硼對豌豆根尖細胞壁組分對鋁吸附解吸的影響

馮英明，羅功榮，曲 梅，玄祖迎，李學文，麥靖文，喻 敏*

（1 佛山科學技術學院國際膜生物學與環(huán)境研究中心 / 食品科學與工程學院園藝系，廣東佛山 528200；2 佛山市林業(yè)科學研究所，廣東佛山 528000）

酸性土壤占全世界潛在可耕地的50%，而鋁毒被普遍認為是酸性土壤上限制作物生產(chǎn)的主要因素之一[1-2]。植物在遭受鋁離子脅迫的情況下會導致根尖生長受到抑制，而植物在缺硼條件下也會產(chǎn)生影響根尖生長的類似癥狀，如植物根系變短、根尖明顯膨大等[3-4]。細胞壁是植物防御外界環(huán)境脅迫影響的第一道屏障，研究表明，細胞壁是鋁的主要結合部位，鋁進入根系后大部分都會結合在細胞壁上[5-7]。植物細胞壁的組成成分主要是果膠、纖維素以及半纖維素。其中果膠是以D-半乳糖醛酸為主的一類多聚糖混合物，按照提取方法和性質不同可分為螯合態(tài)果膠 (果膠1)和堿溶態(tài)果膠 (果膠2)[8]，前者與后者相比具有分子量低、甲酯化程度高等特點[9]。半纖維素是位于纖維素和果膠之間的一類含多種糖基的多聚糖混合物，結構復雜，起到連接纖維素和果膠的作用。纖維素則是由葡萄糖組成的大分子多糖混合物，具有化學惰性。研究表明，植物在遭受鋁離子脅迫時能夠改變植物根尖尤其是伸長區(qū)細胞的細胞壁物質組成比例、含量以及細胞壁的結構[10-11]。

大量研究表明，硼能緩解植物中的鋁毒，但機制尚需要進一步明確[12-15]?；谂鹪谥参矬w內主要是以硼酸鹽多糖絡合物的形式與細胞壁結合，而細胞壁是鋁的主要結合部位，因此細胞壁結構和組成的改變則成為研究的熱點。Matoh[16]研究表明，植物細胞壁果膠上2個鼠李半乳糖醛酸聚糖 (RG-Ⅱ)可以和一個硼分子交聯(lián)形成硼酸糖二聚體 (RG-Ⅱ-B-RGII或dRG-Ⅱ-B)，由于RG-Ⅱ是共價地插入到高聚半乳糖醛酸鏈，因此進一步導致了相互交叉連接而形成的果膠網(wǎng)絡結構[17-18]。李梅等[19]研究表明，硼處理后會影響果膠對鋁的吸附解吸，推測低濃度硼處理后，硼與果膠結合屏蔽了果膠與鋁離子的結合位點，是硼緩解植物鋁毒的機制之一；但在相對較高濃度范圍內，隨著硼酸濃度的升高，果膠對鋁的吸附量降低到一定程度后，反而不斷增加，且最終超過了不加硼處理的吸附量，因此認為硼酸也可以通過增強果膠吸附鋁離子的能力，將鋁離子固定在細胞壁上，防止鋁離子進入細胞內干擾正常的生理生化反應。但在植物細胞壁中，硼對鋁的吸附解吸究竟起著什么樣的作用？還需要進一步明確。

