循環(huán)腫瘤DNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測乳腺癌微小殘留病灶的研究

潘睿忻 綜述 陳小松，沈坤煒 審校

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科 乳腺疾病診治中心，上海 200025）

乳腺癌已成為全球女性最常見的腫瘤類型，2020年全球有近230萬新發(fā)病例，占所有腫瘤病例的11.7%[1]。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，乳腺癌治療后生存率顯著提高。但仍有20%～30%的病人面臨復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致不良預(yù)后[2]。其中，部分乳腺癌病人在接受治療后，雖達(dá)到完全緩解（complete remission,CR），但仍在隨訪期間復(fù)發(fā)，引起廣泛關(guān)注。部分學(xué)者認(rèn)為，這些病人經(jīng)過治療后體內(nèi)殘存的少數(shù)腫瘤細(xì)胞或微小病灶，是轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[3]。這些影像學(xué)手段無法檢測到的殘留病灶被稱為微小殘留病灶 （minimal residual disease,MRD）。MRD是引起乳腺癌病程進(jìn)展及復(fù)發(fā)的重要因素之一，在預(yù)后及療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測及治療指導(dǎo)中具有潛在的應(yīng)用價值和潛能。本文就乳腺癌MRD的檢測方法以及臨床意義作一綜述。

乳腺癌MRD臨床檢測方法

目前MRD主要通過液體活檢檢測[4]。液體活檢是對循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，或由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到體液中的遺傳物質(zhì)定量檢測，從而判斷病人的腫瘤負(fù)荷。檢測對象包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）、游離 DNA（cellfree DNA,cfDNA）、循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA,ctDNA）和外泌體等。目前對ctDNA及CTC的臨床研究取得不錯的結(jié)果，并在臨床中逐步應(yīng)用。

一、ctDNA

ctDNA是指由腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶或CTC凋亡、壞死或主動分泌到體液循環(huán)中的短DNA片段。通常長度在100～200 bp，可存在于血液、淋巴液、腦脊液、胸腔積液等體液中[4-5]。

目前常用以下兩種策略來評估ctDNA的水平[6]。第一種為腫瘤知情分析（tumor-informed assay），先對腫瘤組織行全外顯子（whole exome sequencing,WES）檢測，用配對血作為對照以排除非腫瘤來源的基因變異。針對腫瘤組織WES檢測結(jié)果定制個性化的基因組合（panel），并對外周血ctDNA行超深度測序，實(shí)現(xiàn)對病人個體化分析與腫瘤負(fù)荷跟蹤，靈敏度較好[7]。另一種則為腫瘤不知情分析（tumor-agnostic assay），即通過預(yù)先設(shè)定的固定panel進(jìn)行ctDNA檢測。檢測方法包括腫瘤個體化分析深度測序（cancer personalized profiling by deepsequencing，CAPP-Seq）等。

兩種檢測策略均有較成熟的檢測商品用于臨床與基礎(chǔ)研究。腫瘤知情分析策略的代表方法為Natera公司的Signatera系統(tǒng)，已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)投入臨床使用。此外，還有數(shù)字化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，磁珠乳液擴(kuò)增技術(shù)（bead-emulsionamplification-magnetic,BEAMing），安全測序系統(tǒng)技術(shù)（Safe-SeqS）等?；谀[瘤不知情分析策略的檢測系統(tǒng)，包括2020年經(jīng)FDA批準(zhǔn)的第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）檢測：FoundationOne Liquid CDx 和 Guardant360 CDx。二者均廣泛應(yīng)用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer,NSCLC）、前列腺癌等晚期腫瘤病人靶向治療的伴隨診斷[8]。

在此基礎(chǔ)上，ctDNA表觀遺傳信息改變的檢測亦備受關(guān)注，其與ctDNA基因突變情況綜合判斷，在提高檢測敏感性和準(zhǔn)確性的同時，亦可排除體細(xì)胞突變的干擾。Guardant RevealTM液體活檢產(chǎn)品綜合ctDNA的甲基化水平及突變情況，將檢測靈敏度提升至91%。由約翰霍普金斯大學(xué)金梅爾癌癥中心[9]開發(fā)的LBx-BCM試劑盒利用對特定基因甲基化水平的檢測，實(shí)現(xiàn)對晚期乳腺癌病人ctDNA的快速檢測。

