外泌體circ_0001445在膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的調(diào)控機(jī)制研究

高寧，金虎，陳偉明，陳煥雄，王青松，彭俊，詹文亮，夏鷹

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 海口 570208）

膠質(zhì)瘤是世界上最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。最新證據(jù)表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞與大腦微環(huán)境之間的相互作用可能影響腦瘤的生長[2]。外泌體存在于循環(huán)和組織微環(huán)境中，是由細(xì)胞分泌的一種微小囊泡，可攜帶和傳遞重要的信號分子[3]。有證據(jù)表明，來自癌細(xì)胞的外泌體與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。研究顯示，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在多種腫瘤中異常表達(dá)，可成為腫瘤診斷及預(yù)后評估的標(biāo)志物[5]。XU等[6]研究表明，過表達(dá)circ_0001445通過調(diào)節(jié)miR-942-5p/ALX4軸減慢肝癌的進(jìn)展。BARBAGALLO等[7]研究表明，circ_0001445通過調(diào)節(jié)剪接因子SRSF1/SRSF3的分子軸以抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移。circ_0001445可能是膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)，但其在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的調(diào)控作用還有待闡明?；诖?，本研究旨在探討circ_0001445對膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的惡性生物學(xué)的影響以及相關(guān)機(jī)制，以期為外泌體circ_0001445在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用提供新的見解，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織細(xì)胞及主要試劑、儀器①組織細(xì)胞：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain icrovascular endothelial cells，HBMECs）、人腦星型膠質(zhì)正常細(xì)胞（human astrocytes，HEB）及T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞均購自上海通派生物公司；55例膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織樣本均來自2016年5月至2020年6月于本院接受膠質(zhì)瘤手術(shù)患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。②相關(guān)試劑：TRIzol試劑（源葉生物公司，貨號：R21086）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，貨號：11141ES10）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（科邦興業(yè)公司，貨號：208054）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，貨號：11402ES60）；circ_0001445過表達(dá)質(zhì)粒載體和空載質(zhì)粒（維真生物）；GADPH內(nèi)參引物[生物生工工程（上海）股份有限公司，貨號：B661104-0001]；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（GlpBio公司，貨號：GK20005）；人工基底膜（北京盈豐大通科技有限公司，貨號：354234）；細(xì)胞外泌體提取試劑盒（貝博生物科技有限公司，貨號：BB-3901）；甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH，圣克魯斯生物技術(shù)公司，貨號：51332）；CD63抗體（圣克魯斯生物技術(shù)公司，貨號：sc-5275）；Alix抗體（圣克魯斯生物技術(shù)公司，貨號：sc-53540）；二抗（圣克魯斯生物技術(shù)公司）。③主要儀器：MA-6000熒光定量PCR儀（濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司）；JEM-2500SE透射電子顯微鏡（日本日立公司）；BXF-80倒置顯微鏡（上海炳宇光學(xué)儀器）；JS-680D凝膠成像儀（杭州得聚儀器設(shè)備公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HBMECs、T98G和HEB細(xì)胞均培養(yǎng)在DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，其中添加了胎牛血清（10%）和青霉素（100 U/ml）。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到90%時，進(jìn)行消化傳代或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將T98G細(xì)胞分為vector組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）和circ_0001445組（轉(zhuǎn)染circ_0001445過表達(dá)質(zhì)粒），按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24～48 h，qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，篩選收集細(xì)胞。

