外源Ca2+對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗快速葉綠素?zé)晒夂?20 nm光反射動(dòng)力學(xué)的影響

陳靜怡，姜 鑫，吳 佩，崔輝梅，崔金霞

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系 / 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000）

土壤鹽漬化是全球糧食安全所面臨的一個(gè)重要威脅，世界上大約33%灌溉農(nóng)業(yè)用地受鹽漬化影響[1]，鹽可通過(guò)風(fēng)、雨及巖石風(fēng)化作用沉積在土壤中，加上氣候、地貌特征和人為因素決定其在地表的聚集位置，當(dāng)土壤層累積鹽分對(duì)作物生產(chǎn)有不利影響時(shí)，提高作物耐鹽性與控制土壤鹽分成為促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要策略[1-2]。鹽害作用于植物生長(zhǎng)任何階段，最終降低經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[3]，對(duì)植物造成離子毒害、滲透脅迫、活性氧(ROS)過(guò)量產(chǎn)生、光合過(guò)程受阻，導(dǎo)致胞內(nèi)損傷，引起葉綠素降解、膜透性增加、蛋白質(zhì)變性、核酸斷裂甚至細(xì)胞死亡等一系列不良后果[4-8]。光合作用對(duì)環(huán)境脅迫高度敏感，使得光合作用測(cè)量成為植物鹽脅迫研究的一個(gè)重要部分，鹽脅迫降低兩個(gè)光系統(tǒng)(PSI、PSⅡ)光化學(xué)效率，減少同化物和能量供應(yīng)，限制植物生長(zhǎng)發(fā)育[7-8]。

近20年來(lái)，基于“生物膜能量通量理論”的活體快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)和JIP-測(cè)定(JIP-test)，由于其無(wú)損、精確、快速等特性，已被廣泛用作研究植物生理狀態(tài)的有力工具[9-12]。利用Strasser等[12]建立的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線數(shù)據(jù)分析和處理方法—JIP-test，提供有關(guān)PSⅡ反應(yīng)中心、捕光天線復(fù)合體以及PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)結(jié)構(gòu)和功能的詳細(xì)信息[13]。由于PSⅠ天線色素發(fā)出瞬時(shí)熒光信號(hào)非常弱，而氧化態(tài)PSI反應(yīng)中心(P700+)特異性反射820 nm光[14-15]，因此，通過(guò)同步測(cè)量820 nm光反射信號(hào)來(lái)檢測(cè)PSⅠ反應(yīng)中心(P700)及原初電子供體質(zhì)藍(lán)素(PC)，從而更深入了解植物光合機(jī)構(gòu)對(duì)逆境的響應(yīng)，目前已用于研究溫度[16]、光照[17]、干旱[18]、鹽堿[19-20]、重金屬[21]和除草劑[22]等非生物脅迫下植物的光合性能。

鈣(Ca2+)是植物必需營(yíng)養(yǎng)元素，且作為第二信使對(duì)環(huán)境信號(hào)和內(nèi)源激素等許多刺激有靈敏的反應(yīng)，它穩(wěn)定膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)并控制酶活性[23-25]，當(dāng)正常條件下植物所需的Ca2+量應(yīng)用于鹽脅迫植物時(shí)，鹽脅迫植物表現(xiàn)出Ca2+缺乏狀況[26]，添加適量外源Ca2+可以緩解Ca2+缺乏，維持質(zhì)膜的基本結(jié)構(gòu)和功能，保證鹽脅迫下Ca2+信號(hào)系統(tǒng)的正常傳遞[26-29]。Ca2+也是光合釋氧的必要因素[25,27]，外源Ca2+可以顯著提高鹽脅迫下部分物種的葉綠素含量和凈光合速率[26,28]。外源鈣緩解蔬菜作物逆境脅迫的作用機(jī)理已有許多報(bào)道，然而關(guān)于鈣離子誘導(dǎo)鹽脅迫下光合作用反應(yīng)和光合機(jī)構(gòu)變化的信息較少。

