石墨烯量子點的制備及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

喻飛宇，吳惠霞

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

石墨烯量子點（GQDs）因為其優(yōu)良的生物相容性、出色的發(fā)光性能、較大的比表面積等特性，而受到研究者們的廣泛關(guān)注.目前，GQDs已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到了應(yīng)用，其中，應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域是研究的熱點.

GQDs由小于10層的石墨烯薄片組成，其尺寸小于100 nm.這一特性令GQDs在結(jié)構(gòu)上不同于球形的碳點（Cd）.與石墨烯類似，GQDs具有某些顯著的特征，如高導(dǎo)電性、優(yōu)異的機械強度和熱穩(wěn)定性.與石墨烯不同，基于先前的理論計算和實驗研究，GQDs被證明具有帶隙，帶隙的存在使其具有產(chǎn)生電子-空穴的能力，這種獨特的性質(zhì)拓展了石墨烯材料的應(yīng)用范圍.同時，由于邊緣和量子限制效應(yīng)，GQDs具有更好的表面接枝能力、良好的生物相容性、低毒性、化學(xué)惰性、穩(wěn)定的光致發(fā)光能力和高分散性.其中一些特性適合應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括藥物輸送、儲能、生物成像、生物傳感以及腫瘤治療.GQDs還可以通過摻雜雜原子、與聚合物或其他材料形成復(fù)合材料來實現(xiàn)功能化，如氮（N）摻雜的石墨烯量子點（NGQDs）用于聲動力治療［1］，氮硼共摻雜的石墨烯量子點（N，B-GQDs）用于腫瘤的光熱治療（PTT）［2］等.

GQDs的合成策略通常分為兩大類，即自上而下流程和自下而上流程.在自上而下的方法中，石墨烯、炭黑等塊體碳材料通過化學(xué)/電化學(xué)剝離、水/溶劑熱處理、微波/超聲等方法進行裂解，切割形成GQDs.盡管自上而下的方法，原料豐富、操作簡單，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)，但非選擇性的化學(xué)切割會導(dǎo)致對最終產(chǎn)品的尺寸和形貌控制不佳.自下而上的策略是基于小的前體分子（環(huán)狀分子、聚合物）通過碳化、熱解、化學(xué)氣相沉積等方法逐漸生長成納米級的GQDs，具有高度的可控性和較少的缺陷.然而，產(chǎn)物的溶解性和聚集性差是主要的限制因素，因此選擇合成方法時需要仔細考慮.本文作者主要介紹GQDs的制備，及其在生物醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用.

1 GQDs的制備方法

1.1 自上而下策略

1.1.1 化學(xué)剝離法

化學(xué)剝離法是指用強氧化劑和強酸對氧化石墨烯（GO）、碳納米管（CNTs）、碳纖維等先驅(qū)體碳材料進行剝離.這是一種簡便、直接、廉價的合成方法，可用于大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量的GQD.PENG等［3］用濃硫酸（H2SO4）和濃硝酸（HNO3）的混合酸剝離碳纖維制備GQDs.由于攪拌溫度不同（80，100和120℃），得到的GQDs的尺寸范圍為1～11 nm，分別發(fā)射藍色、綠色和黃色的熒光，而原子力顯微鏡顯示GQDs的高度在0.4～2 nm左右，表明石墨烯層數(shù)為單層到少數(shù)幾層.值得一提的是，碳纖維sp2結(jié)構(gòu)域的化學(xué)切割決定了GQDs的形成.

1.1.2 電化學(xué)剝離法

石墨、碳纖維、GO和多壁碳納米管（MWCNTs）已被用作合成不同尺寸和層數(shù)的量子點的前體.例如，TAN等［4］通過在0.01 mol·L-1過硫酸鉀水溶液中，于+5.0 V電勢下電解石墨棒來合成3 nm均勻尺寸的GQDs.觀察到過硫酸鉀作為支持電解質(zhì)，對于制備在365 nm輻射下產(chǎn)生紅色熒光的GQDs起重要作用.當(dāng)硫酸鈉用作支持電解質(zhì)時，觀察到非常弱的紅色熒光，而當(dāng)采用高鐵酸鉀代替過硫酸鉀時，沒有觀察到熒光.這表明硫酸鹽電解質(zhì)的選擇對于紅色熒光量子點的產(chǎn)生至關(guān)重要.硫酸根離子（SO42-）在高陽極電壓下放電，產(chǎn)生過硫酸根離子（S2O82-）.S2O82-，又經(jīng)過電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生強氧化性的硫酸根自由基SO4

-·，它的存在充當(dāng)了電化學(xué)“剪刀”，通過氧化C-C鍵將石墨烯薄片切割成小而完整的sp2結(jié)構(gòu)，這是產(chǎn)生GQDs的關(guān)鍵因素［4］.