因此，為了探究細胞壁組分對鋁的吸附解吸特征及硼的影響，基于硼酸和3-硝基苯硼酸 (3-NBA)可以與相鄰的兩個碳上同側分別連接著一個羥基的多羥基化合物發(fā)生絡合 (酯化)反應形成絡合物[20]，本研究在低硼水平下培養(yǎng)豌豆6天，提取豌豆根尖1 cm細胞壁并分離組分，對細胞壁的果膠1、果膠2、纖維素、半纖維素進行鋁的吸附解吸試驗，分析各組分對鋁吸附解吸能力的差異。同時，分別在pH 3.5和pH 4.5條件下，進行不加硼、加硼酸及3-NBA處理，比較細胞壁各組分對鋁離子吸附解吸能力的差異，進一步探究硼緩解植物鋁毒的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試豌豆 (Pisum sativum)種子材料為中豌6號種子，通過7.5%的次氯酸鈉浸泡30 min后，再用無菌的超純水清洗5～6次，挑除膨脹、漂浮、軟化等不良種子。之后用0.5 mmol/L CaCl2溶液在24℃的黑暗條件下浸泡10 h后轉入霧培箱，再用0.5 mmol/L CaCl2霧培40 h (每5 min噴霧30 s)。挑選根長2～3 cm的豌豆在硼 (H3BO3)濃度為 0.6 μmol/L的Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，此時溶液中的含硼濃度既不嚴重抑制豌豆根的正常生長，又能將細胞壁特別是細胞壁果膠中的硼含量維持在較低水平。水培6天后切取根尖1 cm根段，并放入冰乙醇中進行低溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 根尖細胞壁提取和各組分的分離提純 參考Heim 等[21]、Hoson 等[22]、Brigham 等[23]的方法 (略作修改)，提取根尖細胞壁。每個離心管收集約2 g根尖，用液氮研磨至均勻狀態(tài)后，再用冰乙醇沖洗2次 (冰乙醇每次的用量為每g根鮮重10 mL)。先用20 mL預冷 (4℃)磷酸緩沖液 (0.5 mol/L，pH 7.0)淋洗，之后再離心15 min (4500×g)，并重復3次后除去上清液。沉淀用20 mL緩沖溶液進行淋洗2次，用20 mL無菌超純水淋洗1次 (試劑用量每次均為10 mL/g)后離心。在沉淀中加進20 mL預冷 (-20℃)丙酮，室溫條件下進行振蕩浸提30 min，離心10 min (4500×g)，從而除去脂肪以及葉綠素等物質，淋洗要重復2次。再將沉淀加入20 mL 15 g/L SDS (十二烷基磺酸鈉，pH 6.5)在室溫下進行振蕩浸提30 min，離心10 min (4500×g)，從而除去酚類以及蛋白質等物質，淋洗要重復2次。之后用30 mL α-淀粉酶(10 mg/L)去除淀粉多糖 (37℃，3 h)后，并用20 mL的蒸餾水淋洗殘余的物質，淋洗要重復2次，沉淀物即是提取的細胞壁，在真空冷凍干燥機中將細胞壁凍干備用。

根尖細胞壁各組分的分離提純參考Heim等[21]、Hoson等[22]的方法并略作修改。稱取60℃下烘干的細胞壁0.1 g，用瑪瑙研缽研碎，放入10 mL離心管中，先加入10 mL咪唑溶液 (0.5 mol/L，pH 7.0)，25℃的條件下振蕩提取24 h后，再離心10 min(10000×g)，收集上清液并重復3次，之后合并上清液并量取體積，得到果膠1 (螯合態(tài)果膠)。然后向沉淀中加入10 mL Na2CO3溶液 [50 mmol/L，含20 mmol/L 反式-1,2-環(huán)已二胺四乙酸 (CDTA)]，提取果膠2 (堿溶性果膠)，方法與提取果膠1同。去果膠后的細胞壁，在25℃的條件下向沉淀中加入10 mL KOH溶液 (4 mol/L，含0.1% NaBH4)浸提2次 (每次12 h)，離心 (10000×g)后的上清液即為半纖維素，用冰乙酸中和至pH 5.0，用分子量為1000 的透析袋進行透析并量取體積。沉淀物繼續(xù)用8 mL 0.03 mol/L冰乙酸和酒精淋洗，60℃下烘干至恒重，即為纖維素。

1.2.2 細胞壁各組分性質的測定 細胞壁各組分的總糖含量用苯酚硫酸法[24-25]測定。果膠提取液在3 mol/L H2SO4作用下，沸水浴中水解1 h (果膠1提取液0.2 mL，加入2 mL 3 mol/L H2SO4水解；果膠2提取液1 mL，加入2 mL 3 mol/L H2SO4水解，吸取1mL水解液進行測定)；半纖維素提取液置于沸水浴中水解1 h (樣品水解后吸0.2 mL提取液進行測定)，纖維素用72% (w/w)的H2SO4(樣品0.1～1 mg/mL) 5℃下消化1 h，用去離子水稀釋到10倍體積 (或樣品水解后吸0.2 mL提取液進行測定)。將各組分提取液置于25 mL比色管中，加水至2 mL，加入苯酚溶液1 mL，濃H2SO410 mL，沸水浴中放置2 min后冷卻至室溫，測定吸光度 (485 nm)。以葡萄糖為標準物，制備標準曲線。

