基于核酸適配體信號(hào)置換結(jié)合循環(huán)擴(kuò)增的液相色譜法檢測(cè)4種生物胺

宋 暢, 劉 暢, 馬紫玉, 潘瑞蓉, 施海蔚,孔德昭, 張景慧, 沈 薇, 唐 盛*

(1. 江蘇科技大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212003; 2. 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212003;3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212001; 4. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 江蘇 南京 210019)

生物胺是一類有生物活性的、含氮的、相對(duì)分子質(zhì)量較低的有機(jī)物質(zhì)的統(tǒng)稱[1]。按照生物胺的化學(xué)構(gòu)成可以將將其分為腐胺、尸胺、精胺(spermine)、亞精胺等脂肪族胺,酪胺(tyramine)、苯乙胺等芳香族胺以及組胺(histamine)、色胺(tryptamine)等雜環(huán)胺[2,3]。低水平的生物胺是生物蛋白質(zhì)中至關(guān)重要的部分,在調(diào)控核酸與蛋白質(zhì)的化學(xué)組成及生物膜穩(wěn)定性等方面起著重要作用[4]。然而一些高水平的生物胺則被歸類為有害化合物,可能會(huì)在敏感的人體中引起疾病或不良癥狀[5]。生物胺的高攝取量(食物中超過(guò)100 mg/kg)可能對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[6]。組胺是所有生物胺中毒性最強(qiáng)的,過(guò)量的組胺會(huì)導(dǎo)致頭痛、消化功能障礙及血壓失常,甚至還可能產(chǎn)生神經(jīng)性中毒[7]。酪胺的毒性次之,過(guò)量可能會(huì)導(dǎo)致惡心和高血壓等不良反應(yīng)[8]。尸胺和腐胺本身危害性相對(duì)較小，但卻能抑制體內(nèi)組胺和酪胺相關(guān)代謝酶的活性，促使組胺和酪胺的過(guò)量積累，加劇身體的不適癥狀[9]。除此之外,腐胺、尸胺、精胺和亞精胺能夠與亞硝酸鹽反應(yīng),生成致癌產(chǎn)物亞硝基胺。生物胺主要的外部攝入來(lái)源是部分常見(jiàn)的食品或藥品,如抗生素和肉制品等,近年來(lái)開始受到各國(guó)食藥監(jiān)管部門的重視。大部分抗生素由微生物發(fā)酵制得,然而此方法具有產(chǎn)物純度較低、工藝可控性較低、生產(chǎn)穩(wěn)定性差、活性組分易變異等問(wèn)題。發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中所產(chǎn)生的生物胺雜質(zhì)可能引起中毒等一系列不良反應(yīng)[10],如研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵生成的慶大霉素中的組胺濃度與不良反應(yīng)事件之間存在明顯的相關(guān)性。魚肉和豬肉中含有豐富且極易被降解的蛋白質(zhì),再加上肉類制品有利于細(xì)菌生長(zhǎng)繁衍,各種微生物的大量繁殖很容易導(dǎo)致魚肉和豬肉中生物胺濃度超標(biāo)并且種類繁雜。如在魚肉中可以檢測(cè)到組胺、酪胺,在豬肉中?？梢詸z測(cè)到組胺、精胺和色胺。因此,精確檢測(cè)食品藥品中生物胺(尤其是組胺、酪胺、精胺和色胺)含量是否超標(biāo)具有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測(cè)生物胺的策略主要包括色譜法、光譜法、電泳法、比色法、化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)方法等[11]。其中常用的色譜方法有薄層色譜法、離子交換色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法(HPLC)等,并結(jié)合不同的檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[12,13]。然而,傳統(tǒng)的色譜法檢測(cè)多種生物胺不僅需要復(fù)雜的衍生化步驟以及繁瑣的樣品前處理程序,而且有時(shí)無(wú)法在一次運(yùn)行中檢測(cè)多種不同種類的生物胺,需要選擇不同的色譜方法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行多次檢測(cè)。同時(shí),常規(guī)的色譜檢測(cè)方法無(wú)法有效解決抗生素中混合物基質(zhì)干擾的難題,在目標(biāo)生物胺含量低的時(shí)候,目標(biāo)峰常常淹沒(méi)于雜質(zhì)譜中,無(wú)法有效識(shí)別。此外,較窄的線性范圍和較高的檢出限(LOD)也是限制傳統(tǒng)色譜法準(zhǔn)確識(shí)別多種生物胺的主要因素。

