HBeAg和HBeAb共同陽性CHB患者血清HBV RNA表達水平及檢測意義

劉潘婷，向 瑜，周紅菊，陳 瀑

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016

乙型肝炎病毒(HBV)血清學標志物的檢測是乙型肝炎臨床診斷和治療的重要依據(jù)，其血清學模式仍是評價疾病狀態(tài)的重要指標。隨著實驗室檢測方法靈敏度的提高及抗病毒藥物的廣泛使用，HBV e抗原(HBeAg)和HBV e抗體(HBeAb)共存的特殊模式不斷被檢測出來[1-2]，這種HBV特殊血清學模式給臨床診療帶來一定的困惑，對其研究有助于了解HBV感染狀態(tài)，提高對慢性乙型肝炎(CHB)的診療水平。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者血清或血漿中存在HBV前基因組RNA(HBV RNA)，HBV RNA是由感染肝細胞核內的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)轉錄形成的部分前基因組RNA(pgRNA)不經(jīng)過逆轉錄而直接獲取病毒包膜蛋白分泌出肝細胞外產生，因此，血清HBV RNA水平能夠反映cccDNA表達水平及其轉錄活性狀態(tài)，HBV RNA作為一種具有潛在臨床檢測價值的新指標成為研究熱點。有研究顯示血清HBV RNA與HBV感染狀態(tài)、HBeAg血清學轉換、治療和預后等方面關系密切[3]。HBV RNA作為一種新的病毒學指標，目前少見其在HBV感染血清學特殊模式中的水平及其與傳統(tǒng)血清學標志物相關性的研究。本文通過研究HBeAg和HBeAb共同陽性模式中血清HBV RNA表達水平及其在不同基因型中表達情況，同時分析HBV RNA與HBV DNA、HBV表面抗原(HBsAg)、HBeAg、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的相關性，探討其檢測意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2020年12月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及住院進行治療的且HBV血清學標志物檢測中HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBV核心抗體(HBcAb)均為陽性的CHB患者108例(A組)作為研究對象，其中男74例、女34例，年齡17～75歲、平均(40.90±13.69)歲。另選取同期在在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及住院進行治療的HBV血清學標志物檢測中HBeAg陽性、HBeAb陰性的CHB患者45例(B組)和HBeAg陰性、HBeAb陽性的CHB患者33例(C組)作為對照。A組和B、C組患者均符合文獻[4]的CHB診斷標準。排除標準：(1)合并其他肝炎病毒及艾滋病毒感染；(2)其他肝臟疾病(如自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等)；(3)近期使用免疫抑制劑治療。研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 ARCHITECT系統(tǒng)i4000全自動化學發(fā)光免疫分析儀及血清HBsAg、HBV表面抗體(HBsAb)、HBeAg、HBeAb和HBcAb配套檢測試劑購自美國雅培公司；Cobas c701全自動生化分析儀及血清ALT、AST配套檢測試劑購自Roche公司；Cobas Z480熒光定量PCR儀購自Roche公司，HBV基因分型檢測試劑盒購自寶瑞源生物技術有限公司；HBV核酸定量測定試劑盒(PCR-熒光探針法)購自湖南圣湘生物科技有限公司；HBV pgRNA(HBV RNA)測定試劑盒(PCR-熒光探針法)購自北京熱景生物技術股份有限公司。

1.3方法

1.3.1HBV血清學標志物和肝功能相關指標檢測 采集A組及B、C組患者外周血4 mL于促凝管，4 000 r/min離心6 min，收集血清，儲存于-80 ℃冰箱，避免反復凍融。然后按試劑盒說明書，采用ARCHITECT系統(tǒng)i4000全自動化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測A組及B、C組患者血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb；采用Cobas c701全自動生化分析儀及配套試劑檢測A組及B、C組患者血清ALT、AST水平。HBsAg的值為相應檢測值以10為底所取對數(shù)。