采用苯二酚比色法測定果膠的糖醛酸含量[26]，并參考Heim等[21]、Hoson等[22]的方法略作修改。取0.2 mL果膠待測液，加入1.2 mL濃H2SO4(含12.5 mmol/L Na2B4O7)，迅速放在冰水中。用旋渦混勻器進行混勻，經(jīng)沸水浴5 min后放入冰水中冷卻。然后加入20 μL 0.15%鄰苯二酚溶液 (0.5% NaOH溶解)，用旋渦混勻器混勻后，放置黑暗處準確反應30 min，測定吸光度 (520 nm)。以D-半乳糖醛酸 (分子量為212.16)為標準物，制備標準曲線。

3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸 (KDO)采用硫代巴比妥酸比色法測定[27]。吸取0.2 mL果膠待測液，加入0.1 mL H2SO4(2.1 mol/L)，在100℃條件下水解30 min，冷卻后離心 (4800×g)，吸取0.5 mL上清液放于4 mL的離心管，加入0.25 mL 的高碘酸溶液 (0.04 mol/L)，漩渦震蕩后，室溫下于黑暗處反應20 min，然后加入含2% Na2SO3的0.5 mol/L 鹽酸溶液，漩渦震蕩后，顯棕色，室溫下繼續(xù)加至棕色消失。然后加入0.5 mL 0.6% 硫代巴比妥酸 (TBA)混勻，100℃水浴15 min后，立即加入1 mL的二甲基亞砜 (DMSO)，混勻后在室溫下冷卻，測定吸光度 (548 nm)。以KDO (分子量為255.22)為標準物，制備標準曲線。

果膠甲基酯化度測定：取100 μL的果膠待測液或100 μL的提取液 (不加樣品作空白對照)，加入50 μL NaOH (1.5 mol/L)，25℃ 恒溫處理 30 min 后，加入 55 μL H2SO4(0.75 mol/L)。依次加入 200 μL Tris-HCl (200 mmol/L，pH 7.5)，80 μL MBTH (3 mg/mL，用水溶解)，20 μL 醇氧化酶 (0.01 units/μL，AO)，混合物在30℃條件下培養(yǎng)20 min，之后加入400 μL硫酸鐵銨和氨基磺酸的混合溶液 (5 mg/mL)。20 min后，在室溫條件下加水到2 mL測定吸光度(620 nm)。以甲醛為標準物，制備標準曲線。果膠甲基酯化度 (the degree of methylation，DM)為甲醛濃度與糖醛酸濃度的比值。

1.2.3 pH 3.5與pH 4.5條件下根尖細胞壁各組分對鋁的吸附解吸測定 分別吸取5 mL果膠1、果膠2、半纖維素、纖維素溶液 (經(jīng)測定，4種成分濃度依次為0.475、1.612、4.296、7.556 g/L)于透析袋中，在250 mL 0.5 mmol/L CaCl2溶液中 (pH 3.5/4.5)平衡24 h。

吸附試驗：取出透析袋并清洗后，分別浸泡在含有0.5 mmol/L CaCl2，pH 3.5、pH 4.5的200 μmol/L AlCl3溶液中 (250 mL)吸附24 h。取出透析袋，并測定底液鋁含量，以計算鋁吸附量。

解吸試驗：將吸附試驗后的透析袋再放入250 mL的0.5 mmol/L CaCl2(pH 3.5/4.5)溶液中，25℃條件下解吸24 h，取出透析袋，測定解吸液的鋁濃度，并計算鋁的解吸量。