這兩種策略均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。前者靈敏度更高，在個體化監(jiān)測及對復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的精準(zhǔn)追蹤中臨床應(yīng)用廣泛。多項(xiàng)針對高危乳腺癌病人的療效監(jiān)測及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的臨床試驗(yàn)中[7,10-14]，用于病人腫瘤負(fù)荷的連續(xù)追蹤。但由于其檢測panel基于原發(fā)灶基因突變，因此對新發(fā)病灶和治療過程中新發(fā)突變的檢測能力尚有不足。后者則可檢測出原發(fā)病灶中代表性不足的亞克隆突變及在治療期間藥物選擇壓力造成的新發(fā)突變，特定突變基因的追蹤檢測效益高。但panel包含過多突變靶點(diǎn)時，檢測敏感性相對不足，因此需更多的循環(huán)血樣本量或樣本中有更高的ctDNA水平才可檢出陽性[15]（見表1）。

表1 腫瘤知情分析與腫瘤不知情分析策略對比

在臨床及基礎(chǔ)研究中針對MRD，具體如何行ctDNA檢測目前尚無定論。多項(xiàng)臨床研究及實(shí)踐證實(shí)ctDNA在多種實(shí)體瘤的早期輔助診斷、臨床用藥指導(dǎo)、靶向藥物伴隨診斷、療效監(jiān)測、不良預(yù)后預(yù)警及耐藥機(jī)制探索中均有一定臨床價值。國內(nèi)2018年專家共識[16]提出，在監(jiān)測腫瘤病人是否含有已知的靶向治療敏感或耐藥性突變時可使用突變擴(kuò)增系統(tǒng)?！禼tDNA高通量測序臨床實(shí)踐專家共識（2022年版）》[17]指出，NGS可作為晚期實(shí)體腫瘤的伴隨診斷方法，并作為難以完成組織活檢的惡性腫瘤組織基因檢測替代方法。同時，在靶向或免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的療效評估以及分子靶向治療耐藥機(jī)制的識別中，NGS亦有一定的臨床價值。但共識也指出，目前臨床廣泛開展ctDNA-NGS檢測仍需更高水平的循證依據(jù)，并需對開展相關(guān)檢測的病人在檢測價值、必要性、局限性以及費(fèi)用上作充分知情告知。國際指南方面，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）2021年第2版結(jié)腸直腸癌指南指出，ctDNA是直腸癌術(shù)后可靠的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，具有指導(dǎo)輔助治療的潛力。2022年第3版NSCLC臨床實(shí)踐指南[18]指出，ctDNA可作為組織替代樣本，于靶向藥物治療開展及轉(zhuǎn)移病灶診斷中作為附加手段。但目前檢測方法及檢測策略如何選擇與進(jìn)行仍缺乏相關(guān)指南的指導(dǎo)。乳腺癌ctDNA目前主要聚焦于晚期乳腺癌臨床用藥指導(dǎo)[19]。對局部復(fù)發(fā)不可切除或轉(zhuǎn)移性激素受體（hormone receptor,HR）陽性、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）陰性乳腺癌病人在使用磷脂酰肌醇3'-激酶抑制劑或激素治療前，應(yīng)使用NGS檢測ctDNA中是否存在磷酸肌醇3激酶的p110α催化亞基 （p110 catalytic α subunit of phosphoinositol 3 kinase,PIK3CA）突變；同時在轉(zhuǎn)移性HER2陰性的乳腺癌病人應(yīng)在使用聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 （poly ADP-ribose polymerase,PARP）抑制劑治療前，完善基因的檢測以明確BRCA1/2致病性突變或可能致病性突變的存在性。上述臨床指導(dǎo)在2022年美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology,ASCO）大會中均為高證據(jù)質(zhì)量及強(qiáng)推薦的指南建議[19]。

二、CTC

CTC是指腫瘤的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶在自身腫瘤組織不穩(wěn)定或外界刺激下，自發(fā)或被動地脫落到外周循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[20]。一旦CTC成功逃避免疫監(jiān)視并在血流剪切力中存活，于靶器官微環(huán)境中定植，就可實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移病灶[21]。