本研究針對(duì)外源鈣對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗快速葉綠素?zé)晒夂?20 nm光反射動(dòng)力學(xué)的影響，探討外源鈣緩解蔬菜作物鹽害的光合生理機(jī)制，并利用主成分分析綜合評(píng)價(jià)不同鈣濃度處理的效果，以期為提高鹽環(huán)境下蔬菜作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年4月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站進(jìn)行，供試材料為耐鹽性強(qiáng)的加工番茄(Lycopersicon esculentumMill.)自交品系‘KT-7’，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。選取飽滿一致加工番茄種子，經(jīng)消毒、浸種、催芽后，播于草炭∶蛭石=2∶1 (V/V)基質(zhì)。幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)整齊、形態(tài)良好的幼苗進(jìn)行水培。將幼苗莖底部用海綿條包好，固定在開(kāi)好5孔的泡沫板上，定植于裝有10 L Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液(pH = 6.2)的12 L水桶中，每桶5株，為防止光照使桶內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液溫度升高和營(yíng)養(yǎng)液表面生長(zhǎng)綠藻，用黑色噴漆將桶身透光處噴滿。每3天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，試驗(yàn)期間營(yíng)養(yǎng)液全天通氣。

幼苗培養(yǎng)至4葉1心時(shí)分成6組進(jìn)行處理(表1)，鹽脅迫環(huán)境：100 mmol/L NaCl于處理時(shí)直接加入營(yíng)養(yǎng)液中，在NaCl脅迫下設(shè)外源噴施5個(gè)CaCl2濃度處理：0 (蒸餾水)、5、10、15、20 mmol/L，分別記為Ca0、Ca5、Ca10、Ca15、Ca20，以未添加NaCl的營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照(CK)，每日上午10:00進(jìn)行1次葉面噴施CaCl2，以均勻附于葉面且不滴落為準(zhǔn)。每個(gè)處理共15株，隨機(jī)排列試驗(yàn)，設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株。在處理第3、6、9天后，選擇第4片真葉測(cè)定快速葉綠素?zé)晒狻?20 nm光反射，處理9天后將各處理植株收獲進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Experimental treatments

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

分別用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗株高(子葉節(jié)至頂部生長(zhǎng)點(diǎn))、莖粗(子葉節(jié)處粗度)。用蒸餾水將根系表面鹽分清洗干凈，吸水紙吸干根系表面水分后，將地上部和地下部分開(kāi)測(cè)定其鮮重，得到地上部、地下部鮮重，然后將地上部和地下部分別放入信封中進(jìn)行105℃殺青30 min，80℃烘干到恒重，得到地上部、地下部干重。

1.3 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定方法

應(yīng)用連續(xù)激發(fā)式熒光儀M-PEA (Hansatech，英國(guó))，參照Schansker等[14]方法，葉片先暗適應(yīng)30 min，然后測(cè)定葉片OJIP曲線和820 nm光反射曲線。從OJIP曲線直接獲得熒光參數(shù)：Fo(初始熒光，O相)、FK(0.3 ms時(shí)熒光，K相)、FJ(2 ms時(shí)熒光，J相)、FI(30 ms時(shí)熒光，I相)、Fm(最大熒光，P 相)。根據(jù)Strasser等[12]方法對(duì)OJIP曲線進(jìn)行JIP-test分析，得到衍生參數(shù)：

1) 按公式Vt= (Ft-Fo)/(Fm-Fo)對(duì)OJIP曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到相對(duì)可變熒光Vt曲線，按公式ΔVt=Vt(處理)-Vt(對(duì)照)對(duì) Vt曲線中各處理與對(duì)照作差后，得到相對(duì)可變熒光的差異動(dòng)力學(xué)ΔVt曲線。

2) 性能指數(shù)：以吸收光能為基礎(chǔ)的PSⅡ性能指數(shù) PIabs= (RC/ABS)[φPo/(1-φPo)][Ψo/(1-Ψo)]。

3) 量子產(chǎn)額或能量分配比率參數(shù)：PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm= φPo= (Fm-Fo)/Fm；原初光化學(xué)反應(yīng)(電子傳遞至)效率Fv/Fo= φPo/(1-φPo)；捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其它電子受體概率Ψo= ETo/TRo= 1-VJ；用于電子傳遞的量子產(chǎn)額 φEo= ETo/ABS = φPo×Ψo；用于熱耗散的量子比率φDo= 1-φPo= Fo/Fm；用于還原PSⅠ受體側(cè)末端電子受體的量子產(chǎn)額φRo= REo/ABS = TRo/ABS(1-VI)。

4) 達(dá)到最大熒光值Fm時(shí)，單位葉截面積量子通量：?jiǎn)挝蝗~截面積吸收的光能ABS/CSm≈ Fm；單位葉截面積捕獲的光能TRo/CSm= φPo(ABS/CSm)；單位葉截面積電子傳遞的能量ETo/CSm= φEo(ABS/CSm)；單位葉截面積的熱耗散DIo/CSm= (ABS/CSm)-(TRo/CSm)；單位葉截面積反應(yīng)中心數(shù)量RC/CSm=φPo(VJ/Mo)(ABS/CSm)。

