玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍研究進展

余艷歡，賈 波,2*，謝慶春

（1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001；2.江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

玉米是我國主要的糧食作物之一，2007年我國玉米種植面積已超過水稻，成為第一大農(nóng)作物。2015年以來，玉米年產(chǎn)量在2.6億t左右，占全國糧食總產(chǎn)量的35%以上。但是由于工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等的迅速發(fā)展，原有玉米供過于求的局面已轉(zhuǎn)變成為供不應(yīng)求的格局。如何通過提高玉米育種水平實現(xiàn)產(chǎn)量的提高是育種家關(guān)注的重要課題。常規(guī)育種方法選育一個玉米自交系需要6～8個世代，育種周期長，花費大。而采用單倍體育種技術(shù)只需要2個世代便可得到純合的DH（雙單倍體）系，能夠有效克服育種時間較長的問題，大幅度縮短玉米自交系的選育周期，快速獲得純合自交系，從而減少新品種選育時間，提高育種效率。

單倍體育種是植物育種手段之一，是利用花藥培養(yǎng)或孤雌生殖產(chǎn)生單倍體，再經(jīng)過自然或人工加倍，迅速獲得穩(wěn)定純系的育種方法。單倍體誘導(dǎo)和加倍是單倍體育種的重要環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)率和加倍率低在一定程度上限制了單倍體技術(shù)在育種中的應(yīng)用。本文總結(jié)了玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍的研究進展，并對誘導(dǎo)技術(shù)和加倍技術(shù)的優(yōu)化進行了探討，可為推進我國玉米單倍體育種提供參考。

1 誘導(dǎo)系誘導(dǎo)研究進展

單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)是以單倍體誘導(dǎo)系為父本，與母本材料雜交的過程，雜交后代會出現(xiàn)一定概率的母本單倍體。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率的高低直接影響單倍體籽粒獲取的數(shù)量。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率的提高能有效提高育種效率，降低育種成本。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的影響因素很多，科研人員主要從不同背景材料、不同生態(tài)環(huán)境、不同授粉時期等方面展開了研究。

1.1 不同遺傳背景材料對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的影響

誘導(dǎo)系具有誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的能力，不同誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率存在差異，同時，誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率也受不同遺傳背景的母本材料影響。焦仁海等利用3個誘導(dǎo)系誘導(dǎo)4個F代材料，發(fā)現(xiàn)同一誘導(dǎo)系對不同母本材料的誘導(dǎo)率不同，且不同誘導(dǎo)系對同一母本材料的誘導(dǎo)率也不相同，表明母本基因型對單倍體誘導(dǎo)效率有很大影響，誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率的高低與誘導(dǎo)系的基因型有關(guān)。Stock6是在玉米中發(fā)現(xiàn)的第1個孤雌生殖誘導(dǎo)系。才卓等對誘導(dǎo)系Stock6進行改良，選育出高頻誘導(dǎo)系吉高誘3號，平均誘導(dǎo)率達10.40%，是Stock6的10倍；利用吉高誘3號對10個基因型母本材料進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)率在5.50%～15.49%，平均誘導(dǎo)率為10.40%，也表明母本基因型對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)有重要影響。徐國良等對12份不同種質(zhì)的基礎(chǔ)材料進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景母本產(chǎn)生單倍體的頻率存在很大差異，單倍體誘導(dǎo)率在6.77%～12.14%。Chase研究認為，母本雌配子中的有害基因頻率不同影響單倍體的誘導(dǎo)效率。

針對不同背景基礎(chǔ)材料，合理利用不同單倍體誘導(dǎo)系能有效提高誘導(dǎo)效率。鄭君海等研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)系丹誘3號對旅大紅骨選系和黃早四改良系的誘導(dǎo)效率較低，而對Reid、Lancaster和PN78599種質(zhì)的誘導(dǎo)效率較高。姜龍等改良Stock6選育出誘導(dǎo)系GS11，發(fā)現(xiàn)GS11對Reid、Lancaster和唐四平頭群的誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)率均大于16.3%，對PN群的誘導(dǎo)率低，僅為5.9%。岳堯海等對農(nóng)大高誘進行改良，選育出吉誘101號，對不同血緣來源的16份玉米材料進行雜交誘導(dǎo)，平均誘導(dǎo)率為8.95%，其對Lancaster、Reid類群誘導(dǎo)率均較高，對78599血緣、丹340誘導(dǎo)率均較低。