1.3.2HBV基因分型檢測 采用實時熒光PCR方法，在Cobas Z480熒光定量PCR儀檢測A組及B、C組患者血清中感染HBV B、C、D 3種基因型。

1.3.3HBV DNA、HBV RNA載量檢測 使用分離膠管上層血清，采用實時熒光定量PCR方法，按照HBV核酸定量測定試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書在Cobas Z480熒光定量PCR儀上檢測HBV DNA載量，單位為IU/mL；運用HBV pgRNA(HBV RNA)測定試劑盒(PCR-熒光探針法)在cobas Z480熒光定量PCR儀上檢測HBV RNA載量，單位為copy/mL。HBV DNA、HBV RNA的值均為相應檢測值以10為底所取對數(shù)。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。Shapiro-wilk檢驗及正態(tài)分布圖判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布，非正態(tài)分布的連續(xù)變量以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析。多組間樣本比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗，檢驗水準α=0.05，組間兩兩比較檢驗水準經(jīng)Bonferroni校正法調整為α=0.017。

2 結 果

2.1A組血清學指標和HBV基因分型比較 A組中血清HBV RNA為2.98(1.78，4.20)copy/mL，HBV DNA為5.38(4.20，6.46)IU/mL，HBsAg為3.42(3.04，3.79)IU/mL，HBeAg為3.46(1.69，8.36)S/CO，ALT為53.50(31.25，233.00)U/L，AST為55.00(29.00，201.25)U/L；HBV基因分型中，B基因型占69.44%(75/108)，C基因型占18.52%(20/108)，D基因型占3.70%(4/108)，未分型占8.33%(9/108)。

2.2A組B、C基因型血清HBV RNA及HBV DNA水平比較 A組B基因型75例、C基因型20例、D基因型4例，B、C基因型血清HBV RNA及HBV DNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3A組血清HBV RNA與其他血清學指標相關性分析 A組血清HBV RNA與HBV DNA、HBsAg、ALT、AST呈正相關(r=0.723，P<0.001；r=0.270，P=0.005；r=0.479，P<0.001；r=0.395，P<0.001)，與HBeAg無相關(r=0.111，P=0.253)。

表1 A組B、C基因型血清HBV RNA與HBV DNA水平比較[M(P25,P75)]

2.43組患者血清HBV RNA與其他指標的相關性分析 3組中HBV RNA與HBV DNA呈正相關(P<0.05)，在A、B組中HBV RNA與HBsAg呈正相關(P<0.05)，在B組中HBV RNA與HBeAg呈正相關(P<0.05)，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST 呈正相關(P<0.05)，見表2。

2.53組間血清學指標比較及組間兩兩比較 3組血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)；A組血清HBsAg、AST水平均高于B組，A組血清HBeAg水平低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)；B組HBV RNA、HBV DNA、HBeAg水平均高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)。見表3。

表2 3組患者血清HBV RNA與其他指標的相關性分析

表3 3組間血清學指標比較[M(P25,P75)]

3 討 論

HBV血清學標志物的檢測仍是乙型肝炎臨床診斷和治療的重要依據(jù)，HBV抗原和抗體同時陽性的血清學特殊模式在臨床及流行病學研究中不斷被發(fā)現(xiàn)，HBeAg和HBeAb同時陽性是常見的特殊血清學模式之一，目前有研究報道HBeAg和HBeAb共存現(xiàn)象可能與血清學轉換期、前核心區(qū)(PC)和(或)雙基底核心啟動子(BCP)突變導致HBeAg在轉錄或翻譯階段表達減少、病毒再活動期等因素有關[1-2]，針對特殊血清學模式的研究有助于提高臨床相應診療水平。

cccDNA是HBV復制的初始模板，HBV的持續(xù)復制依賴于可轉錄生成RNA的cccDNA，cccDNA是反映HBV感染和復制的直接證據(jù)，其在肝細胞核中長期存在是導致乙型肝炎慢性化和停藥后復發(fā)的重要原因[5]，清除cccDNA才表明乙型肝炎達到治愈，但cccDNA的檢測由于需要肝組織穿刺活檢，臨床難以普遍開展。既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg與肝組織內cccDNA的活性呈正相關，因此被常規(guī)用于劃分HBV感染的進程、確定治療時間、觀察藥物療效和停藥時機等臨床診療中，但隨著對HBV的深入研究，特別是核苷及核苷酸類似物(NAs)等抗病毒藥物廣泛運用于臨床以來，這些傳統(tǒng)血清學指標已被證實有其局限性：血清HBV DNA的消失僅能代表病毒的逆轉錄過程被有效抑制，并不能真實反映肝細胞內cccDNA的轉錄活性狀態(tài)[6]；HBsAg由于來源的多樣性，既可來源于cccDNA，也可來源于整合的HBV DNA片段[7-8]，在反映肝細胞內cccDNA水平上也存在局限性。有研究證實HBV RNA是由感染肝細胞核內cccDNA轉錄形成的部分pgRNA不經(jīng)過逆轉錄而直接獲取病毒包膜蛋白分泌出肝細胞外產生，能夠反映cccDNA轉錄活性狀態(tài)，被認為是一種新型的潛在血清學標志物，可作為cccDNA的替代標志物來評估HBV復制及感染狀態(tài)[9-10]。