1.3 外泌體的提取及HBMECs細(xì)胞對其攝取的檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，更換為10%無外泌體血清的完全培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞上清，按照試劑說明書，通過差速離心法提取外泌體。隨后，用大量磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌沉淀，再用PBS重新懸液，并于-80℃保存?zhèn)溆?。采用透射電子顯微鏡鑒定外泌體形態(tài)。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體生物標(biāo)志物CD63及Alix的表達(dá)情況。濃縮外泌體懸液后，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白含量，然后在SDS樣品緩沖液中煮沸。待蛋白質(zhì)樣品電泳分離后，采用半干法轉(zhuǎn)到PVDF膜，封閉后加入一抗，置于4℃過夜，加入二抗，37℃下孵育1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus軟件對圖片條帶進(jìn)行灰度值分析。外泌體鑒定結(jié)束后，將HBMECs細(xì)胞分為兩組：T98G vector組（加入vector組T98G細(xì)胞外泌體）、T98G exo-circ_0001445組（加入circ_0001445組T98G細(xì)胞外泌體），將外泌體與各組HBMECs細(xì)胞在培養(yǎng)基中避光共培養(yǎng)24 h，洗滌固定后，RT-qPCR驗(yàn)證circ_0001445的表達(dá)。

1.4 RNA分離及RT-qPCR檢測用胰蛋白酶將各組細(xì)胞預(yù)處理。根據(jù)制造商說明，使用TRIzol試劑從細(xì)胞和組織中分離出總RNA。以GAPDH mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化檢測RNA水平，采用分光光度計測定RNA的純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指示反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。以此鏈為模板采用定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參對照。RT-qPCR的熱循環(huán)條件為：95℃3 min，然后95℃30 s，53℃30 s，74℃2 min，40個循環(huán)，最后74℃10 min。目的基因表達(dá)相對值以2-ΔΔCt法計算。引物序列如下，circ_0001445引 物 序列 為F：5′-CAAGATGGGCGAAAGTTCACT-3′，R：5′-TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT-3′。miR-127-5p引 物 序 列 為F：5'-CT CTTCAAGCTCCAAACCAAAC-3'，R：5'-GTATCCACCAGAACCACCAGG-3。GAPDH引物序列為F：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，R：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)將HBMECs細(xì)胞接種于96孔板上（2×104個/孔），接種后在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。按上述處理分為兩組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，使細(xì)胞密度為3×103個/孔。待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入外泌體干預(yù)48 h，分別向各孔中加入10 μl CCK8，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光培育2 h后，在450 nm的波長下，通過酶標(biāo)儀測出每孔吸光度（opticaldensity，OD）值，取3孔計算平均OD值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)分別將HBMECs細(xì)胞置于含有和不含有Transwell預(yù)涂的Matrigel基質(zhì)膠過濾器的上腔內(nèi)，在36孔板培養(yǎng)板上插8 μm孔。培養(yǎng)48 h后，用棉簽去除上膜上殘留的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定遷移、侵襲的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。隨機(jī)選取5個視野在100倍顯微鏡下觀察，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)用Adobe Photoshop CS6計數(shù)。

1.7 預(yù)測靶基因和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)軟件circinteractome發(fā)現(xiàn)circ_0001445存在miR-127-5p的結(jié)合片段。為證實(shí)circ_0001445與miR-127-5p之間的靶向性，將含有miR-127-5p靶向序列的circ_0001445 RNA的野生型和突變的3’-UTR序列克隆至pGL3質(zhì)粒，分別命名為WT-circ_0001445和MUT-circ_0001445。細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至80%融合度，然后分別轉(zhuǎn)染100 ng的WT-circ_0001445、MUT-circ_0001445、50nM的miR-127-5p過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒。根據(jù)制造商的說明，在轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶測定法評估熒光素酶活性，分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，作圖通過GraphPadPrism 8軟件，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0001445、miR-127-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)RT-qPCR檢測circ_0001445、miR-127-5p在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_0001445在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），而miR-127-5p顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖1。

圖1 circ_0001445、miR-127-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of circ_0001445 and miR-127-5p in glioma tissue

2.2 T98G細(xì)胞分泌外泌體的鑒定電子顯微鏡下可見外泌體呈圓形的雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)，且外泌體標(biāo)記蛋白CD63和Alix表達(dá)均呈陽性，見圖2。

