補益肝腎湯對小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的影響及其機制

彭福 劉洋 孫權(quán) 袁云飛 鄭明慧 胡高源 唐東昕 徐遠坤

1貴州中醫(yī)藥大學骨傷學院（貴陽 550001）；2貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科（貴陽 550001）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的退行性疾病，與年齡、肥胖、性別、體質(zhì)量和外傷有關(guān)［1］。主要表現(xiàn)是滑膜增生，骨贅形成，軟骨下骨硬化，進行性關(guān)節(jié)軟骨破壞，細胞外基質(zhì)合成和分解代謝失衡導致軟骨丟失［2］。據(jù)統(tǒng)計，OA 影響著全球2.5 億人口的生活，每年帶來超過891 億美元的經(jīng)濟負擔［3］。目前，早期和中期OA 的治療策略是緩解關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)內(nèi)注射，晚期OA 的治療策略是關(guān)節(jié)置換手術(shù)。然而，這些治療雖能在一定程度上緩解OA 的癥狀，提高患者的生存質(zhì)量，但對阻斷OA 的進行性發(fā)展作用甚微。OA 的具體發(fā)病機制尚未明確?，F(xiàn)有證據(jù)表明，OA 的發(fā)病機制與炎癥因子、cho淋巴細胞異常凋亡、細胞外基質(zhì)降解有關(guān)。OA 發(fā)展過程中，腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1、IL-6 等炎性因子異常表達，導致軟骨細胞凋亡增加，細胞外基質(zhì)降解［1，4］。目前，OA 的早期診斷和治療仍缺乏有效的手段。

中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎的療效確切，具有療效好、副作用小的優(yōu)勢，顯示了良好的應用前景［5］。骨關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)退行性病變，與肝腎關(guān)系密切。目前，補益肝腎在治療骨關(guān)節(jié)炎上起著重要作用［5］。中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎可謂是百家爭鳴、百花齊放。無論是從專病專方還是從中藥制劑均在臨床中取得了顯著的進展，為中醫(yī)藥治療痹病提供了新的思路［6］。近年來，中醫(yī)藥在骨關(guān)節(jié)炎的研究取得了很大的進展，中醫(yī)藥可以通過促進軟骨細胞增殖、抑制軟骨細胞凋亡、抑制炎性因子釋放、改善氧自由基的異常代謝、抑制NO 合成、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）水平等多個環(huán)節(jié)來恢復關(guān)節(jié)軟骨的代謝平衡［5］，這些理論為中醫(yī)藥臨床治療本病提供了大量的理論依據(jù)。

補益肝腎中藥內(nèi)服法治療骨關(guān)節(jié)炎患者在改善膝關(guān)節(jié)癥狀及膝關(guān)節(jié)關(guān)功能，延緩早期關(guān)節(jié)軟骨的退化，抗炎、保護和修復關(guān)節(jié)軟骨方面具有確切證據(jù)和臨床驗證。中醫(yī)藥由于具有整體調(diào)節(jié)、多靶點作用等優(yōu)點，使得從中醫(yī)藥角度防治OA 成為研究熱點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57bl/6j 小鼠57 只，雄性，6～8 周齡，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)條件：溫度18～26 ℃，濕度：30%～70%。倫理許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 實驗試劑自噬抑制劑雷帕霉素：源葉生物（CAS：53123-88-9）；TGF-B1（bs-0086R，Bioss）；ALK5（bs-0638R，Bioss）；smad3（af6362，Affinity）；smad2（bs-0718R，Bioss）；SOX9（bs-4117R，Bioss）；P70S6K（14484-1-ap，Proteintech）；PI3K（21739-1-AP，Proteintech）；AKT（ab8805，abcam）；MTOR（66888-1-Ig，Proteintech）；小鼠白細胞介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（ED-20188，昌侖碩）；小鼠白細胞介素8（IL-8）試劑盒（ED-20191，昌侖碩）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（ED-20852，昌侖碩）；Rabbit Anti TGF-β 1（bs-0086R，Bioss，1/1 000）；Rabbit Anti ALK5（bs-0638R，Bioss，1/500）；Rabbit Anti Sox9（bs-4177R，Bioss，1/500）；Rabbit Anti PI3K（AF6241，Affinity，1/1 000）；Rabbit Anti AKT（AF4718，Affinity，1/1 000）。