5) 能量比通量：?jiǎn)挝籔SⅡ活性反應(yīng)中心(PSⅡRCs)吸收的光能ABS/RC = Mo(1/VJ)(1/φPo)；單位活性PSⅡ RCs捕獲用于還原QA的能量TRo/RC =Mo(1/VJ)；單位活性PSⅡ RCs捕獲用于電子傳遞的能量ETo/RC = Mo(1/VJ)Ψo；單位活性PSⅡ RCs熱耗散的能量DIo/RC = ABS/RC-TRo/RC。

6) 參照Guo等[22]的方法，排除其他因素對(duì)820 nm光反射的干擾，采用MR/MRo表示820 nm光反射動(dòng)力學(xué)曲線，MRo是光化照明開(kāi)始時(shí)(0.7 ms)信號(hào)值，定量分析不同處理對(duì)820 nm光反射的影響，根據(jù)MR/MRo曲線計(jì)算以下參數(shù)，ΔMRfast/MRo=(MRo-MRmin)/MRo，表示快速下降階段反映PC和P700的氧化態(tài)；ΔMRslow/MRo= (MRmax-MRmin)/MRo，表示緩慢上升階段反映PC+和P700+的再還原狀態(tài)；Vox表示PC和P700氧化速率；Vred表示PC+和P700+再還原速率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算，用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析，結(jié)合Duncan檢驗(yàn)法對(duì)顯著性差異(P＜0.05)進(jìn)行多重比較，用OriginPro軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

表2所示，鹽脅迫下加工番茄幼苗生長(zhǎng)顯著受到抑制，Ca0處理的株高、莖粗、地上部鮮重與干重、地下部鮮重與干重分別比CK顯著降低了40.05%、25.94%、63.60%、39.74%、53.83%、47.37%，當(dāng)Ca2+濃度≤15 mmol/L時(shí)，生長(zhǎng)指標(biāo)隨Ca2+濃度升高呈增加趨勢(shì)，Ca15處理對(duì)鹽脅迫抑制幼苗生長(zhǎng)的緩解作用最佳，Ca15處理的株高、莖粗、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重分別比Ca0處理增加33.19%、21.72%、129.94%、38.13%、149.50%和117.50%。

表2 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of exogenous CaCl2 on the plant growth parameters of processing tomato seedlings under salt stress

2.2 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的影響

圖1-a、b、c顯示，隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，不同濃度CaCl2處理下葉片OJIP曲線發(fā)生不同程度變形，鹽脅迫9天時(shí)，與CK相比，Ca0處理下OJIP曲線發(fā)生變形：K相出現(xiàn)、J相升高、I-P相振幅減小、曲線趨于平緩，與Ca0相比，Ca15處理曲線變形幅度最小。鹽脅迫9天，與CK相比，Ca0處理下Vt曲線的 K、J相明顯上升 (圖1-d、e、f)，ΔVt曲線中ΔK＞0 (圖1-g、h、i)，表明PSⅡ供體側(cè)向下游提供電子能力減弱，放氧復(fù)合體(OEC)受到傷害，ΔJ＞0，說(shuō)明(初級(jí)醌受體QA還原形式)大量積累，PSⅡ受體側(cè)QA至QB電子傳遞被抑制，綜上PSⅡ反應(yīng)中心供體側(cè)和受體側(cè)均遭到鹽脅迫傷害。當(dāng)CaCl2濃度≤15 mmol/L時(shí)，ΔK、ΔJ隨Ca2+濃度增加而減小，Ca15處理最小，當(dāng)Ca2+濃度＞15 mmol/L時(shí)，Ca20處理的ΔK、ΔJ甚至高于Ca0處理，說(shuō)明適宜濃度外源Ca2+能減輕鹽脅迫對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心供體側(cè)和受體側(cè)電子傳遞的抑制，提高植物耐鹽性，其中15 mmol/L Ca2+緩解效果最佳，而20 mmol/L Ca2+則表現(xiàn)出加重鹽脅迫傷害。

圖1 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)OJIP曲線(a、b、c)、相對(duì)可變熒光Vt曲線(d、e、f )及相對(duì)可變熒光的差異動(dòng)力學(xué)ΔVt曲線(g、h、i)的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on the fast chlorophyll a fluorescence induction curves OJIP (a, b, c), relative variable fluorescence curves Vt (d, e, f ) and differential kinetic curves ΔVt (g, h, i) in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.3 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄葉片F(xiàn)v/Fo、VJ的影響