圖2 T98G細(xì)胞分泌的外泌體的鑒定Figure 2 Identification of exosomes secreted by T98G cells

2.3 T98G來源的外泌體circ_0001445抑制HBMECs的增殖能力相比正常細(xì)胞，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的circ_0001445表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。過表達(dá)circ_0001145處 理T98G細(xì) 胞 后，T98G細(xì) 胞 中 的circ_0001145顯著上調(diào)（P＜0.05），使HBMECs直接與T98G細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)T98G細(xì)胞中的circ_0001145顯著增加HBMECs中circ_0001145的表達(dá)（P＜0.05），見圖3。CKK8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)T98G細(xì)胞中的circ_0001145顯著抑制了HBMECs的吸光度（P＜0.05），見圖4。

圖3 過表達(dá)T98G細(xì)胞circ_0001145Figure 3 Overexpressing T98G cells circ_0001145

圖4 外泌體circ_0001445抑制了HBMECs的吸光度Figure 4 Exosome circ_0001445 inhibited the absorbance of HBMECs

2.4 外泌體circ_0001445促進(jìn)HBMECs的遷移和侵襲Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circ_0001445可以顯著抑制HBMECs的遷移和侵襲能力（P＜0.05），見圖5。

圖5 外泌體circ_0001445促進(jìn)HBMECs的遷移侵襲（Transwell）Figure 5 Exosome circ_0001445 promotes the migration and invasion of HBMECs(Transwell)

2.5 外泌體circ_0001445與miR-127-5p靶向結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測circ_0001445與miR-127-5p具有結(jié)合位點(diǎn)；同時，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了其靶向關(guān)系，與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染組野生型純合子circ_0001445熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而突變型純合子circ_0001445熒光素酶活性無顯著差別，見圖6。

圖6 circ_0001445與miR-127-5p靶向結(jié)合Figure 6 Targeted binding of circ_0001445 to miR-127-5p

3 討論

外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用因其在癌癥等多種病理過程中具有重要作用而受到越來越多的關(guān)注[8]。外泌體的雙層脂質(zhì)膜可保護(hù)生物活性物質(zhì)不被降解，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。同時，外泌體衍生的circRNA作為信號分子調(diào)控腫瘤生長發(fā)育，是潛在的腫瘤進(jìn)展生物標(biāo)志物[9]。本研究中，鑒于膠質(zhì)瘤細(xì)胞與大腦微環(huán)境之間的相互作用可影響腦瘤的生長，故將HBMECs細(xì)胞作為研究對象。研究表明，circRNA可作為miRNA海綿，調(diào)節(jié)其表達(dá)和功能，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。circ_0001145作為一種circRNA，研究顯示，其在多種癌癥中發(fā)揮抑癌因子的作用[11]。miR-127-5p作為一種多功能調(diào)控因子，可參與多種癌癥的進(jìn)展[12]。此外，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中沉默miR-127-5p已被證明可通過細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制抵消阿霉素耐藥[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，circ_0001145在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中均顯著下調(diào)，而miR-127-5p在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)（P＜0.05），提示circ_0001145可能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌因子的作用，與既往研究[14]結(jié)果一致。

在腫瘤生長的前期，因僅能吸取周圍組織彌散的營養(yǎng)物質(zhì)，所以生長緩慢；而當(dāng)腫瘤進(jìn)入血管期時，周圍組織出現(xiàn)大量腫瘤相關(guān)血管，為腫瘤提供了充足的營養(yǎng)，促進(jìn)了腫瘤的生長。新生血管對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等至關(guān)重要，而微血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過程中起關(guān)鍵作用。因此，抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，可防止血管生成，從而抑制腫瘤的惡性發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)T98G細(xì)胞中的circ_0001145可顯著抑制HBMECs細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。結(jié)合熒光霉素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示外泌體circ_0001145可能通過靶向調(diào)控miR-127-5p，從而抑制HBMECs的增殖、遷移及侵襲能力。關(guān)于外泌體circ_0001145在HBMECs中的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索與證實(shí)。

綜上所述，外泌體circ_0001145在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且過表達(dá)外泌體circ_0001145可有效抑制HBMECs細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，其作用用機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-127-5p有關(guān)。