有研究表明，HBV感染的不同時期血清HBV RNA水平和HBV DNA、HBsAg水平相關性不同，在HBeAg陽性的CHB患者中表現(xiàn)出相關性，而在HBeAg陰性患者中相關性弱或不相關[11-12]。本研究結果顯示，A組血清HBV RNA與HBV DNA、HBsAg、ALT、AST呈正相關(r=0.723，P<0.001；r=0.270，P=0.005；r=0.479，P<0.001；r=0.395，P<0.001)；在A、B組中HBV RNA與HBsAg呈正相關，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST呈正相關，由此可見A組血清HBV RNA與其他病毒血清標志物和肝功能指標的相關性總體上要優(yōu)于B、C組，且與HUANG等[11]研究結果一致。在B組中HBV RNA與HBeAg呈正相關(P<0.05)，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST 呈正相關(P<0.05)，這種相關性的差異可能與病毒感染狀態(tài)、病毒變異、疾病進展和治療等因素有關，需進一步分析研究。

本研究結果顯示，A組血清HBV RNA水平均高于C組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)；A組血清HBsAg、AST水平均高于B、C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)，提示A組患者病毒復制活躍，肝功能損傷程度較為嚴重。本研究還發(fā)現(xiàn)，A組血清HBeAg水平低于B組，且HBeAg大多處于低水平。HBeAg低水平通常被認為可能是患者正處于免疫清除期，HBeAb中和部分HBeAg，HBeAg正趨于陰轉的血清學轉換期。理論上，這個時期RNA和DNA水平也應隨之下降，多項研究也表明HBV RNA水平下降能較強地預測HBeAg血清學轉換[13]。由本研究結果推斷出，A組患者可能與PC和(或)BCP突變或者HBV處于再活動期等因素關系更大，VAN CAMPENHOUT 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HBV RNA水平與PC和(或)BCP突變有關，這之間的關系還需要更多的研究來證實。本研究結果也顯示，A組血清HBV RNA水平與HBV DNA有良好的相關性，HBV RNA可協(xié)同HBV DNA檢測，幫助臨床醫(yī)生及時了解此類特殊血清學模式CHB患者病情變化，調整診療策略，提升治療效果。

本研究結果顯示，A組檢測到了B、C、D基因型，其中以B基因型多見(75/69.44%)，其次為C基因型(20/18.52%)，D基因型占比最少(4/3.70%)，這與文獻[4]的報道結果一致，表明A組HBV感染者基因型無特殊表現(xiàn)，進一步比較A組B、C基因型間血清HBV RNA和HBV DNA水平，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有研究顯示，D基因型HBV RNA水平要高于B、C基因型[12]，本研究因D基因型例數(shù)太少(4例)未做統(tǒng)計學分析。一般而言，CHB患者血清HBV RNA水平均低于HBV DNA水平[14-15]。本研究結果也顯示，A組血清HBV RNA水平總體隨著HBV DNA水平降低而降低。

綜上所述，HBeAg和HBeAb共同陽性CHB患者血清HBV RNA與HBV DNA具有良好的相關性，血清HBV RNA檢測具有潛在的臨床意義，但其檢測優(yōu)勢需進一步研究分析。本研究的不足之處在于沒有針對A組及B、C組行HBV RNA動態(tài)觀察。血清HBV RNA是一項新的檢測項目，隨著檢測技術的進步，靈敏度更高、特異度更好的HBV RNA檢測方法開始運用于臨床，后期將對其進一步深入研究。