Fv/Fo表示PSⅡ潛在活性，VJ反映2 ms時(shí)PSⅡRCs關(guān)閉程度[11]。圖2顯示，隨鹽脅迫天數(shù)增加，F(xiàn)v/Fo逐漸減小，VJ逐漸增大，即PSⅡ潛在活性與PSⅡ RCs關(guān)閉程度呈反比，F(xiàn)v/Fo隨CaCl2濃度增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。鹽脅迫3天，Ca0、Ca20處理顯著低于其他CaCl2處理；鹽脅迫6天，CK處理顯著高于Ca0～Ca20處理；鹽脅迫9天，F(xiàn)v/Fo大小表現(xiàn)為：CK＞Ca15＞Ca10＞Ca5＞Ca0＞Ca20，Ca0處理顯著低于CK，Ca15較Ca0處理Fv/Fo顯著升高39.67%且與CK無(wú)顯著差異，Ca20較Ca0處理Fv/Fo顯著降低23.92%且為最小值。鹽脅迫9天，VJ大小表現(xiàn)為：CK＜Ca15＜Ca10＜Ca0＜Ca5＜Ca20，Ca0～Ca20處理均顯著高于CK，與Ca0處理相比，Ca5、Ca10處理VJ無(wú)顯著差異，Ca20處理VJ顯著升高22.43%，Ca15處理VJ顯著降低18.35%。綜上，鹽脅迫降低PSⅡ活性，抑制QA被還原，Ca15處理能有效緩解上述傷害，但Ca2+濃度過(guò)高(如Ca20處理)則加重鹽脅迫傷害。

圖2 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗Fv/Fo和VJ的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on the Fv/Fo and VJ in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.4 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄葉片F(xiàn)v/Fm、PIabs的影響

Fv/Fm是反映PSⅡ活性中心光能轉(zhuǎn)換效率的重要參數(shù)，PIabs是指以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)。圖3顯示，F(xiàn)v/Fm與PIabs變化趨勢(shì)相同，隨鹽脅迫時(shí)間增加而逐漸減小，隨CaCl2濃度增大呈先升后降，Ca0處理在整個(gè)鹽脅迫過(guò)程中Fv/Fm與PIabs均顯著低于CK。鹽脅迫3天，Ca5、Ca10、Ca15處理下Fv/Fm以及Ca5處理下PIabs顯著高于Ca0處理；鹽脅迫6天，Ca5、Ca10、Ca15處理下Fv/Fm與PIabs均顯著高于Ca0處理，Ca20處理下Fv/Fm與PIabs與Ca0處理差異不顯著；鹽脅迫9天，F(xiàn)v/Fm與PIabs大小依次為：CK＞Ca15＞Ca10＞Ca5＞Ca0＞Ca20，與Fv/Fm相比鹽脅迫對(duì)PIabs的影響更明顯，反映加工番茄葉片PIabs對(duì)鹽脅迫的敏感性強(qiáng)于Fv/Fm，Ca0～Ca20處理依次與CK相比PIabs分別降低了77.42%、76.34%、51.04%、29.31%、90.68%，與Ca0處理相比，Ca5、Ca10處理Fv/Fm差異不顯著，Ca20處理 Fv/Fm顯著降低、PIabs沒(méi)有顯著差異，Ca15與Ca0處理相比Fv/Fm與PIabs均顯著升高，說(shuō)明15 mmol/L CaCl2更好地緩解了鹽脅迫誘導(dǎo)的光合性能降低，Ca20處理則未表現(xiàn)出緩解鹽脅迫損傷的作用。

圖3 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗Fv/Fm和PIabs的影響Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on the Fv/Fm and PIabs in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.5 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄葉片量子產(chǎn)額的影響

Ψo、φEo、φDo用來(lái)反映 PSⅡ受體側(cè)變化，φRo是用于還原PSI受體側(cè)末端電子受體的量子產(chǎn)額。圖4顯示，隨鹽脅迫天數(shù)增加，Ψo、φEo遞減，φDo遞增。與CK相比，鹽脅迫3天Ca0處理Ψo、φEo未觀察到明顯差異；鹽脅迫6天，Ca0處理下Ψo、φEo顯著低于CK，與Ca0處理相比，Ca10處理Ψo、φEo無(wú)顯著差異，Ca5、Ca15處理Ψo、φEo顯著增加，Ca20處理Ψo、φEo顯著減??；鹽脅迫9天，CK處理Ψo、φEo顯著高于Ca0～Ca20處理，與Ca0處理相比，Ca5、Ca10處理無(wú)顯著差異，Ca20處理顯著降低，而Ca15處理顯著升高。φDo隨CaCl2濃度升高呈先降后升的趨勢(shì)，整個(gè)鹽脅迫過(guò)程Ca0處理下φDo顯著高于CK，鹽脅迫9天，Ca0～Ca20處理依次較CK上升36.09%、25.48%、13.34%、4.79%、67.92%，與Ca0處理相比，Ca5、Ca10處理φDo無(wú)顯著差異，Ca20處理φDo顯著增大，而Ca15處理φDo顯著降低且與CK無(wú)顯著差異。φRo隨處理時(shí)間延長(zhǎng)變化不大，鹽脅迫9天Ca0處理顯著低于CK，Ca20與Ca0處理無(wú)顯著差異，Ca15處理顯著高于Ca0處理并與CK差異不顯著。綜上，說(shuō)明鹽脅迫下施加15 mmol/L CaCl2能夠降低熱耗散的量子比率，從而提高電子傳遞的量子產(chǎn)額。