外周循環(huán)的CTC含量較低。即使是在晚期轉(zhuǎn)移性癌癥病人中，與正常細(xì)胞比例也接近1/109。因此，CTC的富集分離與檢測是CTC分析過程中的關(guān)鍵步驟[22]。CTC的富集分離主要利用CTC的物理學(xué)及生物學(xué)兩種特性[22]。針對CTC與正常循環(huán)中細(xì)胞相比，體積較大、密度較小、變形性較低并有不同細(xì)胞電學(xué)表現(xiàn)的物理特征[23]，應(yīng)用密度梯度離心法、過濾法以及電學(xué)原理的OncoQuick系統(tǒng)、ISET系統(tǒng)與DEPArrayTM。但由于CTC物理學(xué)特性異質(zhì)性較大，上述方法的靈敏度及特異度均不理想。生物學(xué)方法則是通過免疫學(xué)方法對CTC表面標(biāo)志物進(jìn)行分析，包括對特異性腫瘤相關(guān)抗原的陽性富集及對白細(xì)胞共同抗原CD45的陰性富集[23]。其中已獲FDA批準(zhǔn)的CellSearch系統(tǒng)，是利用對CTC特異性表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）進(jìn)行陽性富集的評估系統(tǒng)。富集分離后，利用包括熒光原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)/實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)，對CTC中DNA、mRNA、miRNA及蛋白質(zhì)的含量及遺傳特征等分析[4]，以評估腫瘤復(fù)發(fā)事件。

CTC檢測的優(yōu)勢在于同時多維度分析DNA、RNA及蛋白質(zhì)，且可表征腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性[4]。但當(dāng)前對CTC富集分離及檢測技術(shù)的特異性均不足。由于檢測過程需多種技術(shù)參與，檢測難度大，且CTC含量低，使得CTC檢測在實(shí)際應(yīng)用中受限。

MRD檢測在乳腺癌臨床診治中的應(yīng)用

乳腺癌病人復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移提示不良預(yù)后[2]。乳腺癌病人檢出MRD，常提示高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[3]。因而MRD檢測及其臨床應(yīng)用研究的進(jìn)一步開展，具有非常重要的臨床意義。

一、MRD與乳腺癌病人的預(yù)后預(yù)測

MRD在多種實(shí)體瘤病人中證實(shí)與預(yù)后相關(guān)[24]，在乳腺癌中亦有多項(xiàng)臨床研究證實(shí)這一觀點(diǎn)。Olsson等[10]對術(shù)后早期乳腺癌病人行半年1次血樣本采集，并分析全部入組病人腫瘤原發(fā)病灶染色體重排情況，設(shè)計(jì)血樣本中ctDNA的檢測引物，發(fā)現(xiàn)基于ctDNA的MRD檢測陽性對乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的預(yù)估靈敏度為93%，特異度為100%，是早期乳腺癌病人不良預(yù)后的重要影響因素之一。且隨著病人血樣本ctDNA濃度的增加，其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)亦顯著增加。Trapp等[25]在早期高危乳腺癌病人接受輔助化療后2年對CTC檢測，發(fā)現(xiàn)CTC陽性與較差的總生存率和無病生存期（disease-free survival,DFS）相關(guān)，是導(dǎo)致病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，在luminal A型、luminal B型及三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中，CTC 陽性與不良預(yù)后顯著相關(guān)。Radovich等[26]對BRE12-158臨床試驗(yàn)中接受過新輔助治療的早期TNBC病人輔助治療階段血樣本進(jìn)行二次分析發(fā)現(xiàn)，ctDNA及CTC陽性均與更短的無遠(yuǎn)處疾病生存期（distant disease-free survival，DDFS）、DFS 相關(guān)。綜合ctDNA與CTC的結(jié)果可增加MRD檢出的敏感性和特異性，二者均為陽性的病人預(yù)后更差，提示MRD可為早期乳腺癌病人臨床風(fēng)險(xiǎn)分層提供依據(jù)。