核酸適配體(aptamer)作為一種新型的檢測(cè)探針,被廣泛應(yīng)用于各種檢測(cè)分析技術(shù)之中[14,15]。核酸適配體是一段寡核苷酸序列,能與特定的目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性結(jié)合。目前,針對(duì)生物胺的適配體也已被廣泛篩選并應(yīng)用于檢測(cè)方法之中,如Duan等[16]、Tian等[17]、John Ho等[18]通過(guò)指數(shù)富集法分別篩選出了酪胺、精胺和組胺的適配體。核酸適配體對(duì)生物胺的選擇性結(jié)合和分離能夠有效排除基質(zhì)效應(yīng)的影響,從而提高檢測(cè)的選擇性和靈敏度。

信號(hào)擴(kuò)增方法能進(jìn)一步增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度,已成為檢測(cè)痕量目標(biāo)物的一種有效手段。在之前的工作中,Qi等[19]開發(fā)了一種基于雙鏈特異性核酸酶(DSN)輔助增敏策略用于多種微RNA(microRNA)檢測(cè)的HPLC方法。該方案通過(guò)DSN剪切過(guò)程,循環(huán)放大來(lái)自microRNA的信號(hào),并結(jié)合剪切的長(zhǎng)短核酸探針實(shí)現(xiàn)了多種microRNA在HPLC上的信號(hào)分離,有效進(jìn)行了目標(biāo)信號(hào)源的置換工作;同時(shí)結(jié)合色譜法實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同長(zhǎng)度核酸探針的同時(shí)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的多重檢測(cè)。因此,若能將適配體檢測(cè)策略與信號(hào)擴(kuò)增方法相結(jié)合,再借助高靈敏的HPLC平臺(tái),則有望實(shí)現(xiàn)在一次運(yùn)行中對(duì)多種生物胺進(jìn)行快速識(shí)別和檢測(cè)。

基于此,本文提出了一種基于適配體置換生物胺信號(hào)源并結(jié)合熒光信號(hào)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的HPLC方法,并將其應(yīng)用于抗生素和肉類中多種生物胺的識(shí)別和檢測(cè)。該方法的優(yōu)勢(shì)在于:(1)通過(guò)啟動(dòng)子(trigger)置換出生物胺信號(hào),再由核酸探針置換出啟動(dòng)子信號(hào)。兩步信號(hào)置換可將分析物從無(wú)熒光信號(hào)的生物胺轉(zhuǎn)換為有熒光信號(hào)的核酸探針,從而精準(zhǔn)識(shí)別、捕獲和分離硫酸慶大霉素、魚肉、豬肉復(fù)雜基質(zhì)中的生物胺成分,提高對(duì)分析物的選擇性,降低樣品的基質(zhì)干擾;(2)RNA啟動(dòng)子(RNA不會(huì)被DSN剪切)與DNA探針雜交后,DSN對(duì)DNA探針進(jìn)行剪切,被釋放的啟動(dòng)子經(jīng)過(guò)不斷地循環(huán)擴(kuò)增后,可產(chǎn)生大量的不同長(zhǎng)度的帶有熒光基團(tuán)的DNA裂解探針,實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的擴(kuò)增;(3)信號(hào)的分離主要由DNA探針的堿基序列和長(zhǎng)度控制,其出峰時(shí)間和前后順序均可優(yōu)化調(diào)整,提高了信號(hào)的分離效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