圖4 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗量子產(chǎn)額的影響Fig.4 Effects of exogenous CaCl2 on the yield flux ratios in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.6 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄葉片能量分配參數(shù)的影響

能量分配參數(shù)以“雷達(dá)圖”形式表示(圖5)，隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，處理間能量分配參數(shù)差異逐漸明顯。對(duì)葉截面積而言，鹽脅迫6、9天，與CK相比，Ca0處理下單位葉截面積中活性反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CSm)及吸收、捕獲和傳遞的能量(ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm)明顯降低，而單位葉截面積熱耗散(DIo/CSm)大于CK，與Ca0處理相比，Ca15處理下RC/CSm、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm明顯增大，DIo/CSm則減小，鹽處理下RC/CSm大小依次為：Ca15＞Ca10＞Ca5＞Ca0＞Ca20；對(duì)反應(yīng)中心而言，鹽脅迫 6、9天，與CK相比，Ca0處理下單位活性反應(yīng)中心吸收、捕獲和熱耗散的能量(ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC)均高于CK，用于電子傳遞的能量(ETo/RC)低于CK，與Ca0處理相比，Ca15處理下ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC明顯降低，而ETo/RC升高，鹽處理下 DIo/CSm、DIo/RC 大小均為：Ca20＞Ca0＞Ca5＞Ca10＞Ca15，綜上Ca15處理逆轉(zhuǎn)了鹽脅迫誘導(dǎo)活性反應(yīng)中心數(shù)量減少、熱耗能升高，提高了用于電子傳遞的能量，降低能量的熱耗散，優(yōu)化了反應(yīng)中心能量分配。

圖5 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗能量分配參數(shù)的影響Fig.5 Effects of exogenous CaCl2 on the energy distribution parameters in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.7 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄葉片調(diào)制820 nm反射信號(hào)的影響

葉片暗適應(yīng)后PSⅠ反應(yīng)中心處于完全還原狀態(tài)，照光后PSⅠ逐漸氧化，820 nm光反射強(qiáng)度逐漸下降，圖6顯示，與CK相比，820 nm光反射曲線在鹽脅迫下發(fā)生變形，表現(xiàn)為下降階段最低點(diǎn)升高和上升階段最高點(diǎn)降低，說(shuō)明PSⅠ氧化還原能力被鹽脅迫抑制，鹽脅迫3、6天Ca0處理變形幅度最大，鹽脅迫9天Ca20處理變形幅度超過(guò)Ca0處理，Ca10、Ca15處理變形幅度較小。

圖6 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗調(diào)制820 nm反射動(dòng)力學(xué)曲線的影響Fig.6 Effects of exogenous CaCl2 on the modulated 820 nm reflection kinetics curves in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

如圖7所示，ΔMRfast/MRo、ΔMRslow/MRo、Vox、Vred隨時(shí)間持續(xù)變化不明顯，鹽脅迫9天，隨Ca2+濃度增加，ΔMRfast/MRo、ΔMRslow/MRo、Vox、Vred呈先增大后減小，在Ca0處理下均顯著低于CK，與Ca0處理相比，當(dāng)Ca2+濃度≤15 mmol/L時(shí)顯著升高，在Ca20處理顯著降低，說(shuō)明適宜濃度外源Ca2+能有效促進(jìn)鹽脅迫下植物體PSⅠ氧化還原性能，Ca2+濃度過(guò)高(Ca20處理)則加重鹽脅迫對(duì)PSⅠ氧化還原性能的抑制，其中Ca15處理對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)降低PSⅠ氧化還原性能的緩解作用最佳。

圖7 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片調(diào)制 820 nm 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Fig.7 Effects of exogenous CaCl2 on the parameters of the modulated 820 nm reflection kinetics in leaves of processing tomato seedlings under salt stress

