生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒對酚酸脅迫下番茄生長和根際微生態(tài)的調(diào)控效應(yīng)

涂玉婷，彭智平，許楊貴，李珠嫻，黃繼川

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 / 廣東省養(yǎng)分資源循環(huán)利用與耕地保育重點實驗室 /農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，廣東廣州 510640）

近年來，我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整推動著番茄種植面積大幅增長。為了獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益，番茄周年連茬種植十分普遍[1]。但番茄是不耐連作的作物，這種高強度連續(xù)種植的生產(chǎn)模式往往造成土壤自然生態(tài)調(diào)節(jié)功能衰退，植株生長發(fā)育受限，并導(dǎo)致番茄產(chǎn)量大幅下降，減產(chǎn)率甚至高達(dá)70%[2-3]。解決連作障礙問題對保障番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4]。在連茬種植條件下，土壤中累積的化感物質(zhì)尤其是酚酸類化感物質(zhì)，對植物生理的抑制作用及對根際微生態(tài)環(huán)境惡化的誘導(dǎo)效應(yīng)是導(dǎo)致連作障礙的主導(dǎo)因素[5-6]。因此，開發(fā)高效去除土壤中累積的化感自毒物質(zhì)并改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，有望從根源上緩解連作障礙問題。

生物炭是一類以生物質(zhì)為原料、利用熱解工藝制備的多功能材料，具有孔隙豐富、吸附性強等優(yōu)異特性[7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)施用生物炭對連作土壤改良及農(nóng)作物增產(chǎn)提質(zhì)均具有一定的效果。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，施用1%的棉花秸稈生物炭可通過改善棉花根系生長、增加根系活力、優(yōu)化土壤養(yǎng)分狀況來緩解棉田連作障礙問題。Wu等[9]研究表明，在連續(xù)單作土壤中添加稻殼生物炭可以調(diào)節(jié)黃芪根際微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度和代謝，并減少病原體的數(shù)量。此外，生物炭對包括酚酸在內(nèi)的化感物質(zhì)具有良好的吸附性能，能夠有效降低土壤團(tuán)粒中化感自毒物質(zhì)的含量[10]。已有研究表明，生物炭對特定有機物的吸附受生物炭原料、熱解溫度、比表面積、孔隙性質(zhì)、芳香度、表面官能團(tuán)、表面堿度等多種因素的影響[11-12]。生物炭對酚酸的吸附量隨著熱解溫度的升高總體上呈增加趨勢。對于高溫?zé)峤庵苽渌蒙锾?，其比表面積是影響酚酸吸附量的主導(dǎo)因素[13-14]。因此，本研究選用比表面積豐富的椰殼活性炭用于生物炭基連作土壤改良劑的制備。然而，研究發(fā)現(xiàn)富集于生物炭中的高濃度化感物質(zhì)對植物根系正常生長存在抑制效應(yīng)，并且在特定條件下會經(jīng)解吸附作用再次釋放回土壤中，對作物和土壤微生物的生長代謝產(chǎn)生潛在威脅[15-16]。

過氧化鈣、過氧化鎂、過硫酸銨等無機氧化劑具有較高的熱穩(wěn)定性和反應(yīng)過程可控性，常被用于土壤原位修復(fù)、稻田地力提升、食品和醫(yī)療等領(lǐng)域[17-19]。這類過氧化物在催化條件下可分解產(chǎn)生羥基自由基、超氧自由基等強氧化性自由基，從而有效去除土壤中難降解有機物，如石油醚、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等[20-21]。黃君霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，施用過硫酸銨可一定程度優(yōu)化連作蘋果園土壤環(huán)境。據(jù)此，本研究提出將生物炭與無機氧化劑相耦合，借助“生物炭吸附-過氧化物氧化”的協(xié)同作用，實現(xiàn)對土壤中酚酸類化感物質(zhì)的有效去除和土壤微生態(tài)的正向調(diào)控。