本研究中使用的所有核酸均由上海生工生物科技有限公司合成并通過(guò)HPLC純化,它們各自的序列在附表S1(詳見(jiàn)https://www.chrom-China.com)中列出。MBs-Dynabeads(鏈霉親和素包被的M-300)購(gòu)自無(wú)錫百邁格生物科技有限公司。DSN(50 U)購(gòu)自Evrogen公司(莫斯科,俄羅斯)。Tween 20由上海安耐吉化學(xué)提供。三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鈉(NaCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、HPLC級(jí)乙腈和甲醇均購(gòu)自中國(guó)上海醫(yī)藥集團(tuán)公司。醋酸三乙銨(TEAA)緩沖液購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(密蘇里州圣路易斯,美國(guó))。組胺、色胺、精胺和酪胺均購(gòu)自中國(guó)上海麥克林生化科技有限公司?？股貋?lái)自江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局。附表S2中列出了本工作中使用的緩沖液的組成,包括偶聯(lián)緩沖液、洗滌緩沖液以及雜交緩沖液。所有溶液均使用無(wú)核酸酶的超純水制備,該設(shè)備購(gòu)自深圳億利源水處理設(shè)備有限公司,其電阻為18.2 MΩ·cm。

離心分離使用Sigma 3-15離心機(jī)(哈爾茨奧斯特羅德,德國(guó))進(jìn)行。pH值測(cè)量使用中國(guó)上海三鑫電子設(shè)備有限公司的帶有玻璃-甘汞電極的SX-610數(shù)值pH計(jì)進(jìn)行。熒光測(cè)量在FS5分光光度計(jì)(英國(guó)愛(ài)丁堡儀器,柯克頓校區(qū))上進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1長(zhǎng)、短探針偶聯(lián)物的制備

根據(jù)之前的工作[19],將被生物素標(biāo)記的適配體(Aptamer 1、Aptamer 2、Aptamer 3和Aptamer 4)偶聯(lián)至鏈霉親和素涂層的磁珠表面。首先,取30 μL磁珠加入到2 mL離心管中,離心90 s后,放置在磁力架上90 s。隨后棄去溶劑并將磁珠保留在離心管中。然后使用偶聯(lián)緩沖液低檔振蕩清洗3次后,同樣放置在磁力架上90 s,棄去溶劑保留磁珠。將磁珠重新懸浮于洗滌緩沖液中,同時(shí)加入4種不同的適配體,在室溫下輕輕渦旋一段時(shí)間。渦旋結(jié)束后,將得到的適配體-磁珠偶聯(lián)物在4 ℃下保存?zhèn)溆谩榱诉x擇最佳的偶聯(lián)時(shí)間以及估算DNA探針在磁珠上的偶聯(lián)效率(IE)和百分含量(IP)。將3′端被熒光素標(biāo)記的適配體加入到經(jīng)過(guò)上述同樣洗滌磁珠步驟后的離心管中,在室溫下輕輕渦旋不同的時(shí)間,并將其置于磁力架上90 s。偶聯(lián)時(shí)間為30 min。隨后,將被生物素標(biāo)記的探針(Probe 1、Probe 2、Probe 3和Probe 4)偶聯(lián)至鏈霉親和素涂層的磁珠表面,這與適配體偶聯(lián)至磁珠的步驟相同。在含有磁珠的洗滌緩沖液中,同時(shí)加入4種不同的長(zhǎng)、短探針,在室溫下輕輕渦旋一段時(shí)間。偶聯(lián)時(shí)間為25 min。

1.2.2生物胺的檢測(cè)