2.8 外源CaCl2對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗快速葉綠素?zé)晒夂?20 nm光反射動(dòng)力學(xué)影響的綜合評(píng)價(jià)

主成分分析(principal components analysis, PCA)也稱(chēng)主分量分析，旨在利用“降維”的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)?？焖偃~綠素?zé)晒夂?20 nm光反射動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有不同的量綱與數(shù)量級(jí)，為了避免其對(duì)結(jié)果的影響，主成分分析前對(duì)處理9天后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)通過(guò)PCA，根據(jù)特征值大于1的標(biāo)準(zhǔn)提取到兩個(gè)主成分，其特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率等如表3所示，特征值分別為15.769、1.632，貢獻(xiàn)率分別為82.996%、8.591%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)91.587%，表明這兩個(gè)相互獨(dú)立的主成分能夠反映19個(gè)指標(biāo)91.587%的信息，符合分析要求。

表3 兩個(gè)主成分的載荷矩陣、特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Component matrix, Eigen values, and contributing rate of two principal components

主成分載荷矩陣反映各指標(biāo)對(duì)此主成分負(fù)荷相對(duì)大小與作用的方向，即該指標(biāo)對(duì)主成分的影響程度。表3中，第一主成分(principal component 1,PC1)絕對(duì)值較高的正向特征向量指標(biāo)有Fv/Fo、Fv/Fm、ETo/CSm、TRo/CSm、ΔMRfast/MRo，PC1 可稱(chēng)為光合反應(yīng)中心工作效率的量度。第二主成分(principal component 2, PC2)絕對(duì)值較高的正向特征向量指標(biāo)有ETo/RC、TRo/RC，PC2可稱(chēng)為PSⅡ RCs支配光能的量度，由表4可知，不同處理綜合排名依次為CK＞Ca15＞Ca10＞Ca5＞Ca0＞Ca20。

表4 鹽脅迫下加工番茄幼苗在不同濃度外源CaCl2處理的綜合得分及排名Table 4 The comprehensive score and ranking of processing tomato seedlings treated with different concentrations of exogenous CaCl2 under salt stress

3 討論

植物響應(yīng)鹽脅迫最直觀變化就是植株生長(zhǎng)受到明顯抑制，土壤鹽漬化已成為番茄設(shè)施栽培及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的限制因素之一，鹽分導(dǎo)致番茄幼苗體內(nèi)發(fā)生離子失衡和質(zhì)膜過(guò)氧化，通過(guò)破壞光合作用等一系列生理過(guò)程來(lái)抑制番茄生長(zhǎng)[4,29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明葉面噴施外源15 mmol/L CaCl2有效緩解鹽脅迫對(duì)加工番茄幼苗的生長(zhǎng)抑制(表2)。

葉綠素?zé)晒庠谝欢ǔ潭壬戏从抄h(huán)境因子對(duì)植物的影響，OJIP曲線包含PSⅡ原初光化學(xué)反應(yīng)及光合機(jī)構(gòu)電子傳遞狀態(tài)等過(guò)程[30]，與植物異質(zhì)性、非生物脅迫程度有關(guān)[11,31]，光合電子傳遞鏈的組成部分位于植物細(xì)胞類(lèi)囊體膜上，鹽脅迫損傷植物葉片葉綠體中類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)，降低光合色素含量和光合效率[7,31-33]。OJIP曲線J點(diǎn)、I點(diǎn)、IP相分別與PSⅡ受體側(cè)QA、質(zhì)體醌(PQ)、PSI受體側(cè)狀態(tài)有關(guān)[9,11,34]，如果在極短時(shí)間內(nèi)(即J點(diǎn)之前，0.3 ms處)葉綠素?zé)晒馍仙霈F(xiàn)K點(diǎn)，是因?yàn)殡娮觽鬟f中水裂解過(guò)程和Pheo (去鎂葉綠素)到QA部分被抑制，標(biāo)志PSⅡ供體側(cè)OEC活性被抑制[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，加工番茄幼苗葉片OJIP曲線出現(xiàn)K點(diǎn)、J點(diǎn)上升，I點(diǎn)、P點(diǎn)降低、I-P相振幅減小(圖1-a、b、c)，在Ca0與Ca20處理中更為明顯，這與鹽脅迫在玉米[31]、葡萄[35]、綠豆[36]中的試驗(yàn)結(jié)果相似，I-P階段降低表明鹽脅迫降低PSI氧化還原能力[14]，P點(diǎn)下降是由PSI受體側(cè)葉綠素蛋白降解或變性以及閉合PSⅡRCs數(shù)量的減少引起[9,34]，而15 mmol/L CaCl2處理減輕上述鹽脅迫傷害。