1.3 藥物配制補益肝腎湯高劑量：將126 g 生藥，補益肝腎復方：獨活9 g，桑寄生9 g，杜仲9 g，牛膝9 g，細辛9 g，秦艽9 g，茯苓9 g，肉桂心9 g，防風9 g，川芎9 g，人參9 g，甘草9 g，當歸6 g，芍藥6 g，干地黃6 g。放入純水，水量浸沒過中藥，浸泡1 h，然后開始煎煮2 h，收集藥水，再次加水煎煮2 h 得到中藥和第一次中藥混合濃縮得到5 g/mL的濃度100 mL，高劑量小鼠給藥體積為0.15 mL/10 g，中劑量小鼠給藥體積為0.075 mL/10 g，低劑量小鼠給藥體積為0.037 5 mL/10 g。

1.4 小鼠前交叉韌帶切斷造骨關(guān)節(jié)炎的模型建立小鼠稱重后按1%戊巴比妥鈉腹腔注射（劑量150 mg/kg）。將完全麻醉的小鼠剃去膝關(guān)節(jié)處鼠毛并消毒皮膚。暴露膝關(guān)節(jié)滑車溝：于膝關(guān)節(jié)處用手術(shù)刀做一平滑切口，鈍性分小鼠皮膚肌肉，暴露膝關(guān)節(jié)，靠近膝關(guān)節(jié)處再次開口切口肌肉，把肌肉向?qū)?cè)翻轉(zhuǎn)，暴露膝關(guān)節(jié)滑車溝。暴露前交叉韌帶：用顯微鑷子小心分離關(guān)節(jié)腔脂肪墊，將小鼠膝關(guān)節(jié)彎曲到90°，暴露前交叉韌帶。通過抽屜實驗驗證造模效果。術(shù)后護理：縫合皮膚消毒。將小鼠轉(zhuǎn)移至電熱毯上，做好保暖措施，待小鼠完全蘇醒后轉(zhuǎn)移至干凈鼠籠中。

1.5 實驗分組及給藥處理（1）對照組（Control）；（2）模型組（KOA）；（3）模型+補益肝腎湯低劑量給藥組（0.037 5 mL/10 g）；（4）模型+補益肝腎湯中劑量給藥組（0.075 mL/10 g）；（5）模型+補益肝腎湯高劑量給藥組（0.15 mL/10 g）；造模1 個月后進行1 次/d 灌胃補益肝腎湯連續(xù)30 d，高劑量給藥體積為0.15 mL/10 g，中劑量小鼠給藥體積為0.075 mL/10 g，低劑量小鼠給藥體積為0.037 5 mL/10 g。

1.6 番紅O 染色參照戴方駿等［7］的方法對各組軟骨組織進行番紅O 染色，觀察軟骨下的骨組織結(jié)構(gòu)。

1.7 免疫組化參照曾澄等［8］方法對各組軟骨組織進行免疫組化染色，觀察GF-B1：200；ALK5（1∶200）；smad2（1∶200）；smad3（1∶100）；SOX9（1∶200）；P70S6K（1∶200）；PI3K（1∶100）；AKT（1∶200）mtor（1∶50）的表達水平。

1.8 Western blot參照呂昌偉等［9］方法檢測TGF-β1、ALK5、Sox9、PI3K、AKT 的蛋白水平。

1.9 HE 染色參照曾澄等［8］描述的方法對各組軟骨組織進行HE 染色。

1.10 ELISA 檢測參照ELISA 試劑盒，檢測各組外周血中TNF-α、IL-6、IL-8 的表達水平。

1.11 統(tǒng)計學方法應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示，兩組之間定量數(shù)值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KOA 模型驗證正常組軟骨表面光滑、紅色軟骨層次明顯，模型組紅染少軟骨明顯減少，軟骨表面不光滑被纖維組織取代，模型成功。見圖1。