鋁含量的測定采用鄰苯二酚紫比色法[28]，并稍作修改，控制待測液的最終pH在6.1～6.2，并使溶液中Ca2+等的濃度小于0.2 mmol/L，否則將對測定結果產(chǎn)生影響。最終測定步驟如下：取2 mL待測液于10 mL離心管中，加入200 μL 0.0375%鄰苯二酚紫顯色液后，再加入1.8 mL咪唑緩沖液 (pH 6.2)，搖勻，室溫條件下顯色20 min，測定吸光度 (584 nm)。

1.2.4 pH 3.5條件下不同硼處理對根尖細胞壁各組分對鋁的吸附解吸測定 在含0.5 mmol/L CaCl2的吸附解析溶液 (pH 3.5)中，設計無硼、50 μmol/L H3BO3和50 μmol/L 3-NBA 3個處理，分別吸取5 mL果膠1、果膠2、半纖維素和纖維素提取液于透析袋中，加入250 mL上述處理溶液，浸泡 24 h。參照1.2.3中的鋁吸附解吸方法進行試驗，測定豌豆根尖細胞壁各組分在不同硼處理下對鋁的吸附量及解吸量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果均為3次獨立試驗的平均值，所得數(shù)據(jù)用Excel 2020和SAS 9.1進行處理。

2 結果與分析

2.1 細胞壁各組分性質的測定

通過提取和測定豌豆根尖1 cm根段細胞壁各組分的含量發(fā)現(xiàn)，豌豆根尖細胞壁中纖維素含量＞半纖維素含量＞果膠2含量＞果膠1含量。其中，纖維素含量占細胞壁的51%，為主要成分；果膠1含量最少，約占4%；果膠2和半纖維素含量分別為細胞壁的 11.5% 和 28.5% (表1)。

表1 細胞壁各組分含量及其在細胞壁中的占比Table 1 The content and percentage of cell wall components

在硼 (H3BO30.6 μmol/L)水培條件下，根尖提取細胞壁的果膠中，果膠2的糖醛酸和3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸 (KDO)含量均比果膠1高，前者高3.39倍，KDO含量高6.6倍，但果膠2和果膠1的甲基脂化度數(shù)值差異較小 (表2)。

表2 低硼培養(yǎng)6天的豌豆根系中提取的果膠性質Table 2 Properties of pectin extracted from pea after 6 days of low B treatment

2.2 pH 3.5與pH 4.5條件下根尖細胞壁各組分對鋁的吸附解吸

從表3可知，在pH 3.5和pH 4.5條件下，細胞壁各組分對鋁的吸附量大小為：果膠2＞果膠1＞半纖維素＞纖維素，各組分間的吸附量差異均達到顯著水平。果膠尤其是果膠2對鋁的吸附起主要作用，表明果膠為細胞壁上鋁的吸附位點。

在pH 3.5和pH 4.5條件下，細胞壁組分對鋁的解吸率差異顯著，以果膠1最高，果膠2最低。pH 4.5條件下，果膠1和果膠2對鋁的解吸量與其它組分差異顯著，但半纖維素與纖維素對鋁的解吸量差異不顯著。pH 3.5條件下，不同細胞壁組分對鋁的解吸量均呈現(xiàn)顯著差異。在pH 3.5條件下，細胞壁各組分單位質量鋁吸附量的差異均顯著。pH 4.5條件下，果膠1和果膠2與其它組分對鋁的單位質量吸附量差異顯著，但半纖維素與纖維素之間沒有達到顯著差異。pH 3.5和pH 4.5條件下，果膠1和果膠2與其它組分對鋁的單位質量解吸量的差異均達到顯著，但半纖維素與纖維素之間沒有達到顯著差異。對鋁的單位質量解吸量表現(xiàn)為：果膠1＞果膠2＞半纖維素和纖維素。

在pH 3.5條件下，解吸率由高到低依次為：果膠1＞半纖維素＞纖維素＞果膠2；而pH 4.5時，解吸率由高到低依次為：果膠1＞纖維素＞半纖維素＞果膠2。不同細胞壁組分對鋁的吸附解吸存在明顯差異(表3)。

表3 pH 3.5和pH 4.5條件下細胞壁組分對鋁的吸附解吸量Table 3 The adsorption and desorption of aluminum by cell wall components under different pH