1.2 不同生態(tài)環(huán)境對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的影響

Eder等在溫室和大田2種不同環(huán)境中種植誘導(dǎo)系，分別取其花粉誘導(dǎo)12種不同的母體材料，發(fā)現(xiàn)生長在2種環(huán)境下的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率無顯著差異。黎亮等在北京和海南2地用誘導(dǎo)系CAUHOI-1誘導(dǎo)鄭單958，多年試驗表明，其在海南冬季的誘導(dǎo)效率（3.39%）顯著高于在北京夏季（1.86%）。姜龍等用8個不同基因型組合的母本與單倍體誘導(dǎo)系JS6-1雜交，在三亞、鐵嶺和長春3種生態(tài)環(huán)境下進行誘導(dǎo)研究，發(fā)現(xiàn)在三亞的誘導(dǎo)效率顯著高于在鐵嶺和長春，而在鐵嶺和長春的誘導(dǎo)效率無顯著差異。季洪強等以5個推廣面積較大的玉米雜交種為母本，單倍體誘導(dǎo)系TY1為父本雜交，在海南、甘肅和河南鄭州3地展開研究，發(fā)現(xiàn)在海南的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率要顯著高于甘肅點和鄭州點。慈佳賓等在長春、榆樹和白城3地研究不同生態(tài)條件下玉米單倍體的誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)平均誘導(dǎo)率長春最高，為15.2%，極顯著地高于榆樹（11.1%）和白城（8.6%）2點，在長春更適合單倍體誘導(dǎo)。

1.3 不同授粉時間對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的影響

諸多學(xué)者對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率與不同授粉時間的關(guān)系展開了研究。李向永等利用5個誘導(dǎo)系進行誘導(dǎo)試驗，結(jié)果表明，延遲授粉（花絲長度≥8 cm）的誘導(dǎo)率（17.9%）高于正常授粉（花絲長度≤4 cm）的誘導(dǎo)率（6.2%），伏后授粉的誘導(dǎo)率（19.4%）高于伏期授粉的誘導(dǎo)率（6.3%）。慈佳賓等研究發(fā)現(xiàn)，花絲長短和授粉時間對誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率均有影響：延遲授粉（花絲長度≥7 cm）的平均誘導(dǎo)率要高于正常授粉（短花絲≤4 cm），伏后授粉的誘導(dǎo)率高于伏期授粉，證明延遲授粉時間和較低的溫度有利于提高誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率。Chase研究表明，通過延遲授粉的手段可以提高誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率。而黎亮等研究發(fā)現(xiàn)，在吐絲0～4 d時授粉的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率較高。楊巍等以不同的玉米雜交種為母本，與誘導(dǎo)系JS6-2雜交，發(fā)現(xiàn)在雌穗吐絲3～5 d和6～8 d時雜交授粉的單倍體平均誘導(dǎo)率高，并結(jié)合田間雜交實踐，提出了雌穗吐絲3～4 d整齊剪斷花絲、4～5 d進行雜交誘導(dǎo)的方案，該方案能夠獲得更多的單倍體籽粒。

2 玉米單倍體加倍的影響因素

2.1 不同加倍方式對單倍體加倍的影響

2.1.1 自然加倍。自然加倍指單倍體染色體在自然環(huán)境下發(fā)生的自發(fā)加倍。國外較早對此展開了研究，Chase研究發(fā)現(xiàn)，約10%的單倍體可以產(chǎn)生可育花粉，同時雄花育性和遺傳背景相關(guān)，不同基因型的單倍體雄花育性恢復(fù)能力不同。Kleiber等研究表明，溫帶優(yōu)良種質(zhì)的平均單倍體可育比例高于熱帶地方種質(zhì)；田間環(huán)境的單倍體可育比例在0～20%，而溫室環(huán)境的單倍體可育比例在0～70%。程江等研究認為，不同生態(tài)條件下玉米單倍體自然加倍率不同，海南試驗點的單倍體自然加倍率要高于貴州貴陽試驗點。陳祥等也研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)環(huán)境下的自然加倍率存在顯著差異，南濱東播自然加倍率最高，九站夏播次之，九站春播最低。