Vt曲線 (圖1-d、e、f)及 ΔVt曲線 (圖1-g、h、i)更直觀表現(xiàn)OJIP曲線的不可見(jiàn)特征，明顯可見(jiàn)鹽脅迫誘導(dǎo)VK增加且ΔK＞0反映PSⅡ供體側(cè)OEC受損，而OEC參與光合作用光反應(yīng)過(guò)程中水的光氧化，鹽脅迫削弱OEC電子轉(zhuǎn)移能力，因此推測(cè)鹽脅迫抑制加工番茄葉片中光能氧化水釋放電子的過(guò)程。同時(shí)，VJ增加(圖2)是PSⅡ受體側(cè)QA向次級(jí)醌受體(QB)電子傳遞受阻的特異性標(biāo)志[22]，表明鹽脅迫限制超出QA的電子運(yùn)輸，即(QA的還原形式)大量積累，濃度增加引發(fā)PSⅡ RCs閉合，結(jié)合鹽脅迫下捕獲激子將電子傳遞到超過(guò)QA其它電子受體的概率Ψo和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額φEo顯著降低，能量耗散的量子效率φDo升高(圖4)，表明鹽脅迫抑制PSⅡ受體側(cè)QA下游的電子傳遞，在其他植物研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果[19,31,36]，這些結(jié)果說(shuō)明PSⅡ受體側(cè)是鹽脅迫的靶點(diǎn)，可能由于鹽脅迫導(dǎo)致QB從蛋白復(fù)合體脫落，使PSⅡ受體側(cè)PQ結(jié)合親和力降低[11]。據(jù)報(bào)道鹽脅迫對(duì)小麥的傷害位點(diǎn)為供體側(cè)[33]，而在油菜葉中為受體側(cè)[37]，表明鹽脅迫對(duì)不同物種光合電子傳遞鏈的傷害位點(diǎn)不同，本試驗(yàn)則表明加工番茄幼苗葉片PSⅡ供體側(cè)和受體側(cè)均受到鹽脅迫傷害，而鹽脅迫下施加外源15 mmol/L CaCl2可通過(guò)保護(hù)OEC結(jié)構(gòu)，使光解水向PSⅡ提供電子，降低能量耗散，維持電子傳遞鏈正常運(yùn)行。

鹽脅迫下Fv/Fo、Fv/Fm降低是Fm減小和Fo增大共同作用的結(jié)果，說(shuō)明從PSⅡ反應(yīng)中心色素分子(P680)向QA電子傳遞受阻，且PSⅡ天線色素激發(fā)態(tài)非輻射耗散發(fā)生[32]，F(xiàn)v/Fo降低表明鹽脅迫損傷類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)、有活性的反應(yīng)中心數(shù)量降低[38]，F(xiàn)v/Fm降低表明鹽脅迫削弱PSⅡ光化學(xué)效率[30]，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Ca0處理單位葉截面積中RCs密度(RC/CSm)、吸收的光能(ABS/CSm)減少，表明鹽脅迫造成PSⅡRCs失活或天線色素結(jié)構(gòu)改變、降解，使捕獲、傳遞電子的光能(TRo/CSm、ETo/CSm)減少，但熱耗散(DIo/CSm)升高，表明加工番茄幼苗葉片受到鹽脅迫啟動(dòng)光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)機(jī)制[11]，進(jìn)一步表現(xiàn)為單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)明顯降低，而吸收、捕獲用于還原QA、熱耗散的能量(ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC)增加，表明部分PSⅡRCs失活后，單位葉截面積吸收、捕獲、傳遞的光能降低，致使剩余有活性的RCs吸收、轉(zhuǎn)換光能及熱耗散的工作效率提高、用于傳遞電子的能量減少，從而保證在鹽脅迫下能量供應(yīng)。這是在PSⅡ中安全耗散過(guò)剩激發(fā)能量的機(jī)制之一—葉黃素循環(huán)，其功能是通過(guò)非光化學(xué)猝滅的過(guò)程，將PSⅡ天線中過(guò)剩激發(fā)能作為熱量耗散，對(duì)保護(hù)光合電子傳遞鏈有積極作用，這個(gè)結(jié)果與前人[8,31,36,39]得出PSⅡ RCs對(duì)逆境響應(yīng)的結(jié)論一致。然而，鹽脅迫對(duì)加工番茄葉片PSⅡRCs數(shù)量與能量支配的負(fù)面影響被外源15 mmol/L CaCl2所抵消。