本研究選取生產(chǎn)中廣泛使用、藥源豐富且對環(huán)境無污染的過氧化鈣為氧化劑，通過造粒技術(shù)制備生物炭-過氧化鈣復(fù)合土壤調(diào)理劑。借助番茄盆栽試驗，研究酚酸脅迫下番茄植株生長與生理指標(biāo)、果實產(chǎn)量和品質(zhì)對生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒輸入的響應(yīng)，分析施用復(fù)合顆粒對番茄根際土壤理化性質(zhì)及酚酸殘留量、細(xì)菌和真菌群落豐度的影響。通過關(guān)聯(lián)分析，揭示復(fù)合顆粒對番茄生長和根際土壤微生態(tài)調(diào)控效應(yīng)，為連作障礙土壤改良提供理論依據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用番茄品種為千禧圣女果，是廣東地區(qū)主要栽種的小番茄品種之一。供試酚酸為對香豆酸、鄰苯二甲酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸，均由阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)。盆栽試驗用土采自水稻田，為赤紅壤，pH為6.15，電導(dǎo)體(EC)值為0.26 mS/cm，有機質(zhì)含量為2.12%，堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為91.3、82.1和56.4 mg/kg。所用生物炭為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的椰殼活性炭。過氧化鈣購自上海麥克林生化科技有限公司。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒參照中國發(fā)明專利ZL 202010841842.5[23]所介紹的方法進(jìn)行制備。生物炭與過氧化鈣的質(zhì)量比為4∶1，礦物粘結(jié)劑添加量為4%。制備時先使過氧化鈣與礦物粘結(jié)劑混合粉末通過造粒機制成直徑約2.0 mm的過氧化鈣球形內(nèi)核，進(jìn)一步使用圓盤造粒技術(shù)制備得粒徑約為5 mm的生物炭包覆過氧化鈣顆粒。所制得的生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒比表面積為475.19 m2/g，最大變形力為30.12 N。同時，利用圓盤造粒機按相同配比分別制備生物炭和過氧化鈣顆粒，用于對比試驗。

1.2 試驗方法

番茄盆栽試驗于2020年9月—2021年3月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所遮陰網(wǎng)室進(jìn)行。試驗共設(shè)置5個處理，分別為：1)常規(guī)栽培(CK)；2)酚酸脅迫 (T1)；3)酚酸脅迫+30 g/kg生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒處理 (T2)；4)酚酸脅迫 + 24 g/kg生物炭顆粒 (T3)；5)酚酸脅迫+6 g/kg過氧化鈣顆粒 (T4)。其中CK、T1、T3處理通過補充適量硫酸鈣，保證各處理中鈣元素添加量一致。

研究前期使用HPLC-MS測定連作兩茬后番茄根際土中酚酸種類和含量，共鑒定出對香豆酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、香草酸、阿魏酸、肉桂酸等11種酚酸，其中前4種酚酸占已檢出酚酸總量71.5%～76.6%，也是廣泛報道的導(dǎo)致連作障礙的酚酸類化感物質(zhì)[24-25]。前期測定結(jié)果還表明，番茄根際土中對香豆酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸的含量比約為3∶1∶0.8∶0.8。且研究表明，向土壤中添加100 μg/g以上的外源酚酸，會對作物的生長和土壤微生物區(qū)系產(chǎn)生化感效應(yīng)[26-27]。綜合考慮酚酸在土壤中的吸附與轉(zhuǎn)化，本研究外源酚酸的總施用量為140 μg/g，包含75 μg/g對香豆酸、25 μg/g 鄰苯二甲酸、20 μg/g 苯甲酸、20 μg/g 對羥基苯甲酸。所有處理分別將外源添加物、基肥和酚酸溶液與已過2 mm篩的6.5 kg風(fēng)干土樣混勻后，裝入高24.0 cm、上口徑26.0 cm、底徑18.0 cm的塑料盆中。每缽移栽1株高約20 cm的番茄幼苗，每個處理5次重復(fù)，每個重復(fù)3株苗，共75盆番茄苗，隨機排列。試驗期間所有處理水肥管理一致。