將60 μL的Aptamer 1、Aptamer 2、Aptamer 3、Aptamer 4與磁珠的偶聯(lián)物加入到離心管中,然后依次加入15 μL 1 μmol/L的RNA啟動(dòng)子(Trigger 1、Trigger 2、Trigger 3、Trigger 4)和80 μL反應(yīng)緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.0, 30 mmol/L MgCl2),在37 ℃下反應(yīng)1 h。然后依次將15 μL 1 μmol/L的酪胺、組胺、精胺和色胺在37 ℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,將其置于磁力架上90 s,取上清液加入到含有60 μL Probe 1、Probe 2、Probe 3、Probe 4與磁珠偶聯(lián)物的棕色離心管中。然后加入0.9 U DSN和60 μL反應(yīng)緩沖液。將反應(yīng)混合物渦旋振蕩10 s以充分混合。在40 ℃下孵育210 min后,用5 μL DSN終止液停止DSN對(duì)DNA鏈的裂解。將其置于磁力架上90 s,取上清液注入HPLC中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3HPLC方法

使用悟空K2025系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行HPLC-熒光檢測(cè),該系統(tǒng)帶有高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和RF-20A熒光檢測(cè)器。數(shù)據(jù)處理使用LCsolution軟件。全多孔雜化硅膠柱Phenomenex Clarity?3 μm Oligo-RP色譜柱(50 mm×4.6 mm, 3 μm)用于多種核酸的分離。相比于傳統(tǒng)的硅膠色譜柱,Oligo-RP更適合對(duì)核酸的分離分析。柱溫設(shè)置為35 ℃。采用含有5%(v/v)乙腈的醋酸三乙胺(100 mmol/L, TEAA, pH=7.0)溶液(A)和甲醇(B)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min。梯度洗脫模式為0～20 min, 10%B～20%B; 20～25 min, 20%B～10%B; 25～30 min, 10%B。熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)置為488 nm和520 nm。

1.2.4實(shí)際樣品的前處理

取1 g肉類樣品加入到含有10 mL 1.0 mol/L HCl的離心管中,7 750 r/min離心20 min。隨后取2 mL上層清液加入到15 mL的離心管中,向離心管中依次加入0.13 g NaCl、2 mL 2.5 g/L丹磺酰氯溶液以及0.8 mL 6.0 mol/L NaOH,混合均勻后,衍生化反應(yīng)5 min,隨后以7 750 r/min離心1 min,離心后將上層溶液收集在色譜樣品瓶中,在4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1方法機(jī)理

圖1為基于適配體置換生物胺信號(hào)源并結(jié)合DSN輔助的目標(biāo)循環(huán)擴(kuò)增策略同時(shí)檢測(cè)4種生物胺(酪胺、組胺、精胺、色胺)的原理圖。如圖1所示,首先使用生物胺核酸適配體標(biāo)記磁珠,并與Trigger結(jié)合組裝雙鏈結(jié)構(gòu)。在檢測(cè)過(guò)程中,生物胺與適配體結(jié)合并釋放啟動(dòng)子,使其與修飾有熒光基團(tuán)的不同長(zhǎng)度的DNA核酸探針?lè)謩e結(jié)合,形成DNA-RNA異源雙鏈。加入的DSN可以特異性地裂解異源雙鏈DNA,同時(shí)保持RNA完整性。然后,釋放的啟動(dòng)子重新參與下一輪的循環(huán)。在足夠長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi),經(jīng)過(guò)不斷地雜交、裂解和釋放,可以得到大量的具有熒光信號(hào)的DNA裂解探針。由于堿基長(zhǎng)度和序列的差異,被剪切的DNA探針在HPLC中的保留時(shí)間不同。因此,代表不同生物胺的DNA裂解探針可以在HPLC中完美分離,從而實(shí)現(xiàn)在一次運(yùn)行中對(duì)4種生物胺的定量檢測(cè)。

圖 1 核酸適配體置換信號(hào)結(jié)合循環(huán)擴(kuò)增對(duì)4種生物胺檢測(cè)的示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the detection of the four biogenic amines (BAs) by aptamer replacement signal combined with cyclic amplification