2.3 pH 3.5條件下硼處理根尖細胞壁各組分對鋁的吸附解吸

在加硼酸和加3-硝基苯硼酸 (3-NBA)處理下，單位質量鋁吸附量最高的均為果膠2，且顯著高于吸附量排在其次的果膠1，加硼酸處理中果膠2的單位質量鋁吸附量高達99.92 μg/mg，半纖維素和纖維素吸附量很少；果膠1的單位質量鋁吸附量也顯著高于半纖維素和纖維素，且加硼酸處理最高。

在CK和3-NBA處理條件下，鋁解吸率最高均為果膠1，且與其它細胞壁組分的差異顯著。加硼組處理鋁解吸率最高的是纖維素，但與果膠1和半纖維素間的差異均未達到顯著。3組處理中果膠2的解吸率均顯著低于其他3種細胞壁組分 (表4)。

表4 不同處理下細胞壁組分對鋁的吸附解吸Table 4 Adsorption and desorption of aluminum by cell wall component under different boron treatments

如圖1所示，與對照相比，硼酸和3-NBA處理能顯著提高果膠1對鋁的單位質量吸附量。硼酸能顯著提高果膠2對鋁的單位質量吸附量。硼酸處理使果膠1對鋁的單位質量吸附量提高了22.6%，使果膠2對鋁的單位質量吸附量提高了34.7%。3-NBA處理使果膠1對鋁的吸附量提高了17.4%，果膠2對鋁的吸附量提高了4.5%。硼酸比3-NBA處理更能顯著提高果膠對鋁的單位質量吸附量。硼酸處理后果膠2相比果膠1鋁的吸附能力增強明顯。

圖1 不同硼處理下果膠的鋁單位質量吸附量Fig.1 Aluminum adsorption per unit of pectin under different B treatments

如圖2所示，與對照相比，硼酸和3-NBA處理均能顯著降低果膠1的解吸率；對果膠2的解吸率則無顯著影響；硼酸能顯著提高半纖維素解吸率，3-NBA則無顯著影響；硼酸和3-NBA對纖維素的解吸率幾乎沒有影響。

圖2 不同硼處理下細胞壁各組分對鋁的解吸率Fig.2 Aluminum desorption rate of each cell wall component under different B treatments

3 討論

3.1 細胞壁各組分對鋁吸附解吸的差異

從以上吸附和解吸試驗結果可以看出，細胞壁各組分均能在一定程度上吸附鋁，但細胞壁組分中果膠吸附鋁的含量遠高于半纖維素和纖維素，并且果膠2吸附鋁的含量高于果膠1。植物細胞壁吸附鋁的能力不僅取決于細胞壁果膠水平，還與細胞壁纖維素和半纖維素的多糖含量有著密切的關系[29]。果膠2的解吸率低于其他3種組分，與其他3種組分的差異均達到顯著。綜合對鋁的吸附量和對鋁的解吸率表明，鋁主要積累在細胞壁的果膠上，特別是累積在果膠2上。這與其他學者發(fā)現(xiàn)的鋁與細胞壁的結合是植物根系對鋁毒脅迫響應的重要原因[30-31]相一致，本試驗也進一步表明鋁主要是與細胞壁果膠2結合。

3.2 不同pH條件下細胞壁各組分對鋁的吸附解吸

pH 3.5條件下比pH 4.5條件下吸附鋁的總量更多，高出52.6%，可能與不同pH下不同組分吸附鋁的能力差異有關，pH 3.5較pH 4.5溶液中H+濃度高，可能促使部分與果膠結合較弱的陽離子解析，使果膠對鋁的吸附增強，尤其是果膠2占細胞壁對鋁吸附量的絕大部分。根系細胞壁對鋁的吸附能力，主要取決于果膠中帶負電荷的游離羧基的多少,這不僅與果膠含量相關，還與果膠的甲基酯化程度相關，當果膠甲基酯化程度較低時常含有較多的游離羧基[32]。