1.3 測定項目與方法

在移栽后30和120天，每個處理隨機選取5株番茄苗，測定地上部及地下部鮮重，采用氯化三苯基四氮唑法測定根系活力。同時，采用抖土法收集移栽后120天 (采果盛期)的番茄植株根際土，一部分土樣經(jīng)風(fēng)干、過1 mm篩，參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[28]測定土壤pH、EC值、有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀含量等土壤理化指標(biāo)；另一部分土樣存于-80℃超低溫冰箱中，用于酚酸含量和微生物學(xué)測定。土壤中殘余酚酸采用李培棟等[29]的方法進(jìn)行提取，采用福林酚比色法測定土壤中總酚酸的殘余量。土壤總DNA使用試劑盒進(jìn)行提取，本研究使用在生態(tài)學(xué)研究中被廣泛使用的引物對3 3 8 F/806R和ITS1F/ITS2R分別對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)段進(jìn)行PCR擴增[30-32]，經(jīng)純化、定量、均一化處理后建立測序文庫，在此基礎(chǔ)上，采用基于Illumina HiSeq平臺完成測序。對所得的Raw Reads數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行過濾、拼接、OTUs聚類、物種注釋及相對豐度分析等操作。

番茄單株果實產(chǎn)量采用稱重累計法計算。各處理隨機選擇5株番茄的第2、3穗果實用于平均單果重和品質(zhì)指標(biāo)的測定。分別采用2,6-二氯酚靛酚滴定法、蒽酮比色法、酸堿滴定法測定番茄果實維生素C、可溶性糖、有機酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS 19.0進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，并通過Duncan’ s多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗。微生物多樣性數(shù)據(jù)使用QIIME和mothur軟件進(jìn)行分析。冗余分析 (redundancy analysis，RDA)用Canoco5.0軟件完成。使用Excel 2016和R語言繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對番茄植株生長和根系活力的影響

如表1所示，與CK處理相比，酚酸脅迫處理(T1)導(dǎo)致移栽后30和120天的番茄苗生物量、地下部鮮重和根冠比均顯著下降，降幅為12.1%～35.2%，植株根系活力分別下降了38.9%與44.0%?？梢?，外源酚酸明顯抑制了番茄植株的生長勢和生理活性。施用復(fù)合顆粒處理 (T2)、生物炭顆粒處理(T3)和過氧化鈣顆粒處理 (T4)的番茄生物量、地下部鮮重、根系活力均高于同時期的T1處理，顯示出一定程度的抗酚酸脅迫效果，其中以T2處理的效果最明顯。與T1處理相比，T2處理番茄苗移栽后30和120天的生物量和地下部鮮重增幅為15.9%～39.6%，根冠比分別增加了22.2%和4.7%，根系活力平均提高了47.2%。與T3和T4處理相比，T2處理的地下部鮮重增加了7.0%～25.4%，根系活力提高了14.1%～22.9%。由此可見，生物炭-過氧化鈣復(fù)合土壤調(diào)理劑可以緩解酚酸對番茄苗生長的脅迫。

表1 不同處理番茄苗的生長指標(biāo)和根系活力Table 1 Growth index and root activity of tomato plants under different treatments

2.2 不同處理對番茄果實產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

如表2所示，5個處理番茄果實單株產(chǎn)量由大到小依次為T2、T3、CK、T4、T1。與CK處理相比，T1處理的單株產(chǎn)量、單果重分別下降9.2%與16.8%，有機酸含量提高29.7%，維生素C和可溶性糖含量、糖酸比分別下降了13.9%、10.7%及30.8%。施用復(fù)合顆粒 (T2)和生物炭 (T3)均能顯著緩解酚酸脅迫對番茄產(chǎn)量形成的負(fù)效應(yīng)。其中，施用復(fù)合顆粒的增產(chǎn)效果最明顯，單株產(chǎn)量和單果重分別比T1處理提升了13.8%和20.1%，且果實Vc、可溶性糖含量均顯著提高，糖酸比增加52.6%。T2處理的番茄果實單果重、Vc和可溶性糖含量與CK處理相比差異不顯著，且T2處理的單株產(chǎn)量和糖酸比顯著高于CK處理，增幅分別為3.4%和5.5%?？梢娛┯脧?fù)合顆?？捎行Т龠M(jìn)酚酸脅迫下番茄的增產(chǎn)提質(zhì)。

表2 不同處理的番茄果實產(chǎn)量和品質(zhì)Table 2 Tomato yield and quality under different treatments

