microRNA-9-5p通過抑制Tau磷酸化參與阿爾茨海默病的機(jī)制

郝婧雯 鄧炎堯 謝君 萬奇

長沙市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（長沙 410000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病，其特征是Tau 聚集體在大腦中沉積和認(rèn)知缺陷［1-2］。細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的Tau 蛋白是神經(jīng)原纖維纏結(jié)的關(guān)鍵成分，導(dǎo)致神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)異常和軸突運(yùn)輸功能障礙［3］。因此，通過上游靶信號(hào)的早期修飾治療抑制Tau 過度磷酸化可能是在預(yù)防AD 方面最有效的途徑。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，microRNAs（miRNAs）參與AD 中的多個(gè)病理過程［4-5］。據(jù)推測(cè)，miRNA 靶向網(wǎng)絡(luò)的異常調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)涉及Aβ 過度產(chǎn)生的基因、Tau 過度磷酸化、神經(jīng)膠質(zhì)激活誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、突觸功能障礙、和神經(jīng)元凋亡在AD 病理過程中起關(guān)鍵作用［6-8］。microRNA-9-5p（miR-9-5p）可以抑制神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞損傷。例如，miR-9-5p 通過靶向GSK-3β 抑制AD 細(xì)胞模型中的線粒體損傷和氧化應(yīng)激［9］。然而，目前尚不清楚miR-9-5p 是否對(duì)AD中Tau 過度磷酸化產(chǎn)生影響。因此，本研究選擇APP/PS 小鼠模型作為研究對(duì)象，并分析miR-9-5p在小鼠海馬和血漿中表達(dá)情況，同時(shí)使用慢病毒（lentivirus，Lv）介導(dǎo)海馬中miR-9-5p 過度表達(dá)，并針對(duì)認(rèn)知行為、突觸活動(dòng)、Tau 磷酸化和DNA 損傷進(jìn)行了表征。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和處理雄性APPswe/PS1dE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠和WT C57BL/6（WT）同窩小鼠獲自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心。將APP/PS1 小鼠隨機(jī)分為3 組：Lv-WT 組、Lv-con 組和Lv-miR-9-5p組，每組18 只；WT 小鼠各隨機(jī)分為3 組：Lv-WT組、Lv-con 組和Lv-miR-9-5p 組，每組18 只。過表達(dá)miR-9-5p（Lv-miR-9-5p）和對(duì)照（Lv-con）的Lv 購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司。將Lv-miR-9-5p（4×105轉(zhuǎn)導(dǎo)單位［TU］）或Lv-con（4×105TU）緩慢注射到6 個(gè)月大的APP/PS1 小鼠（Lv-miR-9-5p 組和Lv-con 組）的雙側(cè)海馬中（前后位置-2.0 mm，內(nèi)側(cè)-外側(cè)位置±1.6 mm，背腹距前囟1.5 mm）。同時(shí)，將Lv-con（4 × 105TU）緩慢注射到6 個(gè)月大的WT 小鼠（Lv-WT 組）的雙側(cè)海馬中。注射后30 d進(jìn)行行為測(cè)試或電生理實(shí)驗(yàn)，然后處死小鼠進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。

1.2 行為測(cè)試參照文獻(xiàn)方法［10］進(jìn)行新物體識(shí)別（novel-object recognition，NOR）、恐懼狀態(tài)（fear condition，F(xiàn)C）和莫里斯水迷宮（Morris water maze，MWM）測(cè)試。（1）NOR：在NOR 試驗(yàn)前24 h，將小鼠適應(yīng)在一個(gè)30 cm 長×30 cm 寬×45 cm 高的非透明盒子中30 min。在訓(xùn)練階段，向小鼠展示兩個(gè)新對(duì)象（對(duì)象1 和對(duì)象2），并允許其自由探索10 min。在測(cè)試階段，將其中一個(gè)對(duì)象（對(duì)象2）替換為一個(gè)新對(duì)象。讓小鼠探索這兩個(gè)物體5 min。使用視覺跟蹤系統(tǒng)記錄探索過程，并通過探索新物體的時(shí)間除以總時(shí)間計(jì)算辨別指數(shù)。（2）恐懼狀態(tài)測(cè)試：使用XR-XC404 條件反射室（上海欣軟信息科技有限公司）進(jìn)行情境和線索恐懼條件測(cè)試。在訓(xùn)練階段，將小鼠置于室內(nèi)3 min，然后進(jìn)行聲調(diào)電擊刺激，并在刺激后繼續(xù)在室內(nèi)停留30 s。在試驗(yàn)階段，在訓(xùn)練后24 h 測(cè)量環(huán)境依賴性試驗(yàn)，并允許小鼠在同一室內(nèi)停留5 min。停止被定義為“除呼吸外無運(yùn)動(dòng)”，并使用跟蹤系統(tǒng)記錄停止時(shí)間。2 h 后，這些小鼠被帶到一個(gè)完全不同的新房間，持續(xù)3 min，并傳遞訓(xùn)練音調(diào)，以檢查提示性恐懼條件反射。（3）MWM：進(jìn)行MWM 測(cè)試以評(píng)估空間記憶功能。在采集試驗(yàn)期間，小鼠在60 s 內(nèi)接受連續(xù)5 d 的訓(xùn)練，以找到隱藏在水下1 cm 處的平臺(tái)，并使用迷宮軟件記錄潛伏期（美國Stoelting公司）。在探針試驗(yàn)期間，移除平臺(tái)，讓小鼠游泳1 min。然后記錄穿過平臺(tái)的次數(shù)、找到目標(biāo)象限的潛伏期、在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間、游泳速度和總距離。