2.1.2不同堿基序列的長(zhǎng)、短熒光探針在HPLC中的保留時(shí)間探究

研究發(fā)現(xiàn),寡核苷酸的堿基序列和長(zhǎng)度影響了它們?cè)谏V中的保留時(shí)間。在單鏈核酸中,堿基的疏水性順序?yàn)榘奏?C)<鳥嘌呤(G)<腺嘌呤(A)<胸腺嘧啶(T)。疏水性越低,在反相色譜中的保留越弱,出峰時(shí)間越早[20]。一般來(lái)說(shuō),寡核苷酸的保留強(qiáng)弱取決于堿基與流動(dòng)相、固定相之間的疏水作用。但堿基的疏水性太高,即使在核酸專用的Oligo-RP色譜柱中,它們的保留也非常弱。為了增加寡核苷酸在色譜柱上的保留時(shí)間,在流動(dòng)相中加入了TEAA離子對(duì)試劑。TEAA既帶正電荷又具有疏水性,因此不僅TEAA的正電荷能與核酸主鏈上的磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷反應(yīng),同時(shí)TEAA的疏水基團(tuán)又與固定相上十八烷基的疏水基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。這種離子對(duì)試劑起著連接核酸和柱基質(zhì)之間的橋梁作用,使DNA片段吸附在固定相上面。

通過(guò)將DNA探針設(shè)計(jì)成具有不同的堿基序列和長(zhǎng)度的核酸鏈,研究了其在HPLC中的保留時(shí)間(見(jiàn)圖2)。將色譜條件的梯度洗脫模式設(shè)置為20 min內(nèi)甲醇的比例由10%增加到30%?？梢钥闯?當(dāng)核酸鏈中的堿基個(gè)數(shù)相同時(shí),C、A和T的保留順序?yàn)镃4

圖 2 不同堿基序列和長(zhǎng)度的核酸鏈在HPLC中的保留Fig. 2 Retention in HPLC of nucleic acid chains with different lengths and bases

2.1.3HPLC方法的優(yōu)化

為了提高C4、C12、C30和T44個(gè)色譜峰之間的分離效率,需要選擇合適的HPLC條件進(jìn)行優(yōu)化。柱溫、流速和梯度洗脫過(guò)程是影響色譜峰分離度的3個(gè)主要因素。在梯度洗脫條件中包括梯度洗脫時(shí)間和梯度洗脫比例兩個(gè)方面。在此,將C4、C12、C30和T4等濃度一同進(jìn)樣,分別改變梯度洗脫時(shí)間和梯度洗脫比例,探究這兩個(gè)方面對(duì)分離度的影響。結(jié)果表明，改變梯度比例對(duì)分離度的影響較大(見(jiàn)附圖S1),因此在正交試驗(yàn)中選擇梯度比例作為優(yōu)化的一個(gè)因素。因此以梯度比例、柱溫和流速3個(gè)因素分別設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，可以分別得到R1、R2和R33個(gè)分離度(見(jiàn)附表S3～S4)。然后分別對(duì)R1、R2、R3進(jìn)行極差分析和方差分析(見(jiàn)附表S5～S8)，通過(guò)對(duì)各因素水平間的多重比較(見(jiàn)附表S9～附表S17),分別得到對(duì)R1、R2、R3來(lái)說(shuō)最佳的實(shí)驗(yàn)組合。對(duì)R1、R2和R3來(lái)說(shuō),最佳的色譜條件均為在35 ℃的柱溫下,甲醇以1.0 mL/min的流速在0 ～ 20 min內(nèi)從10%變化到20%(見(jiàn)附圖S2)。因此最終選擇1.2.3節(jié)色譜條件作為本實(shí)驗(yàn)的HPLC分析方法。在優(yōu)化后的色譜條件下,C4、C12、C30和T4的色譜圖如圖3所示,色譜峰的分離度分別是3.442、3.591和2.371,實(shí)現(xiàn)了4個(gè)峰之間的完全分離。

圖 3 正交試驗(yàn)優(yōu)化后4種DNA探針的色譜圖Fig. 3 Chromatogram optimized by orthogonal test of four DNA probes