2.3 不同處理對番茄根際土壤理化性質(zhì)的影響

由表3可以看出，T1處理的番茄根際土中殘留的酚酸總量比CK處理高出36.5%。但與T1處理相比，添加復(fù)合顆粒 (T2)、生物炭 (T3)、過氧化鈣(T4)處理根際土壤中酚酸殘余量均顯著降低，降幅達(dá)41.1%～44.6%，以T2處理的去除效果最佳，其根際土壤殘余酚酸量顯著低于T3和T4處理。與CK相比，T1處理的土壤pH下降了0.17個單位，有機質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量分別降低了3.7%、0.9%和12.3%，EC值顯著增加了10.9% (P＜0.05)。與T1處理相比，T2處理的番茄根際土壤EC值下降17.7%，pH提高了0.77個單位，有機質(zhì)和堿解氮含量分別增加77.4%和2.8%。此外，與CK相比，T2處理的土壤pH提高了0.60個單位，土壤酚酸含量和EC值分別降低了24.3%和8.7%，有機質(zhì)和堿解氮含量分別提升70.7%和1.9%。可見，施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒能夠有效降低土壤中殘余酚酸含量和EC值，提高土壤pH和有機質(zhì)含量。

表3 不同處理番茄采收期根際土壤理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indxes of rhizosphere soil in tomato harvesting period under different treatments

2.4 不同處理對根際土壤微生物多樣性的影響

如圖1a和圖1b所示，與CK相比，酚酸脅迫下(T1)與土壤樣本細(xì)菌群落豐富度相關(guān)的ACE指數(shù)降低4.8%，反映物種豐富度和均勻度的香農(nóng)指數(shù)增加了5.6%。說明添加外源酚酸會降低根際土壤細(xì)菌群落豐富度，略微提高均勻度。與T1處理相比，施用復(fù)合顆粒、生物炭及過氧化鈣顆粒的T2～T4處理，均顯著提高番茄根際土細(xì)菌群落的ACE和香農(nóng)指數(shù)。其中T2處理的增幅最大，ACE和香農(nóng)指數(shù)分別增加了19.5%與13.9%。圖1a中T1處理的番茄根際土中真菌ACE指數(shù)與CK相比提高了23.7%，差異達(dá)顯著水平；圖1b中真菌香農(nóng)指數(shù)差異未達(dá)顯著水平。同T1處理相比，施用復(fù)合顆粒 (T2)處理的根際土壤真菌群落ACE和香農(nóng)指數(shù)分別下降13.2%和16.7%，且差異顯著。而T2處理土壤樣品細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)與CK相比分別增加13.7%和7.4%，細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)提高了20.6%，真菌的香農(nóng)指數(shù)下降了18.8%。

圖1 不同處理根際土壤中細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)(a)、香農(nóng)指數(shù)(b)，真菌與細(xì)菌OUT比值(c)Fig.1 ACE(a) and Shannon index (b) of bacteria and fungus in rhizosphere soil, and the ITS1/16S observed species ratio (c) of different treatments

本研究使用各處理番茄根際土壤樣品中真菌與細(xì)菌OUT數(shù)的比值，來衡量不同處理對根際土壤細(xì)菌和真菌群落之間均衡性的影響[33]，結(jié)果如圖1c所示。酚酸脅迫的T1處理的ITS1/16S OTU比值顯著高于CK，表明外源酚酸脅迫對土壤中細(xì)菌與真菌之間的平衡狀態(tài)產(chǎn)生影響，驅(qū)動土壤微生物區(qū)系向“真菌型”演變。而與T1處理相比，T2～T4處理均能顯著降低酚酸脅迫下土壤ITS1/16S的OTU比值，且添加復(fù)合顆粒 (T2)處理具有最低的比值。以上結(jié)果表明，施用復(fù)合顆粒能夠有效緩解外源酚酸對土壤微生物的趨化作用，增加根際土中細(xì)菌群落多樣性，降低真菌多樣性，優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，驅(qū)動番茄根際土壤微生物區(qū)系向“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變。