3.3 不同硼處理條件下細胞壁各組分對鋁的吸附解吸量

不同硼處理均能提高果膠1和果膠2對鋁的吸附量和單位質量吸附量。果膠2對鋁單位質量吸附量的增加量大于果膠1的，而解吸率卻遠遠低于果膠1，這與果膠3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸 (KDO)值有關。鼠李半乳糖醛酸聚糖-II (RG-II)是一類結構復雜的果膠多糖，普遍存在于高等植物初生細胞壁中,是由12種不同的糖基以不同的糖苷鍵連接形成[33]。一般每條單鏈RG-II中含有1個KDO和2個芹菜糖殘基，其中芹菜糖被認為是硼與RG-II的結合位點，一般認為硼與果膠的結合量與果膠KDO的含量呈正相關。通過測定發(fā)現(xiàn)，果膠2的KDO值顯著高于果膠1，因此在相同果膠質量條件下，硼與果膠2的結合量高于果膠1。由于硼與果膠結合使果膠中負電荷增加，鋁容易結合在這些基團所帶的負電荷上[34]，從而使果膠的吸附量增加。硼處理后導致果膠1和果膠2的解吸量下降，可能由于硼處理后果膠1和果膠2吸附鋁的能力更強，使Al3+不易從果膠上解離出來。

硼處理會降低半纖維素對鋁的吸附量而提高其對鋁的解吸量，表明硼酸可能與半纖維素發(fā)生絡合反應[35]。由于半纖維素的成分復雜，可能也存在能與硼酸發(fā)生絡合反應的糖基，且猜測硼處理使半纖維素對鋁的吸附量降低而對鋁的解吸量上升的原因，是類似于較低濃度硼酸處理果膠時，硼酸與果膠絡合，屏蔽了與Al3+的結合位點，硼酸與半纖維素的結合也可能由于屏蔽了半纖維化與Al3+的結合位點，使半纖維素對鋁的吸附量降低及對鋁的解吸量上升[19]。

硼處理后纖維素對鋁的吸附量及對鋁的解吸量與對照沒有顯著差異，是因為纖維素不存在相連的兩個碳原子上各連著一個羥基的結構，所以不能與硼酸發(fā)生絡合反應。

3.4 硼酸與3-硝基苯硼酸 (3-NBA)處理對果膠鋁吸附解吸影響的差異

相比3-NBA，硼酸能更有效的提高果膠1和果膠2對鋁的吸附量和單位質量吸附量，更有效的降低果膠1和果膠2對鋁的解吸量和單位質量解吸量，這表明硼酸在緩解植物鋁毒方面比3-NBA更有效。

硼處理條件下，果膠1、果膠2和半纖維素對鋁的吸附量和解吸量有顯著影響，尤其硼處理后果膠2對鋁吸附量的增加量遠遠高于果膠1和半纖維素，這表明果膠2是硼處理后使細胞壁對鋁的吸附量和解吸量產(chǎn)生顯著差異的主要原因。

在硼處理后，與對照比果膠2顯著提高對鋁的吸附量并降低對鋁的解吸量，把鋁固定在細胞壁的果膠2上，是硼酸緩解鋁毒的重要機制之一。也可能存在其他的耐鋁毒機制，有待繼續(xù)研究。

4 結論

豌豆根尖細胞壁果膠2是根尖細胞壁主要的鋁結合位點，硼與果膠2的結合可能是硼緩解鋁毒的重要機制之一。具體表現(xiàn)為：1)豌豆根尖細胞壁各組分含量為：纖維素＞半纖維素＞果膠2＞果膠1；2)硼能夠與果膠1和果膠2發(fā)生絡合反應，與半纖維素也可能發(fā)生絡合反應，從而影響果膠1、果膠2和半纖維素對鋁的吸附解吸；3)在鋁脅迫下，根尖細胞壁中的果膠是主要的鋁結合位點，尤其是果膠2結合最多；4)硼處理后顯著影響并提高果膠2對鋁的吸附量，但解吸量變化不顯著，因此將鋁固定在細胞壁的果膠2內，可能是硼酸緩解鋁毒的重要機制之一；5) pH 3.5條件下，硼酸與3-硝基苯硼酸 (3-NBA)處理相比，更能有效地影響果膠對鋁的吸附解吸。