1.1.3 水熱/溶劑熱剝離法

與其他合成方法相比，水/溶劑熱剝離是制備量子點的一種簡化方法.PAN等［5］首次通過水熱法制備了藍色發(fā)光量子點.在熱處理之前，GO片被化學(xué)氧化，因此，生成的GO碳晶格具有幾個環(huán)氧基.這些環(huán)氧基團作為一個分裂點，在水熱反應(yīng)過程中被完全破壞，產(chǎn)生GQDs.一些研究人員利用氧化劑或溫和的氧化劑來加速整個水熱反應(yīng).例如，HALDER等［6］通過在過氧化氫（H2O2）存在下，一鍋水熱剝離GO片來制備GQDs.值得注意的是，H2O2在熱處理過程中有效地剪切GO片，因此顯著加速了剝離反應(yīng).得到的量子點直徑為5 nm，具有高的光穩(wěn)定性和無細胞毒性.WANG等［7］通過一鍋水熱剝離反應(yīng)，制備了硫（S）摻雜的GQDs（S-GQDs）.所得到的S-GQDs結(jié)構(gòu)是高度結(jié)晶的，它們的尺寸范圍為2～6 nm，平均流體動力學(xué)直徑為4 nm.厚度為0.5～1.0 nm，顯示了單層至幾層厚的S-GQDs.由于硫的摻雜，S-GQDs表現(xiàn)出顯著的光致發(fā)光性能，其光致發(fā)光量子產(chǎn)率（79%）比大多數(shù)已報道的量子點高得多，并且具有優(yōu)異的光/化學(xué)穩(wěn)定性.繼水熱法之后，BOONTA等［8］最近開發(fā)了N和S共摻雜的量子點（N，S-GQDs），分別使用檸檬酸作為碳源和半胱胺鹽酸鹽作為氮和硫源.所得N和S共摻雜GQDs的平均流體力學(xué)尺寸為3.0 nm，尺寸分布為1.1～5.4 nm.由于鈷離子與碳（C）、表面N和S的官能團相互作用，通過金屬-配體相互作用機制，共摻雜量子點被用于鈷離子的熒光傳感.同時，N和S共摻雜GQDs具有優(yōu)異的光熱效果，可以用于癌癥的PTT.

1.1.4 微波/超聲輔助剝離法

由于依賴于常規(guī)加熱源（如油浴、電烘箱），化學(xué)/電化學(xué)和水熱剝落方法通常需要較長的反應(yīng)時間，因此不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)GQDs.相反，微波輻射通過提供均勻的熱量，能顯著縮短反應(yīng)時間，從而可以快速形成高質(zhì)量的GQDs.因此，將微波輻射與其他剝離方法相結(jié)合是一種有效的策略，可以在更短的時間內(nèi)獲得高產(chǎn)量的GQDs.LI等［9］首次報道了在酸性條件下通過微波輔助化學(xué)裂解GO片制備GQDs的方法.酸性裂解在GO片層上誘導(dǎo)了多個環(huán)氧基，這些環(huán)基在微波處理下很容易破裂，從而導(dǎo)致綠色熒光GQDs的形成，如圖1（a）所示.他們進一步通過用硼氫化鈉（NaBH4）還原綠色GQDs的表面官能團來制備藍色熒光GQDs.通過同時觸發(fā)酸性裂解和還原反應(yīng)，利用微波輻射將氧化和還原步驟結(jié)合在一起，一步法制備了GQDs.如圖1（b）所示，LUO等［10］報告了白色熒光GQDs（WGQDs）的兩步制備.首先，在微波輔助的酸性裂解作用下，石墨轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色熒光GQDs，然后通過微波輔助水熱（MAH）處理GQDs，得到WGQDs.

圖1 微波/超聲輔助剝離法示意圖.

除了微波輔助剝落外，超聲輔助剝落也已用于GQDs的簡便溫和制造.簡而言之，超聲波會在液體中產(chǎn)生交替的高/低壓波，從而導(dǎo)致不斷形成小真空氣泡，并使其突然崩潰.最終，這些空化產(chǎn)生了高速液體射流和強大的流體動力剪切力用以解除材料團聚［11］.利用這些功能優(yōu)勢，超聲是一種將碳基前體的分層結(jié)構(gòu)破碎成GQDs的有利策略.如圖1（c）所示，ZHUO等［12］首次從石墨烯中，通過直接超聲剝落制備了GQDs.之后，研究者們就探索了一系列碳材料，例如廉價的石墨、碳纖維、MWCNTs和GO等，用于在有機溶劑或水溶液中超聲制備GQDs［13］.