2.5 不同處理對根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

圖2a為5個處理的番茄根際土壤中門水平上的細(xì)菌群落組成，各處理根際土壤中平均相對豐度＞2%的細(xì)菌類群包括變形菌門 (相對豐度為33.8%～44.2%)、酸桿菌門 (12.%～25.6%)、放線菌門(8.6%～16.7%)、綠彎菌門 (5.7%～12.0%)、芽單胞菌門 (7.8%～11.4%)、擬桿菌門 (1.7%～5.6%)。這6類細(xì)菌占全部細(xì)菌群落的89.4%～94.8%。酚酸脅迫(T1)處理中酸桿菌門的相對豐度顯著高于CK，并導(dǎo)致其余5類細(xì)菌群落的相對豐度不同程度地下降，且差異均達(dá)顯著水平 (P＜0.05)。施用復(fù)合顆粒(T2)和過氧化鈣顆粒 (T4)處理可顯著降低酸桿菌門的相對豐度，而施用生物炭顆粒 (T3)處理對酸桿菌門豐度的影響未達(dá)顯著水平。此外，T2～T4處理均可不同程度地提高酚酸脅迫下綠彎菌門和擬桿菌門的相對豐度。

圖2 不同處理番茄根際土壤細(xì)菌門水平(a)、真菌門水平(b)和屬水平(c)群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure of bacterial microbiota at the phylum level (a), fungal microbiota at the phylum and genus levels (b , c) under different treatments

從圖2b中可以看出，5個處理的番茄根際土壤在門水平上平均相對豐度＞1%的真菌菌群包括子囊菌門 (41.7%～64.3%)、壺菌門 (2.6%～1.36%)、羅茲菌門 (0.02%～6.4%)、擔(dān)子菌門 (1.5%～4.6%)，被孢霉門 (0.2～3.1%)，這5類真菌占到已分類菌群的98.3%～99.9%。與CK處理相比，酚酸脅迫 (T1)處理導(dǎo)致子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門的相對豐度呈現(xiàn)不同程度地增加。施用固體調(diào)理劑的3個處理與T1處理相比，根際土壤在真菌門水平上的菌群豐度發(fā)生明顯變化，其中子囊菌門和被孢霉門豐度均顯著下降，羅茲菌門豐度顯著上升 (P＜0.05)。

從圖2c可以看出，與CK相比，酚酸脅迫(T1)處理導(dǎo)致番茄根際土壤中Condenascus、鐮孢菌屬、假散囊菌屬的相對豐度顯著增加 (P＜0.05)，施用3種固體調(diào)理劑的處理中，鐮孢菌屬、假散囊菌屬的相對豐度均出現(xiàn)不同程度地下降，其中施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒處理 (T2)植株和生物炭顆粒處理(T3)中，鐮孢菌屬的相對豐度與T1處理相比分別顯著下降了38.1%和36.6% (P＜0.05)。

2.6 番茄產(chǎn)量、品質(zhì)與土壤環(huán)境因子及微生物群落豐度的關(guān)聯(lián)分析

將番茄產(chǎn)量、糖酸比、土壤環(huán)境因子、平均相對豐度大于2%的細(xì)菌和大于1%的真菌群落豐度進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)本研究中番茄根際土壤pH、有機質(zhì) (OM)與土壤總酚酸 (TPhA)、電導(dǎo)率(EC)值均呈極顯著負(fù)相關(guān)。pH和OM與細(xì)菌中的綠彎菌門相對豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與擬桿菌門相對豐度呈顯著正相關(guān)，與芽單胞菌門相對豐度呈負(fù)相關(guān)；與真菌中的羅茲菌門相對豐度呈極顯著正相關(guān)，與壺菌門相對豐度呈顯著正相關(guān)；與子囊菌門相對豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。而TPhA和EC與以上菌群豐度的相關(guān)性正好相反。由此可見，土壤pH、OM與TPhA、EC對土壤中主要微生物的豐度具有相反的調(diào)控作用。圖3還表明，番茄產(chǎn)量與土壤OM、壺菌門相對豐度極顯著正相關(guān)，與土壤TPhA和EC值呈極顯著的負(fù)相關(guān)，并且與酸桿菌門和子囊菌門相對豐度也有非常顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系；體現(xiàn)番茄品質(zhì)的糖酸比 (SAR)也與土壤OM、壺菌門、擬桿菌門相對豐度呈極顯著正相關(guān)，與土壤pH呈顯著正相關(guān)，與TPhA和酸桿菌門相對豐度也呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖3 番茄產(chǎn)量、糖酸比與土壤理化性質(zhì)、優(yōu)勢菌群相對豐度之間的相關(guān)性熱圖Fig.3 Correlations between tomato yield, sugar-acid ratio, soil physicochemical properties, and relative abundance of dominant bacterial and fungi communities