圖1 番紅O 染色驗證造模Fig.1 Safranin O staining to verify the modeling

2.2 KOA 模型小鼠軟骨組織中各蛋白表達變化免疫組化結(jié)果顯示，相較于對照組，模型組小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達水平有所降低，見圖2A。相較于對照組，模型組小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、Sox9、PI3K、AKT 的蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖2B。

圖2 KOA 模型小鼠軟骨組織中各蛋白表達變化Fig.2 Changes of protein expression in cartilage tissue of KOA model mice

2.3 不同劑量補益肝腎湯對小鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響免疫組化結(jié)果顯示，相較于對照組，模型組小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達發(fā)生顯著下調(diào)（P＜0.05）；而補益肝腎湯治療組小鼠軟骨組織相較于模型組小鼠軟骨組織，TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.05），且這種上調(diào)趨勢隨著補益肝腎湯的濃度上升而上升，見圖3A。相較于對照組，模型組小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-8 的表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；而補益肝腎湯治療后相較于模型組，TNF-α、IL-6、IL-8的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），且這種上調(diào)趨勢隨著補益肝腎湯的濃度上升而上升，見圖3B。

圖3 不同劑量補益肝腎湯對小鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響Fig.3 Effects of different doses of Buyiganshen decoction on osteoarthritis in mice

2.4 補益肝腎湯介導TGF-β1 信號通路對小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的影響相較于骨關(guān)節(jié)炎模型組，補益肝腎湯治療組小鼠軟骨組織退變程度減弱、炎性細胞浸潤數(shù)目減少、嗜復紅蛋白沉積減輕，見圖4A。而補益肝腎湯治療組在添加TGF-β1 抑制劑SB-431542 組后相較于補益肝腎湯治療組，小鼠軟骨組織退變程度增強、炎性細胞浸潤數(shù)目增多、嗜復紅蛋白沉積增多。相較于骨關(guān)節(jié)炎模型組，補益肝腎湯治療組小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達發(fā)生顯著上調(diào)；而補益肝腎湯治療組添加TGF-β1 抑制劑SB-431542 組后相較于補益肝腎湯治療組的TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達發(fā)生顯著下調(diào)，見圖4B。相較于骨關(guān)節(jié)炎模型組，補益肝腎湯治療組小鼠軟骨組織中TNF-α 的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），而在分別添加TGF-β1 抑制劑后，這一下調(diào)趨勢被顯著逆轉(zhuǎn)，且相較于補益肝腎湯治療組TNF-α 的表達發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖4C。

圖4 補益肝腎湯介導TGF-β1 信號通路對小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的影響Fig.4 The effect of Buyiganshen decoction mediated TGF-β1 signaling pathway on mouse osteoarthritis model

3 討論

本研究主要通過切斷前交叉韌帶法以建立KOA 小鼠模型。膝關(guān)節(jié)炎的造模方法主要有關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)（Hulth 法、前交叉韌帶切斷法、半月板切除法、軟骨缺損法、破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定術(shù)、破壞關(guān)節(jié)血液循環(huán)術(shù)），非手術(shù)方法（關(guān)節(jié)制動、寒冷刺激、關(guān)節(jié)撞擊）；關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法（尿激酶型纖溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶等）［6，10］。通過番紅O 染色發(fā)現(xiàn)，正常組軟骨表面光滑、紅色軟骨層次明顯，模型組紅染少軟骨明顯減少，軟骨表面不光滑被纖維組織取代，說明KOA 模型成功。

