抑癌基因TP53突變狀態(tài)與三陰性乳腺癌病人預(yù)后的研究

楊崔燕，王豪雨，陳小松，沈坤煒

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科 乳腺疾病診治中心，上海 200025）

截至2020年，女性乳腺癌已成為全球最常見的新發(fā)癌癥[1]。其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）發(fā)病占 12%～17%[2]。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC具有侵襲性較高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高及預(yù)后較差等特點(diǎn)[3]，是乳腺癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)的進(jìn)步，越來越多的研究開始關(guān)注TNBC的基因突變情況。抑癌基因TP53是TNBC中突變頻率較高的基因之一[4]，在細(xì)胞增殖和凋亡方面起到重要調(diào)節(jié)作用。TP53具有多種突變類型，包括錯(cuò)義突變、移碼突變、無義突變和剪切突變等[5]。既往研究中，TP53基因突變對(duì)于乳腺癌的生存預(yù)后影響不一[6]，尤其不同突變類型對(duì)于早期TNBC病人的預(yù)后影響尚不明確。本文旨在研究TNBC病人TP53基因體系突變的頻率和類型及其與臨床病理特征的關(guān)系，并對(duì)TP53突變與無復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival,RFS）、生存（overall survival,OS）和遠(yuǎn)處無復(fù)發(fā)生存（distant relapse-free survival,DRFS）的相關(guān)性進(jìn)行探索。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性納入2012年1月至2019年3月于本院乳腺疾病診治中心接受手術(shù)治療的早期浸潤(rùn)性TNBC病人。排除腫瘤長(zhǎng)徑＜1.0 cm、新輔助化療后達(dá)到病理完全緩解（pathological complete response,pCR）及組織標(biāo)本無法獲取的病人。收集入組病人的臨床病理資料，包括年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、細(xì)胞增殖抗原（Ki-67）表達(dá)水平、脈管癌栓、手術(shù)方式、是否接受放化療、鉑類藥物使用情況和同源重組修復(fù)（homologous recombination repair,HRR）基因突變情況。TNBC定義標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤組織標(biāo)本中雌激素受體（estrogen receptor,ER）和孕激素受體（progesterone receptor,PR）染色細(xì)胞＜1%[7]，同時(shí)結(jié)合免疫組織化學(xué)染色和熒光原位雜交 （flourescence in situ hybridization,FISH）判定人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）狀態(tài)為陰性[8]。腫瘤TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（第8 版）[9]。

二、標(biāo)本獲取及二代測(cè)序方法

入組病人的腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋后，采用MagPure FFPE DNA LQ Kit（Magen）試劑盒提取DNA。在Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)上采用AmoyDx NGS data analysis system(ANDAS)檢測(cè)基因突變情況。參考2015版美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)和分子病理協(xié)會(huì)制定的指南 （American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP指南），本研究將致病性突變及可能致病性突變定義為發(fā)生基因突變，將良性突變及不明確致病性的突變定義為未發(fā)生基因突變[10]，致病性突變及可能致病性突變判斷標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

表1 ACMG/AMP指南致病性及可能性致病突變判斷標(biāo)準(zhǔn)

三、隨訪方法及臨床終點(diǎn)評(píng)估

入組病人于本院乳腺疾病診治中心接受規(guī)律隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后3～5年每半年隨訪1次，其后每年隨訪1次。隨訪信息收集來自電話隨訪、門診病歷、住院病歷及主診醫(yī)師提供。參考2.0版乳腺癌輔助治療臨床試驗(yàn)中療效終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化定義（standardized definitions for efficacy end points,STEEP）更新[11]，RFS 定義為手術(shù)日期至乳腺癌復(fù)發(fā)（包括同側(cè)浸潤(rùn)性乳腺癌復(fù)發(fā)、局部區(qū)域浸潤(rùn)性乳腺癌復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)）或任何原因致死之間的時(shí)間；OS定義為手術(shù)日期至任何原因致死之間的時(shí)間；DRFS定義為手術(shù)日期至乳腺癌遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)或任何原因致死之間的時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用R軟件（4.1.2版）和 SPSS（26.0版）進(jìn)行分析。組間比較采用卡方檢驗(yàn)。多因素分析采用Logistic模型，結(jié)果以優(yōu)勢(shì)比（odd ratio,OR）、95%置信區(qū)間（confidence interval,CI）及 P 值展示。單因素及多因素生存分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果使用風(fēng)險(xiǎn)比 （hazard ratio,HR）、95%CI及P值展示。生存曲線采用Kaplan-Meier法分析，組間生存曲線比較進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)。亞組分析采用COX單因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，交互作用使用似然比檢驗(yàn)法 （likelihood ratiotest,LRT）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TNBC病人的臨床病理特征

