(zhì)致密部Act1相對表達量比較

2.6 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表6。

圖5 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1蛋白表達電泳圖

表6 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1蛋白相對表達量比較

2.7 各組小鼠黑質(zhì)致密部TAK1蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部TAK1蛋白表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6、表7。

圖6 各組小鼠黑質(zhì)致密部TAK1蛋白表達電泳圖

表7 各組小鼠黑質(zhì)致密部TAK1蛋白相對表達量比較

2.8 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

表8 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率比較

2.9 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα比較 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖7、表9。

圖7 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα蛋白表達電泳圖

表9 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα比較

2.10 各組小鼠黑質(zhì)致密部IκBα相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部IκBα表達下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部IκBα表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見圖8、表10。

圖8 各組小鼠黑質(zhì)致密部IκBα蛋白表達電泳圖

表10 各組小鼠黑質(zhì)致密部IκBα相對表達量比較

2.11 各組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα/IκBα比較 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα/IκBα升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα/IκBα率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表11。

表11 各組小鼠小鼠黑質(zhì)致密部p-IκBα/IκBα比較

2.12 各組小鼠核因子κB相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)致密部核因子κB蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質(zhì)致密部核因子κB蛋白表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖9、表12。

圖9 各組小鼠黑質(zhì)致密部核因子κB蛋白表達電泳圖

表12 各組小鼠黑質(zhì)致密部核因子κB蛋白相對表達量比較

3 討論

帕金森病(PD)屬“顫證”“震顫”“顫振”“掉”等范疇，癥可見頭身肢體不自主地?fù)u動、顫抖為主要臨床表現(xiàn)的一種病證[12-13]。為本虛標(biāo)實之病，病位在筋脈，與肝、脾、腎等臟關(guān)系密切[14-16]。如《素問長刺節(jié)論》曰：“病在筋，筋攣節(jié)痛，不可以行，名曰筋痹?！北菊n題組認(rèn)為該病的病因病機屬于陰陽失衡，督脈失職，筋脈失養(yǎng)所致?！鹅`樞·邪氣藏府病形篇》曰：“筋急，陽陵泉主之?！标柫耆獮椤敖顣?，有舒筋緩急的作用，為筋氣聚會之外，故陽陵泉是治療筋病的要穴，特別是下肢筋病，臨床較為常用，具有舒筋和壯筋的作用[17]。百會穴與腦聯(lián)系密切，作為督脈的重要穴位，亦是“三陽五會”之穴，其位于巔頂，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴，其穴性屬陽，又于陽中寓陰，故能通達陰陽脈絡(luò)，連貫周身經(jīng)穴，對于調(diào)節(jié)機體的陰陽平衡起著重要的作用[18]。故本實驗選用百會聯(lián)合陽陵泉，通過強筋補髓，調(diào)和陰陽緩解PD小鼠癥狀。

核因子κB是一種多向性炎癥轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控免疫細(xì)胞的激活、T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成、病毒復(fù)制、炎癥反應(yīng)及多種自身免疫性疾病等方面發(fā)揮重要作用[19]。核因子κB轉(zhuǎn)錄、活化與炎癥反應(yīng)有關(guān)的靶基因，其表達產(chǎn)物主要參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損害[20]。研究表明，IL-17RA/核因子κB通路激活是PD神經(jīng)元死亡的主要原因之一。在與PD患者的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)或添加IL-17情況下，通過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)衍生的PD中腦神經(jīng)元(Midbrain Neuron，MBN)上調(diào)IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和其下游靶標(biāo)，激活B細(xì)胞核因子κ輕鏈增強劑(核因子κB)而導(dǎo)致MBN死亡，添加IL-17、IL-17受體的阻斷劑或添加IL-17抗體蘇金單抗(Secukinumab)則可挽救此種死亡。另一方面，PD患者人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的MBN中IL-17受體表達顯著上升，可能是此類MBN對IL-17和PD來源的T淋巴細(xì)胞的特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)，“迎接”更多的IL-17而激活核因子κB通路[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠核因子κB表達明顯升高，而TH表達顯著降低，證實了核因子κB的活化是促進多巴胺能神經(jīng)元死亡的重要機制。PD模型小鼠IL-17受體A蛋白表達表現(xiàn)出一定的上升，而針刺艾灸干預(yù)可以顯著抑制IL-17受體A表達，且雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組與模型組比較，核因子κB表達均降低，提示調(diào)節(jié)IL-17/NF-κB通路可能是針灸保護黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

核因子κB ACT1是IL-17受體A下游至核因子κB信號通路所必需的銜接蛋白，介導(dǎo)從IL-17受體A到核因子κB和其他轉(zhuǎn)錄因子信號通路的活化。而腫瘤壞死因子相關(guān)因子6是ACT1的關(guān)鍵底物，在核因子κB激酶抑制物(Inhibitor of Nuclear Factor Kappa-B Kinase,IKK)相關(guān)激酶與ACT1的相互作用下，參與到IL-17介導(dǎo)的ACT1的磷酸化過程，促使核因子KB的激活[21]。在本研究中，各組之間的ACT1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ACT1在模型組核因子κB激活環(huán)路中的角色尚不明確，另一方面，IKK相關(guān)激酶(TANK-結(jié)合激酶1和誘導(dǎo)核因子κB激酶抑制物)對ACT1的磷酸化修飾是IL-17通路負(fù)反饋調(diào)控的關(guān)鍵機制，ACT1的磷酸化水平有待進一步的研究探明。核因子κB在PD的發(fā)病過程中的激活，TAKl通過多種形式參與。模型組與空白組比較，p-TAK1、TAK1的表達以及p-TAK1/TAK1比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，提示TAK1及其磷酸化水平在PD中腦核因子κB相關(guān)通路中的角色尚不明確，有待進一步研究。

IκBα結(jié)合形成異源二聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，在外界多種因素刺激下，IκBα可磷酸化并迅速降解使核因子κB得以釋放，與靶基因啟動因子結(jié)合介導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)包括誘生型一氧化氮合酶的過量表達[22]。本研究觀察到，各組間IκBα蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而模型組與空白組比較，p-IκBα表達及p-IκBα/IκBα的比值顯著升高，提示模型組中腦黑質(zhì)存在核因子κB的顯著活化，而雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組與模型組比較，p-IκBα表達與p-IκBα/IκBα比值均降低，表明3種方法均可有效降低IκBα的磷酸化水平，抑制核因子κB活化，提示抑制IκBα的磷酸化可能是針灸調(diào)節(jié)IL-17受體通路的關(guān)鍵作用機制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中腦黑質(zhì)部IL-17受體A/NF-κB信號通路異常，并發(fā)現(xiàn)針灸可以調(diào)節(jié)IL-17受體A/NF-κB信號通路活性，調(diào)控IκBα的磷酸化水平可能是其中的關(guān)鍵機制之一。