MRD陽性與早期乳腺癌高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，那么是否可將MRD檢測結(jié)果作為乳腺癌輔助治療后隨訪的危險(xiǎn)分層因素之一，并在隨訪期間增加MRD檢測？一項(xiàng)泛實(shí)體瘤分析發(fā)現(xiàn)，相較于標(biāo)準(zhǔn)治療后單次檢測，對ctDNA-MRD多次、連續(xù)動態(tài)檢測可大幅度提高檢測的敏感性[24]。何時開始MRD檢測以及檢測頻率，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)。較多研究選擇在實(shí)體瘤病人接受標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)和輔助化療后開始MRD檢測，之后間隔2～12個月不等連續(xù)監(jiān)測。針對乳腺癌病人，MRD隨訪檢測的標(biāo)準(zhǔn)制定，亦需開展更大樣本量及長期隨訪的臨床研究以提供更多證據(jù)支持。

對于晚期乳腺癌，ctDNA檢測亦可作為預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。Turner等[27]綜合分析EFECT研究及SoFEA研究中晚期HR陽性乳腺癌病人，檢測研究基線時病人血樣本中ctDNA以評估雌激素受體1（estrogen receptor 1,ESR1）基因突變情況。研究發(fā)現(xiàn)基線時檢測到ESR1與更短的無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）相關(guān)，提示不良預(yù)后。

二、MRD與臨床復(fù)發(fā)時間間隔

MRD檢測是否可較影像學(xué)檢查或臨床癥狀更早診斷乳腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移？Coombes等[7]對EBLIS研究中完成標(biāo)準(zhǔn)治療且影像學(xué)檢查陰性的早期乳腺癌病人進(jìn)行ctDNA檢測并隨訪。發(fā)現(xiàn)MRD陽性與臨床癥狀和影像學(xué)檢查比較，提前中位8.3個月提示疾病進(jìn)展。與腫瘤指標(biāo)CA15-3比較，可提前中位200 d提示腫瘤復(fù)發(fā)。其預(yù)測復(fù)發(fā)事件的靈敏度為89%，特異度為100%。Lipsyc-Sharf等[11]則聚焦于高危HR陽性、HER2陰性乳腺癌病人，利用腫瘤知情分析策略每6～12個月對術(shù)后病人行血樣本MRD檢測。同樣發(fā)現(xiàn)相較于臨床癥狀的出現(xiàn)，ctDNA-MRD對轉(zhuǎn)移病灶的識別可提前中位時間約12.4個月。但值得注意的是，部分臨床研究在隨訪過程中對無臨床復(fù)發(fā)癥狀的術(shù)后病人未進(jìn)行常規(guī)影像學(xué)復(fù)查[11]，故ctDNA-MRD的獲益應(yīng)綜合考慮影像學(xué)檢查未能及時隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的情況。Trapp等[25]利用CellSearch系統(tǒng)對已完成治療的高危早期乳腺癌病人CTC狀態(tài)隨訪，隨訪期間發(fā)生DFS事件的101例病人中，僅有36例（35.6%）在隨訪期間檢測到CTC陽性，提早預(yù)測復(fù)發(fā)的敏感性較低，可能與其檢測方法靈敏度不足及CTC在血樣本中含量較低相關(guān)。

晚期乳腺癌中，ctDNA的動態(tài)監(jiān)測亦可更早監(jiān)測到病情進(jìn)展。Dawson等[28]對轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，在全身治療期間約每3周或更長時間間隔，連續(xù)收集血樣本及影像學(xué)信息發(fā)現(xiàn)，ctDNA的升高與CT影像學(xué)改變比較，可提前約5個月發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。且當(dāng)疾病進(jìn)展時，ctDNA水平的提升相較于腫瘤指標(biāo)CA15-3的升高顯著，可較敏感地反映疾病進(jìn)展。

三、MRD與藥物治療療效

MRD已被證實(shí)與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)，那么動態(tài)監(jiān)測MRD變化，是否可預(yù)測治療的反應(yīng)？