1.2 自下而上策略

1.2.1 碳化/熱解法

基于小分子/有機物前體的碳化是制備GQDs的一種簡單的方法，因此近年來已被廣泛探索.具體而言，小的有機基前驅(qū)物分子在高于其熔點的溫度下加熱，可以觸發(fā)碳成核，凝聚以及后續(xù)GQDs的形成.此種方法使用了許多前體，包括有機鹽、乙醇胺、乙酰丙酮、氨基酸、輔因子（抗壞血酸）、腐殖酸、咖啡渣、碳水化合物（蔗糖或葡萄糖）、檸檬酸等，用于制備GQDs［13］.值得一提的是，不同類型的GQDs的制備在很大程度上取決于所選的前驅(qū)體.例如，選擇鹽酸（HCl）和果糖作為Cl源和C源來制備Cl-GQD［14］.在水熱處理下，果糖內(nèi)存在的O和H基團被脫水，而C則形成了GQDs的核.同時，HCl發(fā)生催化反應(yīng)，并提供Cl摻雜劑.YIN等［15］通過使用檸檬酸銨作為C和N的前體合成高熒光N-GQDs.檸檬酸銨的均相水溶液在高溫（200℃）下碳化，產(chǎn)生GQDs，如圖2（a）所示.遵循類似的概念，有機前驅(qū)物也可以被碳化以制造雜原子共摻雜的GQDs.QU等［16］分別以硫脲和檸檬酸為前體制備了N，S共摻雜的GQDs（N，S-GQDs）.硫脲提供S和N原子，而檸檬酸被用作C源.在實驗中，首先將2種前體有效地溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中，然后在180℃加熱罩中進行熱處理.純化的GQDs厚度為1 nm，直徑為4.5 nm，由于N和S的共摻雜而表現(xiàn)出熒光特性.

對于熱解介導(dǎo)的GQDs的制備，前體分子通常分為兩類：芳香族（如苯并二氫呋喃、六苯并蔻（HBC））和非芳香族（檸檬酸、葡萄糖等）.芳香族分子具有π體系，即存在離域軌道，可以直接進行熱解制備GQDs，但非芳香族前體分子需要進行分子內(nèi)和分子間脫氫才能合成GQDs［17］.LEE等［18］以D-葡萄糖為前體制備了單晶GQDs.所制備的GQDs顯示出藍色熒光，具有六邊形晶體結(jié)構(gòu)，并且橫向尺寸為5 nm.TANG等［19］使用葡萄糖作為前體，在氨（NH3）存在下合成了N-GQDs.他們認為，NH3不僅原位摻雜了N，而且可以使葡萄糖的分子間/分子內(nèi)脫氫，如圖2（b）所示.由于石墨烯片段與HBC和其他多芳烴（PAH）的相似性，基于PAH的前體分子的可控?zé)峤庾C明了GQDs的產(chǎn)生［20］，如圖2（c）所示.除了多環(huán)芳烴外，ZHU等［21］還使用了一種含氮芳香族化合物作為前體（如三聚氰胺）在高溫（800～1 200℃）和壓力（4.0 GPa）下合成N-GQDs.所得的N-GQDs顯示出可調(diào)節(jié)的帶隙，具有石墨性質(zhì)，并且碳晶格中的N摻雜沒有任何表面官能團.

圖2 碳化/熱解法示意圖.

1.2.2 逐步有機合成/開籠法

通過逐步有機合成來制備GQDs是一種有效的溶液化學(xué)方法，可提供形貌均勻且清晰的GQDs.盡管通過逐步有機合成在制備GQDs方面取得了重大進展，但產(chǎn)生的GQDs的水溶性差，以及由于副反應(yīng)而可能導(dǎo)致分子尺寸較大是其主要瓶頸［17］.此外，由于π-π相互作用而導(dǎo)致的低產(chǎn)量以及溶液中GQDs的聚集，需要在工業(yè)上進行改良.通常，脂側(cè)鏈與芳香族分子的相互作用，使石墨烯薄片彼此更靠近，從而觸發(fā)GQDs聚集.因此GQDs邊緣的表面改性可以避免量子點發(fā)生聚集，使GQDs的分散性得到提高.