Molenaar等研究提出，輪回選擇可以明顯提高單倍體的散粉率和結(jié)實率，單倍體自然加倍率從5%左右可以增加到50%。武陽春等將單倍體育種技術(shù)與輪回選擇相結(jié)合，單倍體植株的散粉率和加倍率顯著提高，實現(xiàn)了改良群體和創(chuàng)制商業(yè)化自交系的目的。才卓團隊研究發(fā)現(xiàn)，在單倍體DH0（doubled haploid 0）世代，基于優(yōu)選單株組群輪回選擇，同樣可以迅速提高單倍體自然加倍率，并成功構(gòu)建了2個Reid群高加倍種質(zhì)，自然加倍率均超過80%。

2.1.2 人工加倍。因為絕大多數(shù)的單倍體無法自然加倍，因此使用人工加倍方法獲得更多單倍體后代是必要的。目前，仍未找到合適的物理方法應(yīng)用到實際單倍體染色體加倍中，使用化學(xué)藥劑處理加倍的方法較多，并有良好的效果。

2.1.2.1 浸種法。浸種法是將玉米單倍體種子放置在一定濃度的秋水仙素溶液中處理加倍的方法，其加倍效果與秋水仙素的濃度及處理的時間密切相關(guān)。成鍇等以不同濃度的秋水仙素（0.06%、0.1%和0.3%）溶液配以2.0%的二甲基亞砜（DMSO），分3個時間（6、12、14 h）對單倍體種子采取浸泡處理，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度為0.1%、處理時間12 h時加倍效果最高，加倍率為9.71%。張坤明等研究發(fā)現(xiàn)，浸種法加倍效果比浸芽法和注射法好，且0.2%秋水仙素浸種處理12 h效果最好，在該條件下，植株成活率、散粉率、結(jié)實率分別達78.57%、57.14%、19.64%。

2.1.2.2 浸芽法。浸芽法是待單倍體種子發(fā)芽后，芽長至1.5～2.0 cm，剪除芽鞘頂端后置于秋水仙素溶液中處理，然后清水沖洗后育苗移栽以達到單倍體染色體加倍的方法。秋水仙素濃度、處理時間和育苗的措施等都會影響加倍效果。Eder等在單倍體種子胚芽鞘長度大于1 cm時，將胚芽鞘的小尖端切下后將幼苗放入0.06%（質(zhì)量分數(shù)，下同）秋水仙素和0.5%二甲基亞砜溶液中12 h，發(fā)現(xiàn)49.4%的單倍體植株產(chǎn)生可育花粉，27.3%的單倍體自交結(jié)實。段民孝等使用0.06%秋水仙素溶液浸泡幼芽上部和幼芽全部，發(fā)現(xiàn)浸泡幼芽上部處理能夠明顯減輕藥害，加倍效果、成活率、授粉率和結(jié)實株率均比浸泡幼芽全部處理高。陶蕊等用不同方法對11份糯玉米材料的單倍體進行加倍，發(fā)現(xiàn)：浸芽法的加倍效果最好，平均散粉率為10.66%；浸根法次之，平均散粉率為6.2%；浸種法平均散粉率為4.34%；自然加倍法平均散粉率為1.05%。

2.1.2.3 浸根（苗）法。浸根法是采用一定濃度的秋水仙素溶液浸泡單倍體幼苗的根系或者基部，再用清水清洗減少秋水仙素毒害的加倍方法。Bordes等將3葉期單倍體幼苗的第1葉鞘的底部到中部浸泡在秋水仙素溶液中3 h，發(fā)現(xiàn)3組不同來源的單倍體材料的雄花可育率達30%～60%，而3組對照的雄花全部不育：浸根法加倍效果顯著。文科等將發(fā)芽5～7 cm的單倍體芽浸泡在不同濃度的秋水仙素溶液中處理18 h，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度為0.2 mg/mL時散粉率最高，為7.23%；比較不同的加倍方法，發(fā)現(xiàn)浸根法和注射法對植株傷害大，致死率大于50%。

2.1.2.4 注射法。注射法是將一定濃度的秋水仙素溶液通過注射器注射入單倍體植株的加倍方法。Eder等在單倍體幼苗生長至3～4葉期，將0.125%秋水仙素配以0.5%DMSO溶液注入分生組織上面3～5 mm的位置，散粉率為49.4%，27.3%的單倍體植株能自交結(jié)實。劉志增等研究發(fā)現(xiàn)，在6葉期用0.1%濃度的秋水仙素注射處理單倍體苗，散粉率最高，達23.08%，比對照高出3.6倍。而Liu等則在單倍體幼苗2～3葉期，用0.06%濃度秋水仙素配2.0%DMSO溶液比較浸根法、滴注心葉和注射法3種不同方法的加倍效果，發(fā)現(xiàn)注射法的加倍效果最好，平均加倍率為23%。