1.3 微陣列和定量實(shí)時(shí)PCR分離海馬組織并使用組織勻漿器（武漢賽維爾生物科技有限公司）進(jìn)行勻漿，使用RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN 公司）或MiRNeasy Serum/Plasma Kit（德國QIAGEN 公司）提取和純化組織或血漿中的RNA。使用具有1 881 個(gè)獨(dú)特miRNA 探針的小鼠miRNA 微陣列（Release 21.0；數(shù)譜（上海）生物科技有限公司）分析miRNA 表達(dá)譜。篩選出APP/PS1 小鼠海馬中差異表達(dá)的miRNA（倍數(shù)變化＞2，調(diào)整P＜0.05）。使用TaqMan Advanced miRNA Assays（美國Thermo Fisher 公司）對(duì)miR-9-5p 表達(dá)進(jìn)行定量。使用ABI 7500 PCR 儀器（美國Applied Biosystems 公司）進(jìn)行反應(yīng)。U6 小核RNA（snRNA）和cel-miR-39（美國Thermo Fisher 公司）分別用作組織和血漿的對(duì)照。用于實(shí)時(shí)PCR 的引物序列如下：miR-9-5p 正向：5'-GGGGTAGCACCATTTGAAA-3'，反向：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.4 電生理學(xué)參照文獻(xiàn)方法［11］制備海馬切片（300 μm）。將切片轉(zhuǎn)移至微電極陣列，連續(xù)灌注含氧人工腦脊液（ACSF）（2 mL/min），并保持在32 ℃進(jìn)行記錄。使用MEA-2100-60-System（德國Multi Channel Systems 公司）記錄CA1 輻射層中的場(chǎng)興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potentials，EPSP）。為了評(píng)估突觸的輸入輸出關(guān)系，研究測(cè)量了EPSP 的斜率。刺激強(qiáng)度是長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）實(shí)驗(yàn)中最大誘發(fā)反應(yīng)的一半。LTP 由高頻刺激（HFS；100 Hz，三列，1 s持續(xù)時(shí)間，10 s 間隔時(shí)間）誘導(dǎo)。初始EPSP 斜率由控制期間的平均斜率值標(biāo)準(zhǔn)化。通過LTP-Director軟件獲取數(shù)據(jù)，并使用LTP-Analyzer 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 高爾基染色根據(jù)快速高爾基染色試劑盒（美國FD Neurotechnologies 公司）進(jìn)行高爾基染色。將小鼠的腦組織在室溫避光下在溶液A 和B的混合物中浸泡2 周，然后轉(zhuǎn)移到溶液C 中6 d。用低溫切片機(jī)（德國Leica 公司）將腦組織切成100 μm 切片，并使用X73 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）捕獲圖像。計(jì)算CA1 區(qū)每10 μm 突觸長度的二級(jí)突觸分支刺數(shù)和每10 μm 蘑菇刺的百分比。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析將海馬組織（每組n= 6）置于玻璃勻漿器中在1∶107（w/v）冰冷的蛋白質(zhì)提取緩沖液中勻漿。收集可溶性蛋白，4 ℃12 000g離心10 min，通過SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：抗AT8（1∶1 000；美國Chemicon 公司）和抗GAPDH（1∶5 000，美國Bioworld 公司）。用0.1% Tween 20/Tris 緩沖鹽水洗滌30 min 后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL 試劑盒（美國Millipore 公司）可視化蛋白質(zhì)信號(hào)，并使用Image J 軟件量化強(qiáng)度。