1.2.3 化學(xué)氣相沉積法

化學(xué)氣相沉積（CVD）是制備2D石墨烯的普遍方法.在CVD技術(shù)中，氫氣（H2）和C源的流量、生長時間、溫度以及基材的表面形態(tài)是關(guān)鍵參數(shù)，它們決定了最終產(chǎn)品的尺寸.通過調(diào)整這些參數(shù)，可以加快石墨烯的成核速率，使其超過生長速率，從而減小最終石墨烯產(chǎn)品的尺寸.

2 GQDs在生物醫(yī)療領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用

2.1 癌癥治療

基于GQDs的藥物遞送系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)和納米醫(yī)學(xué)中有多種應(yīng)用，可以利用多功能GQDs進行靶向細胞成像，這對于癌癥治療以及診斷具有重大意義.作為石墨烯家族中的一員，由于其低毒性、大的比表面積和強大的表面功能化能力，GQDs在藥物遞送中具有許多其他納米粒子無法比擬的優(yōu)勢.如，GQDs可以為藥物提供更多結(jié)合位點，并提高細胞攝取能力.WANG等［22］以環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（RGD）修飾的GQDs為載體，制備了一種新型的化療-光熱聯(lián)合治療的給藥系統(tǒng).首先利用硫醇化反應(yīng)將GQDs與環(huán)肽cRGD偶聯(lián)，在使用SPDP修飾的聚乙二醇（PEG-SPDP）作為交聯(lián)劑，將巰基化的多肽cRGD（cRGD-SH）連接到胺化石墨烯量子點（GQDs-NH2）上，通過透析處理得到cRGD修飾的GQDs，隨后在材料上裝載化療藥物阿霉素（DOX），如圖3所示.DOX藥物負載率高達96.6%，裝載DOX和靶向環(huán)肽的石墨烯量子點（R-GQDs@DOX）復(fù)合材料，在釋放DOX時表現(xiàn)出明顯的pH敏感性.在pH=7.4的緩沖液中，DOX的釋放少，而在pH=5.5的緩沖液中DOX的釋放量顯著增加.因此，此系統(tǒng)可以有效地響應(yīng)腫瘤酸性微環(huán)境進行藥物運輸.同時，R-GQDs@DOX也具有良好的光熱性能，在808 nm激光照射下，R-GQDs@DOX能使溫度顯著升高，這證明了R-GQDs@DOX也可以用于PTT.

圖3 R-GQDs@DOX納米顆粒的制備示意圖及其在808 nm激光照射下光熱升溫效果

HU等［23］利用強酸剝離CNTs得到GQDs，將其與一種半導(dǎo)體聚合物納米復(fù)合材料（SPN）相結(jié)合，得到了增強納米酶GQDs-SPNs，它通過光熱效應(yīng)為腫瘤提供增強的納米酶活性.近紅外光照射可以引導(dǎo)腫瘤局部溫度升高，促進內(nèi)源性H2O2分解為·OH.并且可以與SPNs產(chǎn)生的1O2協(xié)同作用殺傷癌細胞，如圖4所示.

圖4 （a）GQDs-SPNs的合成和（b）光熱效應(yīng)增強GQD-SPN/納米酶介導(dǎo)的癌癥治療機理的示意圖

通過對GQDs進行雜原子摻雜可以使其具備聲敏性，YANG等［1］制備了一種具有吡咯氮和吡啶氮結(jié)構(gòu)的N-GQDs，其聲敏化效果是傳統(tǒng)聲敏劑（如卟啉、卟啉Mn、卟啉Zn、TiO2等）的3～4倍.其獨特的吡啶N和吡咯N結(jié)構(gòu)在超聲處理過程中作為催化中心產(chǎn)生1O2.量子點經(jīng)葉酸修飾后，對荷瘤小鼠進行聲動力治療，在體內(nèi)和體外實驗中均表現(xiàn)出較高的抑瘤率（90%），如圖5所示.