2.1.4其他條件優(yōu)化

進(jìn)一步優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件(包括生物胺與適配體的孵育時(shí)間、DSN用量、Mg2+濃度、緩沖液的pH值、孵育溫度和DSN孵育時(shí)間),將生物胺的濃度設(shè)定為1 μmol/L,適配體和啟動(dòng)子的濃度都保持在1 μmol/L,探針的濃度為100 μmol/L，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)附圖S3。最終選擇的實(shí)驗(yàn)條件為:生物胺與適配體孵育時(shí)間120 min; DSN用量0.90 U; Mg2+濃度30 mmol/L; pH值7.0;孵育溫度40 ℃; DSN孵育時(shí)間210 min。

圖 4 可行性分析(n=3)Fig. 4 Feasibility analysis (n=3) a. blank; b. 0.9 U DSN; c. 1 μmol/L tyramine, histamine, spermine, tryptamine; d. 1 μmol/L tyramine+0.9U DSN; e. 1 μmol/L histamine+0.9 U DSN; f. 1 μmol/L spermine+0.9 U DSN; g. 1 μmol/L tryptamine+0.9 U DSN; h. 1 μmol/L tyramine, histamine, spermine, tryptamine+0.9 U DSN. Experimental conditions: 1 μmol/L aptamers and triggers, 100 μmol/L probes, 30 mmol/L Mg2+, pH 7.0, and incubated at 40 ℃ for 210 min.

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1可行性分析

為了驗(yàn)證這種方法的可行性,在相同的反應(yīng)條件下,對(duì)不同樣品進(jìn)行有/無(wú)生物胺或DSN的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,如圖4所示。在沒(méi)有目標(biāo)生物胺的情況下,無(wú)論是否加入DSN,幾乎都沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)(圖4a和4b)。當(dāng)僅有生物胺、適配體、啟動(dòng)子和探針存在的時(shí)候,雖然適配體和探針能夠形成DNA-RNA異源雙鏈,但沒(méi)有DSN酶對(duì)其DNA鏈進(jìn)行切割,進(jìn)而無(wú)法產(chǎn)生裂解的DNA探針。因此也幾乎不會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)物對(duì)應(yīng)的色譜峰(圖4c)。只有當(dāng)目標(biāo)生物胺和DSN同時(shí)存在時(shí),如圖4d、e、f和g所示,才會(huì)有相對(duì)應(yīng)的信號(hào)出現(xiàn)。當(dāng)4種生物胺和DSN都存在時(shí),可以觀察到這4種目標(biāo)物對(duì)應(yīng)的色譜峰的峰面積顯著增加(圖4h)。以上結(jié)果表明,該方法可以在一次進(jìn)樣中實(shí)現(xiàn)對(duì)酪胺、組胺、精胺和色胺的高靈敏檢測(cè)。

圖 5 (a)不同濃度下目標(biāo)物的色譜圖和(b)1 μmol/L生物胺對(duì)應(yīng)的4個(gè)色譜峰的分離度Fig. 5 (a) Chromatograms of the target substances under varying concentrations and (b) resolutions of the four signal peaks in HPLC (1 μmol/L BAs)

2.2.2檢測(cè)性能的分析

為了評(píng)價(jià)該方法對(duì)生物胺的檢測(cè)性能,在最佳的反應(yīng)條件下,對(duì)不同濃度的生物胺所產(chǎn)生的信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行了研究(見(jiàn)圖5a)。酪胺、組胺、精胺和色胺對(duì)應(yīng)的DNA裂解探針的保留時(shí)間分別為5.69、9.26、13.40和16.10 min。為了評(píng)估這4種峰的分離度,計(jì)算了生物胺在1 μmol/L時(shí)所對(duì)應(yīng)的色譜峰的分離度,如圖5b所示。其中R1為3.06,R2為3.62,R3為2.19。分離度均大于1.5,說(shuō)明4個(gè)峰已完全分離。在1 pmol/L的濃度下,4種目標(biāo)物所對(duì)應(yīng)的色譜峰仍然可以被明顯地分離。