采用RDA冗余分析，探討各處理根際土壤環(huán)境因子與土壤主要微生物群落豐度之間的相關(guān)關(guān)系(圖4)。RDA分析結(jié)果中第1、第2排序軸的解釋度分別為47.6%和31.6%，前兩個軸累積解釋了群落變異程度的79.2%，土壤環(huán)境因子中TphA對群落變異的解釋度為38.5% (P=0.002)，pH的解釋度為27.9%(P=0.002)，OM的解釋度為14.8% (P=0.008)，EC的解釋度為12.0% (P=0.004)，因此，TPhA、pH、OM、EC是驅(qū)動群落變異的主要土壤環(huán)境因子。RDA分析所得結(jié)果與上述Spearman相關(guān)性熱圖分析結(jié)果一致。

從圖4可以看出，各處理組樣本點能夠獲得良好地分離，說明酚酸脅迫及3種調(diào)理劑添加均對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。施用外源酚酸(T1)處理與土壤TPhA和EC值呈正相關(guān)關(guān)系，且與子囊菌門、被孢霉門、酸桿菌門豐度也呈現(xiàn)正相關(guān)。施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒的T2處理樣本點與pH和OM呈顯著正相關(guān)，與TPhA、EC呈顯著負(fù)相關(guān)，且與壺菌門和擬桿菌門的豐度呈正相關(guān)關(guān)系，而這兩類微生物與番茄產(chǎn)量和糖酸比也顯著正相關(guān)。此外，T2處理樣本點與番茄枯萎病相關(guān)的子囊菌門的豐度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。可見，施用復(fù)合顆粒的T2處理與施用酚酸的T1處理對與番茄產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵土壤環(huán)境因子和主要微生物菌群豐度具有相反的調(diào)控作用。

圖4中T2處理樣本點在pH、OM變量上和在TPhA、EC變量延長線上的各垂直投影點到原點的平均距離總體上大于T3和T4處理，表明T2處理樣本點與關(guān)鍵土壤環(huán)境因子 (pH、OM、TPhA、EC)之間的相互作用要強于T3和T4處理。因此，進(jìn)一步使用LefSe分析 (LDA effect size analysis)挖掘不同分類水平上CK、T1和T2處理的標(biāo)志性微生物(biomarker)，以評估酚酸脅迫和施用復(fù)合顆粒處理下土壤細(xì)菌和真菌的差異物種。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：線性判別分析值 (LDA值)不小于4，且顯著性檢驗P值小于0.05。從分析結(jié)果可知，酚酸脅迫T1處理與CK相比 (圖5)，顯著富集的細(xì)菌群落有酸桿菌門，富集的真菌有被孢霉門和子囊菌門，其中，被孢霉門中的被孢霉屬 (Mortierella)、子囊菌門中的鐮孢菌屬(Fusarium)、Condenascus、圓孢霉屬 (Staphylotrichum)、假散囊菌屬 (Pseudeurotium)均發(fā)生顯著富集。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒處理 (T2)與酚酸脅迫處理(T1)相比 (圖5)，顯著富集的細(xì)菌有擬桿菌門和綠彎菌門，顯著富集的真菌有羅茲菌門。進(jìn)一步對篩選出的biomaker在不同組樣本中的豐度進(jìn)行比較(圖6)。與CK相比，T1處理顯著提高了酸桿菌門、被孢霉門、子囊菌門、鐮孢菌屬、被孢霉屬的相對豐度。而與T1處理相比，施用復(fù)合顆粒T2處理對以上微生物的豐度具有抑制作用，同時，與T1處理相比，T2處理土壤中擬桿菌門、綠彎菌門和羅茲菌門的相對豐度均明顯增加。

圖4 主要細(xì)菌、真菌群落與土壤環(huán)境因子間的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of major bacterial and fungal communities, and rhizosphere soil environmental factors