2.1.2.5 滴心法。滴心法是將具有加倍作用的試劑滴于單倍體幼苗心葉的方法。慈佳賓等用不同濃度（0.2、0.4、0.6 mg/mL）的秋水仙素配以2%DMSO+5%甘油作為輔助藥劑進行滴心法加倍試驗，發(fā)現(xiàn)0.4 mg/mL濃度的秋水仙素處理后散粉率最高，達28.9%。武云昊等也利用秋水仙素為加倍試劑的滴心法處理甜玉米單倍體苗，發(fā)現(xiàn)散粉株率在6.3%～13.0%，散粉株率變化幅度比較大。而成鍇等利用除草劑進行加倍試驗，將甲基胺草磷配制成濃度為20、40、80、160 μmol/L的溶液，在3葉期和5葉期時滴至單倍體苗的心葉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成活率平均為60.45%，用除草劑作為加倍試劑對幼苗毒害作用較低；濃度為80 μmol/L時處理效果最好，加倍率為8.25%，是自然加倍率的2.7倍。

2.1.2.6 幼胚加倍技術(shù)。幼胚加倍技術(shù)是將幼胚剝離后置于培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，通過遺傳標記、熒光標記等對幼胚進行早期鑒定挑選，然后通過秋水仙素或除草劑等處理加倍的方法。美國先鋒公司（American Vanguard Corporation）利用紫色遺傳標記或含有GFP（green fluorescent protein）熒光標記的誘導(dǎo)系雜交，對幼胚進行離體組織培養(yǎng)，依據(jù)標記挑選單倍體幼胚，然后將幼胚置于加入加倍試劑的培養(yǎng)基中處理，單倍體加倍率、散粉率和結(jié)實率大大提高。陳寶建等利用熒光鑒別單倍體幼胚，準確率在93%以上。利用不同濃度（0.2、0.5、1.0 μmol/L）的APM（甲基胺草磷）進行加倍處理，散粉率分別為9.5%、18.5%和37.0%，而對照均未散粉，表明APM處理幼胚能顯著提高單倍體加倍效率。范志青則利用不同濃度梯度的秋水仙素處理不同時間研究玉米單倍體幼胚加倍技術(shù)，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度為0.06%、處理時間24 h時加倍效果最好。

2.2 不同環(huán)境對單倍體加倍的影響

江禹奉等在溫室大棚和大田2種環(huán)境下，采用秋水仙素注射法和自然加倍法進行玉米單倍體加倍處理，發(fā)現(xiàn)無論是注射法還是自然加倍法，在溫室大棚環(huán)境下的散粉率均比在大田環(huán)境中有極顯著提高。許洛等在石家莊春播、夏播和三亞冬播3種生態(tài)環(huán)境下開展玉米單倍體自然加倍效果的研究，同樣發(fā)現(xiàn)，在海南三亞冬播的自然加倍效果最好（10.2%），石家莊春播次之（10.1%），石家莊夏播的加倍效果最差（2.5%）。段民孝等則認為，甘肅春季播種玉米單倍體自然加倍效果最好，授粉株率（19.69%）較高，結(jié)實株率（7.43%）最高，其次為海南冬季種植，北京春播種植加倍率最低。

2.3 不同母本基因型對單倍體加倍的影響

劉曉鑫等研究發(fā)現(xiàn)，由DH系（D12和D18）組配的雜交組合PH4CV×D12（26.0%）、PHB1M×D12（25.6%）、PHGJ4×D18（23.1%）和PH6WC×D18（21.1%）的單倍體加倍率顯著高于非DH系組配的雜交組合PHB1M×PH4CV（13.3%）和PH6WC×PHGJ4（8.2%），可見用DH系組配的雜交組合選系能顯著提高玉米雜交組合的單倍體加倍率。徐國良等研究發(fā)現(xiàn)：不同種質(zhì)材料的單倍體自交結(jié)實率差異很大，Reid群最高，為13.01%，其單倍體雄穗加倍率也較高，為18.44%；而國外雜交種7和Lancaster群單倍體結(jié)實率較低，分別只有2.30%、2.28%，其單倍體植株的雄穗加倍率也較低，分別為5.62%、9.37%；研究還證實單倍體雄穗加倍率越高，自交結(jié)實率越高。