1.7 免疫熒光分析將腦組織（n= 6）固定72 h，然后由石蠟塊制成6 μm 厚的冠狀切片，或25 μm厚的冰凍切片（前囟后-1.46 ～-2.46 mm）。用0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）在90 ℃進(jìn)行抗原修復(fù)15 min 后，用10%正常山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。然后在4 ℃下應(yīng)用特定的一抗孵育過夜：AT8、γH2AX（美國Chemicon 公司）。然后將切片與特異性Alexa Fluor 568 或488 二抗（美國Invitrogen 公司）在室溫下孵育2 h。用3 μmol/L 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Sigma-Aldrich 公司）進(jìn)行復(fù)染。在配備ZEN light 軟件的LSM 700激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）下觀察免疫標(biāo)記的組織。所有定量分析均在至少四個(gè)圖像上進(jìn)行，這些圖像是從至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中每只動(dòng)物至少四個(gè)連續(xù)切片獲得。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較用t檢驗(yàn)；多組比較用重復(fù)測(cè)量的單因素或雙向方差分析，后進(jìn)行Bonferroni 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1 小鼠的海馬和血漿中miR-9-5p 降低與年齡匹配的野生型（WT）同窩小鼠相比，6 個(gè)月大的APP/PS1 小鼠海馬中有17 個(gè)miRNA 上調(diào)和47 個(gè)miRNA 下調(diào)（圖1A）。6月齡和9月齡APP/PS1 小鼠海馬中miR-9-5p 水平較WT 組顯著降低（圖1B）。此外，6 個(gè)月大的AD 小鼠血漿中miR-9-5p 水平降低（圖1C）。

圖1 APP/PS1 小鼠的大腦和血漿中的miR-9-5p 減少Fig.1 Decreased miR-9-5p in brain and plasma of APP/PS1 mice

2.2 外源性miR-9-5p 過表達(dá)可防止APP/PS1 小鼠的記憶和突觸損傷Lv-miR-9-5p 處理后，海馬和血漿中miR-9-5p的水平顯著升高（圖2）。為了研究miR-9-5p 過表達(dá)對(duì)APP/PS1 小鼠記憶功能的影響，在Lv 注射后30 d 進(jìn)行了行為測(cè)試，包括新物體識(shí)別、恐懼條件和莫里斯水迷宮測(cè)試。與Lv-con組小鼠相比，Lv-miR-9-5p 組小鼠的辨別指數(shù)、關(guān)聯(lián)條件恐懼停止、暗示條件恐懼停止、跨平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間均顯著增加（P＜0.05），和跨平臺(tái)時(shí)間顯著降低（P＜0.05），見表1。

圖2 在6 個(gè)月大的APP/PS1 小鼠的海馬中過表達(dá)外源性miR-9-5p 后海馬和血漿中miR-9-5p 水平Fig.2 Levels of miR-9-5p in hippocampus and plasma after overexpression of exogenous miR-9-5p in the hippocampus of 6-month-old APP/PS1 mice

表1 外源性miR-9-5p 過表達(dá)對(duì)APP/PS1 小鼠記憶損傷的影響Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s

表1 外源性miR-9-5p 過表達(dá)對(duì)APP/PS1 小鼠記憶損傷的影響Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s

注：與Lv-WT 組相比，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與Lv-con 組相比，#P ＜0.05，###P ＜0.001

組別Lv-WT Lv-con Lv-miR-9-5p F 值P 值NOR 測(cè)試辨別指數(shù)0.73±0.08 0.58±0.06**0.75±0.05##4.216 0.038條件性恐懼測(cè)試關(guān)聯(lián)條件恐懼停止（%）78.26±4.21 54.32±3.77***75.49±3.58###5.136 0.015 MWM 測(cè)試跨平臺(tái)時(shí)間（s）6.74±0.45 15.26±1.83***10.44±0.79#8.564＜0.001暗示條件恐懼停止（%）74.82±4.06 49.13±3.41***75.63±3.85###5.287 0.013跨平臺(tái)次數(shù)3.88±0.48 1.63±0.24***2.84±0.28#7.842＜0.001目標(biāo)象限時(shí)間（s）23.10±2.56 16.42±1.04***19.63±1.27#7.193＜0.001

2.3 外源性miR-9-5p 過表達(dá)可防止APP/PS1 小鼠的突觸損傷與Lv-con 組相比，Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中的突觸棘密度、蘑菇刺的百分比顯著增加（P＜0.05，圖3A-C），并且Lv-miR-9-5p 組小鼠表現(xiàn)出更高的長期增強(qiáng)幅度（圖3D）。

圖3 外源性miR-9-5p 過表達(dá)可防止APP/PS1 小鼠的突觸損傷Fig.3 Exogenous miR-9-5p overexpression prevents synaptic damage in APP/PS1 mice

2.4 外源性miR-9-5p 過表達(dá)可防止Tau 過度磷酸化免疫印跡和免疫熒光分析共同顯示，與Lv-WT組相比，Lv-con 組小鼠海馬中AT8（Ser202/Thr205）水平顯著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中AT8（Ser202/Thr205）水平較Lv-con 組顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 小鼠海馬中AT8 蛋白的免疫印跡和免疫熒光分析Fig.4 Immunoblot and immunofluorescence analysis of AT8 protein in mouse hippocampus