本研究共納入234例早期TNBC病人。其中，年齡＞50歲133例（56.84%）；絕經(jīng)后130例（55.56%）。接受新輔助化療37例（15.81%）。腫瘤長(zhǎng)徑＞2.0 cm為 134例 （57.26%）。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 102例（43.59%）。病理類型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 205例（87.61%）。 組織學(xué)Ⅲ級(jí)172例 （73.50%）。Ki-67＞30%為173例（73.93%）。接受單純?nèi)榉壳谐?52例（64.96%）。術(shù)后接受輔助化療226例（96.58%）。使用鉑類藥物116例 （49.57%）。接受放療161例（68.80%）。局部復(fù)發(fā)30例（12.82%），出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移33例（14.10%）。存在同源重組修復(fù)（homologous recombination repair,HRR）基因突變55例（23.50%）（見表2）。

表2 病人基線特征及TP53突變分布情況[n（%）]

二、TP53突變頻率及突變類型

234例TNBC病人中，144例（61.54%）腫瘤組織存在TP53突變，其中1例同時(shí)具有2個(gè)TP53突變位點(diǎn)（p.P316Sfs*21和p.Y220C）。大多數(shù)突變分布在第5～8個(gè)外顯子區(qū)域（109例，75.69%）。排名前5的熱點(diǎn)突變?yōu)椋簆.R273H （7例，2.99%）；p.R175H （5 例，2.14%）；p.R213* （5 例，2.14%）；p.R273C（4 例，1.71%）和 p.Y220C（4 例，1.71%）（見圖1）。根據(jù)突變類型，將TP53突變?nèi)巳哼M(jìn)一步分為錯(cuò)義突變組 （85例，59.03%）和非錯(cuò)義突變組（59例，40.97%），其中，非錯(cuò)義突變類型包括移碼突變（28 例，19.44%）、無義突變（14 例，9.72%）、框內(nèi)突變（4例，2.78%）和剪切突變（13例，9.03%）。亦可根據(jù)突變位點(diǎn)分類，將發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain,DBD）及其他結(jié)構(gòu)域的TP53突變分為兩類。本研究中DBD相關(guān)突變占比為46.58%，其中73.39%為錯(cuò)義突變；非DBD相關(guān)突變占比為53.42%，其中錯(cuò)義突變僅占28.00%。

圖1 TP53突變位點(diǎn)

三、TP53突變與臨床病理特征的相關(guān)性

單因素分析發(fā)現(xiàn)，TP53突變相較于TP53野生型病人的組織學(xué)分級(jí)較高 （Ⅲ級(jí)占比為79.17%比64.44%，P=0.013），且 Ki-67＞30%的占比較高（Ki-67＞30%占比為 80.56%比 63.33%，P=0.004）。 兩組其他臨床病理特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。進(jìn)一步將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征納入多因素分析。結(jié)果提示，TP53突變與Ki-67高表達(dá)顯著相關(guān) （OR=2.40，95%CI:1.32～4.40，P=0.004）。進(jìn)一步對(duì)TP53不同突變類型的臨床病理特征進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)義突變與非錯(cuò)義突變兩組基線特征分布平衡（P值均＞0.05，見表3），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 TP53突變病人基線特征及錯(cuò)義突變分布情況[n（%）]

四、TP53突變與預(yù)后的相關(guān)性

經(jīng)過52個(gè)月的中位隨訪，234例中63例出現(xiàn)復(fù)發(fā)（30例局部復(fù)發(fā)、33例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移），43例死亡。其中，TP53突變病人出現(xiàn)38例復(fù)發(fā) （20例局部復(fù)發(fā)、18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）和21例死亡，5年RFS率、OS率及DRFS率分別為74.3%、86.5%和85.4%。TP53野生型病人出現(xiàn)25例復(fù)發(fā) （10例局部復(fù)發(fā)、15例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）和22例死亡，5年RFS率、OS率及DRFS率分別為65.6%、73.7%和76.7% 。TP53突變型組與TP53野生型組的RFS、OS及DRFS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.447、0.083和 0.131，見圖2）。進(jìn)一步，對(duì)于TP53不同突變類型的病人預(yù)后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TP53錯(cuò)義突變病人與其他突變類型病人的RFS、OS及DRFS期差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別 P=0.226、P=0.885 和 P=0.172，P 值均＞0.05，見圖2）。