PIabs是以吸收光能為基礎(chǔ)、包含多個(gè)獨(dú)立參數(shù)(RC/ABS、φPo、Ψo等)的性能指數(shù)，許多研究采用最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)評(píng)估植物受脅迫程度，但一些研究認(rèn)為PIabs比Fv/Fm更敏感，可以準(zhǔn)確地反映脅迫對(duì)植物光合機(jī)構(gòu)的影響[11-12]，在本研究中加工番茄幼苗葉片PIabs對(duì)鹽脅迫更為敏感(圖3)，在Fv/Fm尚未發(fā)生變化時(shí)，PIabs已出現(xiàn)明顯變化，Ψo是對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心電子傳遞鏈性能的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)之一(圖4)，PIabs主要反映PSⅡ反應(yīng)中心效率，試驗(yàn)表明，與Ca0處理相比，Ca15處理使鹽脅迫下加工番茄葉片的Ψo和PIabs均顯著升高，但PIabs升高程度大于Ψo，由此可見(jiàn)，外源鈣對(duì)改善PSⅡ反應(yīng)中心之后的電子傳遞鏈性能更為顯著，從而提升整體光合性能，這與趙娜等[40]關(guān)于鉀肥提高抗蟲(chóng)棉葉片PSⅡ性能的研究結(jié)果一致。

除植物葉片PSⅡ反應(yīng)中心容易受到逆境傷害外，PSⅠ反應(yīng)中心也是逆境脅迫作用位點(diǎn)之一，通常使用820 nm光反射來(lái)研究PSⅠ原初光化學(xué)反應(yīng)[10]，葉片暗適應(yīng)后PSⅠ反應(yīng)中心處于完全還原狀態(tài)，照光后PSⅠ逐漸氧化，820 nm光反射曲線處于快速下降階段代表P700和PC的氧化，最低點(diǎn)(MRmin)是PSⅠ氧化還原的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，當(dāng)來(lái)自PSⅡ的電子促進(jìn)PSⅠ還原，820 nm光反射曲線轉(zhuǎn)為慢速上升階段代表P700和PC再還原，對(duì)應(yīng)OJIP曲線I-P階段[15,22,30]，因此，820 nm光反射曲線同時(shí)受PSⅠ和PSⅡ活性的影響，能夠反映PSⅠ和PSⅡ協(xié)調(diào)性，當(dāng)PSⅠ活性降低會(huì)反饋抑制PSⅡ向PSⅠ傳遞電子，加劇PSⅡ傷害程度[41]，PSⅠ穩(wěn)定性可保證受損PSⅡ快速修復(fù)[42]。本試驗(yàn)中隨鹽脅迫天數(shù)增加，MR/MRo曲線(圖6)、PSⅠ性能參數(shù)(圖7)較PSⅡ性能指數(shù)PIabs(圖3)變化幅度明顯減小，這與前人[31,43]研究表明鹽脅迫對(duì)PSⅡ影響大于PSI的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，與CK相比，Ca0處理下MR/MRo曲線MRmin增大，ΔMRfast/MRo、ΔMRslow/MRo以及 Vox、Vred顯著降低，表明鹽脅迫抑制P700和PC氧化以及再還原過(guò)程，與Kan等[31]研究結(jié)果不同的是，在玉米對(duì)鹽脅迫響應(yīng)中820 nm光反射曲線下降階段未發(fā)現(xiàn)顯著變化，但其上升階段變化與本試驗(yàn)結(jié)果一致，此外，結(jié)合還原PSⅠ受體側(cè)末端電子受體的量子產(chǎn)額(φRo)減少(圖4)，可推測(cè)PSI活性降低可能是PQ向傳遞電子的能力或數(shù)量下降，PSⅡ與PSI之間連通性變差，PSI受體側(cè)電子傳遞受阻，這種效應(yīng)與上文JIP-test分析得出鹽脅迫引起PSⅡ反應(yīng)中心活性降低一致，而15 mmol/L CaCl2處理能夠提高鹽脅迫下PSⅠ氧化還原能力。

4 結(jié)論

施加外源15 mmol/L CaCl2通過(guò)耗散PSⅡ天線色素過(guò)剩激發(fā)能，減輕鹽脅迫氧化應(yīng)激對(duì)葉綠體的損傷，穩(wěn)定光合反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)與功能，提高光化學(xué)效率和能量利用率，減輕鹽脅迫的光抑制，從而促進(jìn)加工番茄幼苗生長(zhǎng)。