2.5 外源性miR-9-5p 過表達(dá)可防止Tau 過度磷酸化誘導(dǎo)的DNA 損傷海馬中Tau 過度磷酸化是疾病過程的標(biāo)志，可能代表DNA 損傷。與Lv-WT組相比，Lv-con 組小鼠海馬中AT8 和γH2AX 共定位數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中AT8 和γH2AX 共定位數(shù)量較Lv-con 組顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 小鼠海馬中AT8 和γH2AX 的免疫熒光染色代表圖和定量分析Fig.5 Representative images and quantitative analysis of immunofluorescence staining for AT8 and γH2AX in the mouse hippocampus

3 討論

AD 的病因復(fù)雜，迄今為止，常規(guī)的藥物治療只能適當(dāng)緩解AD 患者的某些癥狀，不可避免地會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的副作用［2］。因此，揭示AD 發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療具有重要意義。各種miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中異常表達(dá)，可能參與AD 的發(fā)生和進(jìn)展［4-5］。本研究揭示了miR-9-5p 在AD 發(fā)病機(jī)制中的新作用。miR-9-5p 在6 個(gè)月大的APP/PS1小鼠的海馬和血漿中下調(diào)。Lv 介導(dǎo)的miR-9-5p 在海馬中的過表達(dá)改善了APP/PS1 小鼠的突觸可塑性并減輕了記憶缺陷。此外，miR-9-5p 過表達(dá)降低了Tau 過度磷酸化，并防止Tau 過度磷酸化誘導(dǎo)的DNA 損傷。因此，本研究結(jié)果表明miR-9-5p 在AD 發(fā)病機(jī)制中起重要作用，miR-9-5p 過表達(dá)可能是治療AD 的潛在療法。

miRNA 已被證明在突觸可塑性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，突觸可塑性調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，包括AD，如脆性X 智力遲鈍蛋白相關(guān)的miR-125b和miR-132 對(duì)突觸棘有抑制作用［12-13］。miR-181a在AD 小鼠中顯著上調(diào)，而抑制miR-181a 可減輕記憶缺陷并增加其靶標(biāo)GluA2在AD小鼠中的表達(dá)［14］。miR-101b 已被證實(shí)在海馬神經(jīng)元和AD 小鼠中調(diào)節(jié)APP，并且miR-101b 的過表達(dá)通過拯救組蛋白去乙?；?來誘導(dǎo)Tau病理學(xué)和突觸、記憶障礙［15］。先前的研究表明，miR-9-5p 與神經(jīng)發(fā)生和腦細(xì)胞活力有關(guān)［16］，在6 個(gè)月大的APP/PS1 小鼠的海馬中miR-9-5p 表達(dá)降低［8］；并且miR-9-5p 的表達(dá)在散發(fā)性AD 患者的額葉回和皮質(zhì)中下調(diào)［17］。與這些研究一致，本研究證實(shí)APP/PS1 小鼠的海馬和血漿中miR-9-5p 降低，而miR-9-5p 過表達(dá)促進(jìn)APP/PS1小鼠海馬突觸傳遞和增加突觸棘密度，這與改善記憶功能有關(guān)。

作為微管相關(guān)蛋白，Tau 蛋白在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定微管并參與其他細(xì)胞功能，如微管組裝、軸突運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期，這些功能受Tau 磷酸化的控制［18-19］。許多神經(jīng)退行性疾病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在顯著的Tau 病理學(xué)［20］。在Tau 病變中，細(xì)胞內(nèi)可溶性Tau 形成聚集的、過度磷酸化的Tau 絲狀結(jié)構(gòu)，這與突觸丟失和神經(jīng)元死亡有關(guān)［21］。作為許多神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志性發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1小鼠中觀察到異常Tau 磷酸化可能是認(rèn)知障礙的主要原因［22］。此外，Tau 蛋白的異常過度磷酸化可能在麻醉或外周手術(shù)誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙和神經(jīng)元凋亡的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［23-25］。與先前研究報(bào)道的結(jié)果一致，本研究在6 個(gè)月大的APP/PS1 小鼠海馬中觀察到AT8 以及AT8 和γH2AX 共定位數(shù)量均顯著增加，證實(shí)了異常Tau 磷酸化的存在，并導(dǎo)致海馬DNA 損傷。值得注意的是，miR-9-5p 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些變化，表明miR-9-5p 在AD 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

總之，本研究數(shù)據(jù)證明了miR-9-5p 在AD 發(fā)病機(jī)制中的有益作用，其保護(hù)機(jī)制涉及減少異常Tau磷酸化和DNA 損傷。因此，miR-9-5p 過表達(dá)可能是AD 的潛在治療靶點(diǎn)。然而，miR-9-5p 過表達(dá)是否通過其他途徑參與保護(hù)AD 仍有待研究。