圖2 不同TP53狀態(tài)病人生存曲線

對(duì)入組病人的生存預(yù)后進(jìn)行單因素分析，結(jié)果提示年齡＞50歲、腫瘤長(zhǎng)徑＞2.0 cm、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓陽(yáng)性與不良RFS顯著相關(guān) （P值均＜0.05，見表4）。同時(shí)除年齡以外的其余3項(xiàng)也是影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P值均＜0.05，見表5）。對(duì)于DRFS，僅腫瘤長(zhǎng)徑＞2.0 cm及淋巴結(jié)陽(yáng)性為其獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P值均＜0.05，見表6）。為去除臨床病理特征對(duì)TP53預(yù)后作用的干擾，將TP53突變與否與單因素分析結(jié)果有意義的臨床病理特征納入生存預(yù)后的多因素分析，結(jié)果提示，TP53突變與否與RFS無顯著相關(guān) （HR=0.67,95%CI:0.41～1.08,P=0.102），而TP53突變是OS及DRFS的保護(hù)性因素（HR=0.49,95%CI:0.27～0.90,P=0.022;HR=0.54,95%CI:0.30～0.99,P=0.047）。

表4 總?cè)巳篟FS單因素及多因素COX生存分析

表5 總?cè)巳篛S單因素及多因素COX生存分析

表6 總?cè)巳篋RFS單因素及多因素COX生存分析

五、TP53狀態(tài)對(duì)預(yù)后作用的亞組分析

根據(jù)病人不同臨床病理特征進(jìn)行亞組分析，探索TP53突變對(duì)預(yù)后的影響及其與其他臨床病理特征是否具有交互作用（見圖3）。對(duì)于RFS的分析結(jié)果提示，TP53突變與病人年齡及月經(jīng)狀態(tài)在對(duì)RFS的預(yù)測(cè)中存在交互作用 （交互作用P值均＜0.05）。在年齡≤50歲以及絕經(jīng)前/圍絕經(jīng)期的亞組中，TP53突變型病人的RFS優(yōu)于野生型病人。在針對(duì)OS的亞組分析中，TP53與年齡及月經(jīng)狀態(tài)無顯著交互作用。DRFS的亞組分析中發(fā)現(xiàn)僅年齡與TP53存在顯著交互作用（P=0.044，見圖4），在年齡≤50歲的病人中，TP53突變?yōu)楸Ｗo(hù)因素。

圖3 TP53對(duì)RFS及OS預(yù)后作用亞組分析

圖4 TP53對(duì)DRFS預(yù)后作用亞組分析

討 論

TNBC作為乳腺癌的一種高危亞型，其基因特征和預(yù)后標(biāo)志物亟待研究。TP53突變是TNBC中發(fā)生頻率最高的抑癌基因突變事件。為探索TP53突變與TNBC預(yù)后的相關(guān)性，本研究回顧性納入234例早期TNBC病人進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)與生存分析，結(jié)果顯示TP53突變較野生型病人擁有更高的Ki-67表達(dá)，且兩者預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究TNBC病人TP53突變率為61.54%。既往文獻(xiàn)報(bào)道TNBC病人TP53突變率為55%～88%[12-14]，與本研究結(jié)果類似。在突變位點(diǎn)的分布上，既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TNBC病人中TP53突變主要集中在DBD中，且突變類型大多為錯(cuò)義突變[15]，本研究發(fā)生在DBD的突變比例為46.58%，其中73.39%為錯(cuò)義突變。本研究TP53的高頻突變位點(diǎn)依次為p.R273H、p.R175H、p.R213*、p.R273C 和 p.Y220C，其中p.R273H突變頻率為2.99%。Pollock等[16]的研究對(duì)IARC、TCGA及METABRIC中乳腺癌病人的TP53突變情況進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌中TP53的高頻突變位點(diǎn)包括 p.R175H、p.R248Q、p.R273H和p.R248W。其中，p.R175H突變頻率最高，為4.7%，與本研究的最高頻突變位點(diǎn)存在差異?？赡苁怯捎谠撗芯考{入不同種族及不同分子分型的病人，其中亞洲人群占24.00%，TNBC僅占總?cè)巳旱?6.00%。同時(shí)，另外一項(xiàng)針對(duì)METABRIC和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究亦證實(shí)，乳腺癌中TP53的最高頻突變位點(diǎn)為p.R175H（1.82%），提示乳腺癌總?cè)巳旱腡P53最高頻突變位點(diǎn)可能與TNBC存在差異[17]。腫瘤中不同的TP53突變位點(diǎn)與不同的功能和預(yù)后相關(guān)。針對(duì)結(jié)腸直腸癌的研究提示，TP53 R273H突變與更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移功能相關(guān)，攜帶該突變的病人預(yù)后顯著劣于攜帶TP53 R175H突變的病人[18]。因此，TNBC病人與其他分子分型病人不同的TP53高頻突變位點(diǎn)可能與不同的生存結(jié)局相關(guān)。