TGF-β1 是由TUCKER 最早發(fā)現(xiàn)的一種多功能細胞因子，在胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、炎性反應、組織修復、纖維化等多個方面都有重要作用［11］，TGF-β1 信號傳導通路異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［12］。ALK5 的活化是激活Smad2 和smad3 分子磷酸化激活過程的關(guān)鍵［13］。TGF-β1 通過β-catenin信號通路［14］促進軟骨細胞增殖并維持軟骨細胞表型。這一過程的完成通過Smad3 激活而增強了II型膠原的合成，SOX9 與Smad2 和Smad4 結(jié)合形成的復雜復合物激活了Smad3［15］。這個Smad2/3 信號通路能夠抑制體外培養(yǎng)軟骨細胞的成熟和肥大性分化。Smad3 基因缺乏小鼠會發(fā)生軟骨退變性疾病，而Smad3 基因缺失小鼠合并TGF-β1 分子病變的話將會導致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［16-17］。TGF-β1 參與的分子信號通路較多，抑制軟骨細胞衰老、維持軟骨細胞表型的主要通路有TGF-β1-ALK5-Smad2，3-Sox9 通路，TGF-β1-PI3-Akt-mTor-p70S6 通路，這些通路激活和上調(diào)的終末效應都是促進Ⅱ型膠原分泌，促進多糖蛋白形成［18-19］。而Ⅱ型膠原和多糖的分泌正是軟骨細胞和軟骨組織生物活性維持的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，KOA 模型小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、Smad2、Smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達水平有所降低。這結(jié)果說明在OA 關(guān)節(jié)軟骨細胞退變、破壞過程中，TGFβ1-SOX9/p70S6-細胞外基質(zhì)信號通路的調(diào)節(jié)具有重要作用。

中藥在治療關(guān)節(jié)炎上也有很大的進展。陶娟［20］觀察補益肝腎法治療骨關(guān)節(jié)炎的療效，治療組采用補益肝腎中藥治療骨關(guān)節(jié)炎患者30 例，并與美洛昔康組做對照，總有效率分別為86%和83%。所以在本研究中進一步探究補益肝腎湯發(fā)揮骨關(guān)節(jié)炎治療的具體機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠軟骨組織退變程度減弱、炎性細胞浸潤數(shù)目減少、嗜復紅蛋白沉積減輕；小鼠軟骨組織中TGF-β1、ALK5、Smad2、Smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表達發(fā)生顯著上調(diào)；而這些結(jié)果可以被TGF-β1抑制劑逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果說明補益肝腎湯對骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用，并且這種作用是通過TGFβ1-SOX9/p70S6-細胞外基質(zhì)信號通路起作用。

IL-6 可抑制骨糖蛋白合成，并促進成纖維細胞和基質(zhì)微分子的降解，從而加重軟骨損傷［21］。IL-8 是目前已知作用最強的中性粒細胞趨化因子，可由滑膜細胞本身分泌，促使炎癥細胞向炎癥部位募集，增強對關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用［22-23］。抑制滑膜細胞中IL-8 表達有可能成為延緩OA 發(fā)病進程的關(guān)鍵因素。TNF-α 可通過降解軟骨基質(zhì)、提高其他炎性因子活性、促進骨膜細胞產(chǎn)生前列腺素E2 等多個方面破壞膝關(guān)節(jié)軟骨組織［24-25］。本研究結(jié)果顯示，KOA 組的TNF-α、IL-6、IL-8 表達均升高，用補益肝腎湯治療后TNF-α、IL-6、IL-8 表達均下降；而這些結(jié)果可以被TGF-β1 抑制劑逆轉(zhuǎn)。說明補益肝腎湯可抑膝關(guān)節(jié)OA 小鼠滑膜細胞炎性因子分泌；而這種作用是通過TGFβ1-SOX9/p70S6-細胞外基質(zhì)信號通路起作用。

綜上所述，在OA 關(guān)節(jié)軟骨細胞退變、破壞過程中，TGFβ1-SOX9/p70S6-細胞外基質(zhì)信號通路的調(diào)節(jié)具有重要作用，并且補益肝腎中藥復方可以通過激活TGFβ1-SOX9/p70S6-細胞外基質(zhì)信號通路從而治療OA，后續(xù)可以通過藥物成分的分析，通路回溯驗證實驗以及藥物單體研究等進行進一步研究。