針對乳腺癌的化療，I-SPY2研究[12]證實(shí)MRD對化療療效的預(yù)測。該研究對接受新輔助化療的乳腺癌病人在治療開始前、新輔助化療中及手術(shù)開始前進(jìn)行基于腫瘤原發(fā)灶突變基因的ctDNA連續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)，病人ctDNA陽性率在新輔助治療過程中可能下降。治療后ctDNA陰性的病人較ctDNA陽性者，治療反應(yīng)和預(yù)后更好，證實(shí)監(jiān)測MRD狀態(tài)能預(yù)測新輔助化療的療效。在輔助化療階段，MRD亦可指導(dǎo)治療。既往研究發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)腫瘤，尤其是急性淋巴細(xì)胞白血病，化療后的鞏固治療過程中，如出現(xiàn)MRD陽性，提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，需進(jìn)行個體化加強(qiáng)治療[29]。對于實(shí)體瘤，目前有較多的研究聚焦于是否可根據(jù)MRD結(jié)果指導(dǎo)輔助治療的選擇。LUNGCA-1研究[30]利用腫瘤知情策略對接受手術(shù)的NSCLC病人在術(shù)后的第3天及1個月時行ctDNA-MRD檢測，并根據(jù)病人術(shù)前的臨床分期決定術(shù)后輔助治療與否。研究發(fā)現(xiàn)，輔助治療能為術(shù)后MRD陽性病人帶來生存獲益，未改善術(shù)后MRD陰性病人的預(yù)后。DYNAMIC研究[14]則將接受手術(shù)的Ⅱ期結(jié)腸癌病人隨機(jī)分為MRD指導(dǎo)管理組與標(biāo)準(zhǔn)管理組。前者通過腫瘤知情分析策略在手術(shù)后第4周及第7周檢測ctDNA-MRD狀態(tài)，對病人進(jìn)行危險(xiǎn)分層。MRD陽性病人進(jìn)行輔助治療，陰性病人豁免治療。標(biāo)準(zhǔn)管理組則基于傳統(tǒng)臨床病理學(xué)指標(biāo)決定輔助治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，基于ctDNA-MRD狀態(tài)的輔助治療策略相較于基于傳統(tǒng)病理學(xué)特征，能篩選出近半數(shù)病人安全豁免化療，而兩組間的2年及3年無復(fù)發(fā)生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MRD可指導(dǎo)早期結(jié)腸直腸癌病人輔助治療選擇。然而，目前基于MRD狀態(tài)制定早期乳腺癌病人輔助化療策略尚無前瞻性臨床研究結(jié)果，有待進(jìn)一步研究探索。

在乳腺癌周期蛋白依賴性激酶 （cyclin-dependent kinases,CDK4/6）抑制劑、免疫治療、PARP抑制劑等靶向治療過程中，由于藥物治療的選擇壓力，部分腫瘤細(xì)胞會發(fā)生新的突變，與耐藥相關(guān)，降低治療反應(yīng)[31]。提示如早期發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因突變，并及時更換治療方案，可能改善預(yù)后[32]。前瞻性PADA-1[13]研究對正在接受CDK4/6抑制劑與芳香化酶抑制劑治療的雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性、HER2陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，每2個治療周期采集1次血樣本以檢測ctDNA的ESR1突變情況。研究者發(fā)現(xiàn)對治療過程中出現(xiàn)ESR1突變的病人，更換為CDK4/6抑制劑聯(lián)合氟維司群，可提高PFS約6.2個月，降低死亡相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)39%。提示在治療過程中利用ctDNA監(jiān)測新發(fā)突變并及時更換耐藥藥物，可明顯改善生存。目前亦有多項(xiàng)結(jié)合MRD檢測結(jié)果與乳腺癌靶向治療方案選擇的臨床研究正在進(jìn)行中[33]。c-TRAK-TN研究 （NCT03145961）旨在評估新輔助治療后，ctDNA陽性早期TNBC病人接受帕博利珠單抗免疫治療的臨床獲益。DARE研究（NCT04567420）和LEADER研究（NCT03285412）聚焦于 CDK4/6抑制劑在 MRD陽性、ER陽性乳腺癌病人中的臨床治療獲益。ZEST研究（NCT04915755）則評估PARP抑制劑尼拉帕尼在MRD陽性、BRCA突變TNBC病人中的療效和安全性[33]。上述臨床研究將對利用MRD檢測陽性結(jié)果指導(dǎo)高危乳腺癌個體化輔助治療提供理論依據(jù)。

結(jié) 語

針對ctDNA及CTC的MRD檢測具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性及高敏感性等特點(diǎn)，較影像學(xué)檢查和臨床癥狀更好地預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，并指導(dǎo)藥物選擇以及強(qiáng)化輔助治療方案的制定。在乳腺癌治療中，針對ctDNA檢測的MRD有較好的臨床指導(dǎo)價值。隨著臨床研究的深入以及臨床檢測技術(shù)的提高，MRD有助于乳腺癌個體化治療的完善。