圖5 基于LEfSe分析的土壤樣品細(xì)菌(a)與真菌(b)分類信息的LDA值柱狀分布圖Fig.5 LDA distribution column map based on LEfSe analysis of soil sample classification information of bacteria (a) and fungi (b)

圖6 不同處理根際土壤中標(biāo)志性微生物的相對豐度比較Fig.6 Comparison of relative abundances of biomarker in rhizosphere soil under different treatments

3 討論

3.1 施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆?？捎行コ寥乐袣堄喾铀幔纳仆寥览砘誀?/h3>

各類化感物質(zhì)中，酚酸類物質(zhì)受關(guān)注度最高且具有明顯的化感活性。已有研究表明，連作條件下土壤中逐年累積的酚酸會導(dǎo)致土壤pH下降，EC值升高，并對與土壤碳循環(huán)有關(guān)的蔗糖酶和多酚氧化酶及與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的脲酶和蛋白酶均表現(xiàn)出活性抑制效應(yīng)，從而導(dǎo)致土壤中有機質(zhì)和有效氮含量出現(xiàn)下降的現(xiàn)象[34-36]。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒中生物炭表面含有豐富的堿性官能團(tuán)，且過氧化鈣遇水分解生成強堿性的氫氧化鈣，因此復(fù)合顆粒施用于土壤中能夠有效地改善土壤酸性。同時，以生物炭為原料制備所得的復(fù)合顆粒孔隙結(jié)構(gòu)豐富，能增強土壤中水分和養(yǎng)分的吸持，使土壤EC值顯著下降，有機質(zhì)及堿解氮含量增加[37]。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒能夠通過“吸附-氧化”協(xié)同作用顯著減少土壤中的殘余酚酸[38]，此外，復(fù)合顆粒的施用可能加快土壤中微生物對酚酸的代謝降解。本研究中，復(fù)合顆?？赡芡ㄟ^以上兩種非生物與生物降解途徑實現(xiàn)對番茄根際土壤中酚酸的有效去除。

3.2 施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆?？商岣咄寥牢⑸锒鄻有?，調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)

研究表明，土壤中累積的酚酸會使土壤酸化，養(yǎng)分失衡，造成多數(shù)細(xì)菌可利用的底物減少，從而導(dǎo)致細(xì)菌多樣性下降[5,39]。而酸桿菌門是嗜酸菌，土壤酸堿度下降，對該類細(xì)菌的生長繁殖具有促進(jìn)作用，同時酸桿菌可利用廣泛的底物，且偏好營養(yǎng)不良的生態(tài)位[40-41]。子囊菌門和被孢霉門已被證實在連作條件下會大量累積，且與作物枯萎病發(fā)病率呈正相關(guān)[42]，其中酚酸對子囊菌門中的鐮孢菌屬具有明顯的生長刺激作用，是造成連作條件下番茄等作物枯萎病發(fā)生的關(guān)鍵原因之一[43-44]。本研究通過根際土壤微生物高通量測序也得到類似結(jié)果，即施加外源酚酸后土壤細(xì)菌多樣性整體下降而真菌群落多樣性增加，并驅(qū)動根際土壤微生物區(qū)系由“細(xì)菌型”演變?yōu)椤罢婢汀?。物種組成分析和組間差異顯著性分析結(jié)果進(jìn)一步表明，外源酚酸的施用導(dǎo)致土壤酸桿菌門、子囊菌門、被孢霉門、鐮孢菌屬和被孢霉屬的相對豐度顯著增加。