3 問題與探討

單倍體技術(shù)在縮短育種年限、加快育種進程、提高育種效率上具有巨大的優(yōu)勢。前人對此展開了大量研究，在誘導(dǎo)率和加倍率方面取得了諸多突破，誘導(dǎo)技術(shù)和加倍技術(shù)逐漸完善，但是仍存在問題不明確或研究結(jié)果相悖的問題。因此，應(yīng)繼續(xù)加大研究力度，優(yōu)化單倍體誘導(dǎo)技術(shù)方案和加倍技術(shù)方案。

3.1 單倍體誘導(dǎo)方案

Stock6的發(fā)現(xiàn)引起玉米單倍體育種研究的高潮，在后來的幾十年里，科研人員對其不斷地改進，不斷選育出誘導(dǎo)率更高、農(nóng)藝性狀更好的誘導(dǎo)系，誘導(dǎo)效率已經(jīng)能夠滿足規(guī)?；N的需求。但誘導(dǎo)系一般生長勢較弱，需精心管理，且隨著使用年限的增加存在退化現(xiàn)象，給繁育帶來不便。大量實踐證明，可利用誘導(dǎo)系間姊妹交來保持誘導(dǎo)系的特性。此外，選育高頻誘導(dǎo)系和利用誘導(dǎo)系組配雜交種，能夠提高誘導(dǎo)系的生長勢、抗逆性和散粉性，滿足大規(guī)模誘導(dǎo)需求。單倍體育種過程中，根據(jù)受體材料和誘導(dǎo)系的生育期合理調(diào)整播期，根據(jù)育種條件選擇合適的地點和季節(jié)進行誘導(dǎo)系誘導(dǎo)，以及根據(jù)受體材料的吐絲長短選擇合適的授粉時期，均有利于提高單倍體的發(fā)生頻率。

3.2 單倍體加倍方案

單倍體加倍率低是限制玉米單倍體育種的重要因素之一。玉米中有一定比例的單倍體能夠自發(fā)加倍，但加倍率受基因型和環(huán)境的共同影響。不同材料的自然加倍率有較大差異，一般材料的自然加倍率低于10%?；贒H系表現(xiàn)水平的輪回選擇被證明是改良玉米單倍體加倍能力的有效手段。才卓等利用單倍體技術(shù)與輪回選擇相結(jié)合的方法創(chuàng)制出了自然加倍率達80%以上的高加倍種質(zhì)，實現(xiàn)了高自然加倍種質(zhì)和DH的同步創(chuàng)制，是單倍體育種的重大突破。有利的環(huán)境也能夠提高單倍體自然加倍效率，其中海南和甘肅等被認為是自然加倍率較高的地方，可根據(jù)育種條件優(yōu)先選擇。

由于高加倍育種資源匱乏，為了獲得更多單倍體后代，滿足育種需求，人工加倍是必要的。采用物理加倍，單倍體加倍頻率低，目前仍沒有合適的物理加倍方法。應(yīng)用化學(xué)藥劑加倍更為有效，加倍方法有多種，如浸種法、浸芽法和單倍體幼胚加倍法等，各種方法各有優(yōu)點和缺點。使用的加倍試劑有秋水仙素、除草劑、APM等。浸種法較為簡便，但易對種子產(chǎn)生毒害；注射法無需育苗和移栽，且用藥量少，但對操作技術(shù)要求高，注射部位和處理時間都大大影響加倍效果；浸根法加倍效果較好，但存在育苗、處理、移栽等步驟，操作繁瑣，且藥劑使用量大，成本高；浸芽法加倍效率較高，但處理程序較為復(fù)雜，對田間管理要求高，秋水仙素使用量較大；滴心法較為簡便，但不同基因型對除草劑敏感性不同；幼胚加倍技術(shù)利用單倍體幼胚培養(yǎng)加倍直接發(fā)芽生苗，避開了脫分化、再分化過程，效率高，滿足單倍體技術(shù)在商業(yè)化育種中的規(guī)模化需求，但對組培操作技術(shù)有一定的要求。隨著加倍技術(shù)的進步和完善，單倍體育種技術(shù)將得到越來越廣泛的應(yīng)用，科研機構(gòu)、高校、公司等可采用適合自身的誘導(dǎo)和加倍方案，提高育種效率。