圖5 FA-N-GQDs用于腫瘤聲動力治療的過程示意圖

2.2 生物成像

由于穩(wěn)定的光致發(fā)光、低的細胞毒性、優(yōu)異的溶解度和生物相容性，GQDs被證明是生物成像的極佳探針.在早期研究中，ZHU等［24］報道了大規(guī)模合成有強烈綠色熒光的GQDs的方法.產(chǎn)生的GQDs顯示出顯著的熒光，熒光量子產(chǎn)率為11.4%.此外，這種GQDs易于溶于水和大多數(shù)極性有機溶劑，從而無需進一步的化學(xué)修飾.ZHANG等［25］利用強氧化劑處理石墨得到了約10 nm的GQDs，它表現(xiàn)出良好的生理溶解性、高光穩(wěn)定性、低細胞毒性和黃綠色熒光，量子產(chǎn)率約為7%.在GQDs的生物成像應(yīng)用領(lǐng)域，仍有一些重要的問題需要解決.盡管通過不同的方法，制備了具有從紫外到近紅外發(fā)射波長的GQDs，但是這些GQDs的量子產(chǎn)率明顯低于傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點.因此，提高GQDs的量子產(chǎn)率是十分必要的.如圖6所示，XIN等［26］使用自上而下的方法，制備了不同結(jié)構(gòu)的氮摻雜石墨烯量子點（NGQDs），這種GQDs以石墨為前驅(qū)體，過硫酸銨為N源，H2O2為氧化劑，N-甲基-2-吡咯烷酮為溶劑進行合成.而且首次使用溶劑萃取法提純GQDs，分離后含有綠色熒光NGQDS（占總量的88%）和藍色熒光NGQDS（占總量的12%）.經(jīng)計算，綠色熒光NGQDs（NGQDs-d）和藍色熒光NGQDs（NGQDs-w）兩者量子產(chǎn)率分別為63.8%和26.2%，熒光量子產(chǎn)率相較于之前的研究得到了相當(dāng)大的提高，這種材料可以作為生物樣品的熒光標(biāo)記物.

圖6 具有綠色熒光NGQDs（NGQDs-d）和藍色熒光NGQDs（NGQDs-w）的合成示意圖以及細胞成像圖

2.3 生物傳感

除了生物成像外，GQDs的光學(xué)特性還被用于生物傳感.不同于生物成像，GQDs在生物傳感中的作用是檢測和指示生物分子的存在.基于GQDs的生物傳感器，利用GQDs中特定官能團與被分析的生物分子之間的親和力，當(dāng)被檢測生物分子連接到GQDs上特定官能團時，兩者之間的締合可以提供不同的電子態(tài).隨后，GQDs的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，熒光強度也發(fā)生變化.因此，可以利用熒光強度的變化作為指示來檢測一些生物分子.目前，基于GQDs的生物傳感器已經(jīng)被證明能夠檢測離子、DNA和其他各種代謝物［11，27］.ARUMUGASAMY等［28］將GQDs和功能化的MWCNTs復(fù)合到玻碳電極（GCE）表面，獲得了用于檢測多巴胺含量的電化學(xué)生物傳感器（GQDs@MWCNTs），如圖7所示.該傳感器對多巴胺具有良好的催化活性，利用差式脈沖伏安法在0.25～250 μmol·L-1的范圍內(nèi)進行測定，其檢出限為

圖7 GQDs@MWCNTs納米復(fù)合材料合成的總體反應(yīng)方案示意圖

95 nmol·L-1.

3 總結(jié)與展望

GQDs作為一種新型材料吸引了眾多科研人員的目光，由于邊緣和量子限制效應(yīng)，其具有更好的表面接枝能力、良好的生物相容性、低毒性、化學(xué)惰性、高的光穩(wěn)定性、穩(wěn)定的光致發(fā)光能力和良好的溶解性等特點，是當(dāng)下許多研究領(lǐng)域的熱點.其中，GQDs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的潛力，例如生物成像、生物傳感、藥物輸送和癌癥治療.

盡管GQDs已經(jīng)取得了顯著的進展，并已被證實其顯著的優(yōu)勢，但由于一些尚未解決的問題，如對于GQDs發(fā)光機制認識的不足，嚴重制約了量子產(chǎn)率的進一步提高，盡管人們提出了表面態(tài)、量子限制效應(yīng)、表面修飾、邊緣態(tài)、摻雜、尺寸效應(yīng)等多種發(fā)光機制，但目前還沒有一個清晰、詳細、充分的發(fā)光機制解釋，故GQDs的潛在生物成像應(yīng)用還沒有得到充分的開發(fā).另外，由于GQDs的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)強烈依賴其尺寸和形貌，所以如何控制形成高質(zhì)量、窄尺寸分布的單層GQDs仍然是一個挑戰(zhàn).總之，對于GQDs的各項研究仍處于一個探索階段，隨著探究的不斷深入，GQDs作為一種新型多功能材料在生物醫(yī)療領(lǐng)域或?qū)⒌玫礁鼮閺V泛的應(yīng)用.