在臨床病理特征方面，本研究發(fā)現(xiàn)，相較于TP53野生型病人，TP53突變型病人腫瘤組織中Ki-67＞30%的占比顯著升高。亦有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌總?cè)巳褐蠯i-67≥25%的病人TP53突變的發(fā)生頻率更高[19]。這一結(jié)果與本研究相似，但該研究并未對(duì)TNBC亞組人群進(jìn)行分析。TP53是重要的抑癌基因和轉(zhuǎn)錄因子。在DNA發(fā)生損傷或細(xì)胞遭受物理或化學(xué)壓力時(shí)，TP53上調(diào)下游p21等基因的表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯作用，進(jìn)而發(fā)揮抑癌功能。當(dāng)TP53發(fā)生突變時(shí)，可導(dǎo)致這一功能喪失，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，增加腫瘤細(xì)胞的增殖活性[20]。因此，在TNBC病人中，TP53突變提示更高的腫瘤增殖水平，可能成為腫瘤惡性程度的評(píng)估指標(biāo)。

在生存分析方面，本研究TP53野生型與突變型病人的RFS、OS及DRFS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究對(duì)于TP53在乳腺癌病人中與預(yù)后的關(guān)系結(jié)論不一。Basho等[12]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人中TP53突變與更短的 RFS及 OS顯著相關(guān) （P＜0.001）。然而該研究納入的均為晚期乳腺癌病人，TNBC僅占18.3%，未對(duì)TNBC人群進(jìn)行分析。提示TP53突變對(duì)于不同階段腫瘤的生物學(xué)行為可能發(fā)揮不同的作用。此外，有研究表明，在TNBC病人中，TP53突變是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，但在應(yīng)用化療的TNBC病人中，TP53突變與否對(duì)于生存無顯著影響[21]。本研究TNBC病人，其中226例（96.58%）均接受化療，可能部分解釋兩組病人的RFS及OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，TP53不同突變類型的預(yù)后作用尚不統(tǒng)一。本研究TP53錯(cuò)義突變與非錯(cuò)義突變的TNBC病人預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2006年一項(xiàng)研究顯示，TP53在DBD發(fā)生突變的乳腺癌病人中，錯(cuò)義突變與其他突變類型對(duì)于預(yù)后的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。然而，另一項(xiàng)研究分析804例中國(guó)乳腺癌病人循環(huán)腫瘤DNA的TP53突變情況。結(jié)果表明，發(fā)生在外顯子5～8的TP53突變是影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 （P=0.009），但對(duì)于其在TNBC亞組人群的預(yù)后作用尚不明確[21]。因此，TNBC人群中，TP53突變對(duì)預(yù)后的影響尚待進(jìn)一步探索。除TP53外，可能存在其他更重要的基因突變驅(qū)動(dòng)事件。

綜上所述，本研究回顧性分析早期TNBC人群的TP53類型及生存預(yù)后發(fā)現(xiàn)，TP53為TNBC的高頻突變 （61.54%），p.R273H為其高頻突變位點(diǎn)，TP53突變與更高的Ki-67＞30%占比相關(guān)，但其對(duì)TNBC病人的預(yù)后作用尚待進(jìn)一步研究。