不同濃度生物胺檢測(cè)的線性關(guān)系如附圖S4所示,在1 pmol/L～1 μmol/L范圍內(nèi),峰面積與生物胺濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)分別為0.995、0.992、0.991、0.995。酪胺、組胺、精胺和色胺的LOD分別為0.25、0.21、0.27和0.19 pmol/L。在整個(gè)線性范圍內(nèi),經(jīng)過(guò)3次重復(fù)測(cè)量,RSD均小于5%,充分表明了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了評(píng)估所建立方法的實(shí)用性,對(duì)從超市買來(lái)的新鮮草魚和豬肉進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果如表1所示，在魚肉中檢測(cè)到了12.321 nmol/L的酪胺和14.676 nmol/L的組胺，在豬肉中檢測(cè)到了16.982 nmol/L的組胺、17.756 nmol/L的精胺和13.172 nmol/L的色胺。為了評(píng)估基質(zhì)效應(yīng),向預(yù)處理得到的魚肉和豬肉樣品溶液中分別加入了1 nmol/L和10 nmol/L的酪胺、組胺、精胺和色胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到的相對(duì)回收率在101.2%～104.5%之間，本方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～4.3%之間。魚肉和豬肉中加標(biāo)前后的色譜圖見(jiàn)附圖S5。為了與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較,直接通過(guò)HPLC-紫外檢測(cè)器對(duì)魚肉中存在的酪胺和組胺進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如附圖S6a所示,其R2均是0.997。在該傳統(tǒng)的方法中,酪胺和組胺的LOD分別是15.23 nmol/L和15.07 nmol/L。隨后我們用注射器取1 g已經(jīng)放置了3 d的魚肉,經(jīng)過(guò)衍生化之后，分別使用本論文的方法和傳統(tǒng)的HPLC-紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)法對(duì)生物胺含量進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。根據(jù)我們先前的研究[21],肉類樣品在貯藏過(guò)程中,生物胺的含量會(huì)急劇上升,3 d后即可達(dá)到較高水平。因此,這里選擇放置3 d的魚肉進(jìn)行檢測(cè),以更清晰直觀地將本文方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較。結(jié)果如附表S18所示,本方法和傳統(tǒng)的HPLC方法結(jié)果基本吻合。附圖S6中的b圖和c圖分別是傳統(tǒng)HPLC方法和本方法加標(biāo)前后的魚肉樣本的色譜圖。以上結(jié)果均能說(shuō)明,該方法對(duì)實(shí)際樣品中多種生物胺的檢測(cè)具有良好的實(shí)用性。我們用同樣的方法檢測(cè)了硫酸慶大霉素中的生物胺,從表1的結(jié)果中可以看出，在硫酸慶大霉素中可以檢測(cè)到精胺的存在。表2列出了一些常見(jiàn)的檢測(cè)生物胺的方法,并比較了它們之間的檢測(cè)性能。從表2可以看出,我們的方法具有更低的LOD和更寬的線性范圍,充分表明了該方法優(yōu)越的檢測(cè)性能。

3 結(jié)論

綜上所述,本文開發(fā)了一種基于適配體置換出生物胺信號(hào)源并且結(jié)合DSN輔助目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增的HPLC檢測(cè)策略,并成功用于發(fā)酵類抗生素和肉類樣品中多種生物胺的同時(shí)識(shí)別和高靈敏檢測(cè)。適配體與DSN輔助啟動(dòng)子循環(huán)擴(kuò)增策略的結(jié)合有效提高了對(duì)目標(biāo)的選擇性和靈敏度。探針的堿基序列種類和長(zhǎng)度的控制、影響因素的正交分析以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化大大提高了目標(biāo)物的色譜分離度。重要的是,多種生物胺能夠通過(guò)一次進(jìn)樣就得以識(shí)別,這可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)色譜檢測(cè)方法的一些不足。該方法可擴(kuò)展至其他食品藥品有害物的同時(shí)檢測(cè),在食品藥品的高靈敏分析領(lǐng)域具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和潛在的開發(fā)前景。