施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒能夠阻控土壤酸化，改善土壤養(yǎng)分狀況，從而一定程度地恢復(fù)土壤生態(tài)平衡。研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒后，土壤細(xì)菌多樣性與酚酸脅迫處理相比顯著增加，同時，擬桿菌門、綠彎菌門和羅茲菌門的相對豐度也明顯提高。其中擬桿菌門和綠彎菌門已被證實具有較多根際促生菌和病原拮抗菌，是土壤健康的標(biāo)志性微生物種群[40,45]。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒的施用還顯著減少番茄根際土壤中酸桿菌門、子囊菌門、被孢霉門、鐮孢菌屬和被孢霉屬的相對豐度。生物炭對土壤微生物群落的介導(dǎo)效應(yīng)已被廣泛證實[46]，Wu等[47]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭會對太子參根際土壤細(xì)菌和真菌的豐度及代謝特征產(chǎn)生刺激作用，尤其顯著影響鐮孢菌的代謝過程并抑制菌絲體生長，從而有效降低病原菌豐度。與酚酸脅迫處理(T1)相比，本研究中施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒(T2)處理與施用生物炭 (T3)處理分別使鐮孢菌屬的相對豐度下降38.1%和36.6%，可見兩種材料均對土壤中鐮孢菌屬具有抑制作用，且生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒的抑制效果更優(yōu)。

3.3 施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆?？蓽p輕番茄酚酸化感脅迫，提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)

酚酸類化感物質(zhì)對作物的生長表現(xiàn)出直接的抑制脅迫和間接的刺激作用。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的酚酸類物質(zhì)會導(dǎo)致植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，通過脂質(zhì)過氧化作用造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能受損，進(jìn)而影響植物的離子吸收、細(xì)胞分裂、光合作用等生物學(xué)功能[48-50]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源酚酸脅迫處理顯著降低番茄植株根系活力和生物量，果實產(chǎn)量和糖酸比也出現(xiàn)不同程度地下降，可見本試驗所采用的酚酸脅迫處理明顯抑制了番茄植株營養(yǎng)生長與生殖生長。添加生物炭-過氧化鈣復(fù)合型土壤調(diào)理劑對酚酸脅迫下番茄苗生長表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，有效提高根系活力和根冠比，且果實產(chǎn)量和果實糖酸比均獲得不同程度地提高。

已有研究證實，施用生物炭能夠有效促進(jìn)番茄根系生長并增強葉片光合作用，從而提高果實產(chǎn)量、改善果實品質(zhì)[51-53]。本研究比較了施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒和生物炭顆粒兩種處理方式，結(jié)果表明復(fù)合顆粒對酚酸脅迫條件下番茄的促生、增產(chǎn)、提質(zhì)效果要優(yōu)于生物炭。

為探究生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒在酚酸脅迫下促進(jìn)番茄生長及提高果實品質(zhì)的機制，本研究通過相關(guān)性與關(guān)聯(lián)分析和差異顯著性分析，進(jìn)一步揭示“復(fù)合顆粒-土壤環(huán)境因子-根際土壤微生物-植株”之間的互作關(guān)系。本研究表明，與番茄果實產(chǎn)量及品質(zhì)極顯著正相關(guān)的土壤環(huán)境因子為土壤pH和有機質(zhì)，關(guān)鍵微生物有擬桿菌門及壺菌門；而土壤環(huán)境因子中總酚酸、EC值，以及微生物中酸桿菌門、子囊菌門豐度均與番茄果實的產(chǎn)量及品質(zhì)具有負(fù)相關(guān)關(guān)系。施用生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆?？梢砸欢ǔ潭鹊靥岣咄寥纏H、有機質(zhì)，降低土壤殘余總酚酸和EC值。上述土壤環(huán)境因子變化可促進(jìn)擬桿菌門、壺菌門等與番茄果實產(chǎn)量和質(zhì)量顯著正相關(guān)的微生物種群豐度上升，而抑制酸桿菌門、子囊菌門等與果實產(chǎn)量和品質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)的微生物種群豐度。

4 結(jié)論

在諸多土壤環(huán)境因子中，總酚酸、pH、有機質(zhì)、EC是驅(qū)動微生物群落變異和調(diào)控番茄產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因子。生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆?？捎行Ы档屯寥罋堄嗫偡铀岷亢虴C值，并提高土壤pH和有機質(zhì)含量，恢復(fù)土壤細(xì)菌和真菌群落之間的均衡，降低酸桿菌門、子囊菌門等有害真菌的相對豐度，進(jìn)而有效緩解番茄酚酸脅迫，提高番茄植株根系活力，增加果實產(chǎn)量，并提高果實可溶性糖含量、維生素C含量和糖酸比。因此，生物炭-過氧化鈣復(fù)合顆粒是非常有應(yīng)用前景的茄果類蔬菜連作障礙土壤改良劑。