長鏈非編碼RNA SPINT1-AS1抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和促進凋亡的研究

劉春汕 杜坤朋 王栢耀 劉威 田允鴻

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州 510095）

2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的癌癥［1］。根據(jù)表達受體分類，乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B 型、表皮生長因子受體-2（epidermal growth factor receptor 2，Her-2）過表達型以及TNBC 4 種類型［2-3］。在乳腺癌分型中，TNBC 是最為兇險的一種類型，其發(fā)病率大約占乳腺癌的15%～20%，生長迅速，惡性程度高。且因為TNBC 不表達雌激素受體、孕激素受體以及Her-2，因此缺乏經(jīng)典的治療靶點，目前尚無較好的針對性治療方案［4-5］，所以探索新的治療靶點對TNBC 是至關重要的。

lncRNA 是存在于真核生物中的一類由大于200 個核苷酸組成，以不編碼蛋白為特征的RNA 分子，其具有腫瘤類型特異性［6-7］。研究表明lncRNA參與調節(jié)生物體內多種生物學過程，與人類疾病發(fā)生發(fā)展息息相關［8-9］。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明多種lncRNA 可能成為TNBC 發(fā)生發(fā)展過程中關鍵的治療靶點與預后生物標記物［10-12］。SPINT1-AS1 又名絲氨酸肽酶抑制劑Kunitz 1 型反義RNA 1，是位于15q15.1 染色體上，長度為632nt的lncRNA。目前對其研究較少，僅在宮頸癌、結直腸癌中報道SPINT1-AS1 高表達與不良預后有關［13-14］。但在食管鱗癌、腎母細胞癌中SPINT1-AS1 高表達與良好預后有關［15-16］。并且僅有1 篇文章報道SPINT1-AS1 在乳腺癌中促進其增殖轉移［17］，該文章并沒有對乳腺癌特定分子亞型進行闡述。TNBC 作為預后最差的乳腺癌亞型仍缺乏有效的治療靶點，因此本研究擬探索lncRNA 是否可以作為TNBC 的治療靶點。鑒于本課題組在前期的TNBC 細胞測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 在經(jīng)典的抑癌分子miR-200c 過表達組的水平顯著高于空載對照組，由此筆者猜測SPINT1-AS1 可能也具有抑癌作用。因此，本研究擬在TNBC 中探索SPINT1-AS1 的功能作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)MCF-10A、MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-468 細胞均購自中國科學院細胞庫，MCF-10A 使用MCF-10A 完全培養(yǎng)基（賽庫生物公司）培養(yǎng)，其余細胞株使用含有10%FBS 的1640（Gibco 公司）培養(yǎng)，均在37 ℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內生長。

1.2 qRT-PCR 實驗使用Trizol 裂解，氯仿提取，氯丙醇沉淀，含DEPC 水的75%酒精洗滌總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，進行PCR 擴增。最后使用2-ΔΔCt法計算SPINT1-AS1 的表達量。

1.3 熒光原位雜交實驗將MDA-MB-231與BT549細胞接種至放有細胞爬片的24 孔板中，待細胞長至80%進行實驗。按照熒光原位雜交試劑盒（吉瑪公司）說明書進行，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后PBS 清洗。0.1%Triton X-100 打孔，PBS 清洗。SPINT1-AS1 探針加入雜交緩沖液中，混勻，73 ℃變性5 min，變性結束37 ℃孵育細胞過夜。12 h 后PBS清洗，使用DAPI染細胞核，室溫15 min后清洗。最后用抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡拍攝。

1.4 包裝shSPINT1-AS1 病毒shSPINT1-AS1#1與shSPINT1-AS1#2 質粒由擎科生物公司合成。病毒包裝質粒以及包膜蛋白質粒由中山大學附屬第一醫(yī)院生命科學實驗室惠贈。將293T 細胞加入預先用多聚賴氨酸包被的10 cm 皿中。待細胞長至80%使用PEI 試劑轉染，按照包裝質粒：包膜蛋白質粒：目的基因=4∶3∶1 的比例把3 者混合。取500 μL opti-MEM 稀釋混合質粒。將500 μL opti-MEM 稀釋60 μg 的PEI。隨后把PEI 稀釋液加入混合質粒稀釋液中，混勻靜置15 min。隨后將混合液緩緩加入293T 細胞。18 h 使用完全培養(yǎng)基取代含混合物的培養(yǎng)基，48 h 收集病毒液。收集的病毒液過濾之后可用于轉染細胞。

1.5 慢病毒轉染細胞實驗過表達SPINT1-AS1病毒由上海和元公司合成，shSPINT1-AS1#1 與shSPINT1-AS1#2 病毒自行包裝。MDA-MB-231 細胞鋪至24 孔板中，待細胞長至50%時開始轉染。分別使用500 μL opti-MEM 稀釋10 μL 對照組以及實驗組病毒液，將含1 μL/mL polybrene 的opti-MEM分別添加500 μL 至已混有病毒的對照與實驗管中，混勻靜置20 min。靜置結束將混合液置換原來的培養(yǎng)基。24 h 時使用完全培養(yǎng)基替換混合液，隨后使用嘌呤與G418 篩選得到穩(wěn)定過表達與干擾SPINT1-AS1 的細胞株。

1.6 平板克隆形成實驗將穩(wěn)轉株消化成單細胞懸液，接種于6 孔板中。細胞接種后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 周左右終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基后PBS 清洗，甲醇固定15 min后PBS清洗，結晶紫染色30 min，棄結晶紫，流水沖洗染料。最后用照相機拍攝圖片。使用image J計數(shù)，GraphPad prim7.0繪制計量圖。

1.7 CCK-8 檢測增殖活性按日本同仁公司的CCK-8 試劑盒說明書進行實驗，消化細胞接種于96孔板。分別在6、24、48、72、96 h時加入CCK-8 溶液，孵育1.5 h 后在酶標儀上450 nm 處檢測OD值。最后用GraphPad Prism 7.0 繪制折線圖。

1.8 Annexin V-APC/7-AAD流式細胞術測凋亡按照聯(lián)科生物凋亡試劑盒對細胞進行染色、孵育、過濾細胞團塊處理，隨后使用流式細胞儀檢測。最后使用Flow jo 軟件分析流式凋亡數(shù)據(jù)，Graph-Pad prim7.0 繪制凋亡計量圖。

1.9 統(tǒng)計學方法使用GraphPad Prism 7.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；配對樣本比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SPINT1-AS1 在正常乳腺上皮細胞及3 種TNBC 細胞中的表達為了研究SPINT1-AS1 在乳腺癌中的作用，本實驗首先比較其在正常乳腺上皮細胞以及TNBC 細胞中的表達情況。結果顯示，與正常乳腺上皮細胞MCF-10A 相比，在TNBC 細胞系MDA-MB-231、BT549 和MDA-MB-468 的SPINT1-AS1 的表達量均明顯降低（MDA-MB-468：t= 134.90，MDA-MB-231：t= 2 171.00，BT549：t=18 938.00，P＜0.000 1，圖1）。結果提示，SPINT1-AS1 可能在抑制TNBC 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

圖1 qRT-PCR 檢測SPINT1-AS1 在細胞株間的表達Fig.1 qRT-PCR detects the expression of SPINT1-AS1 in various cell lines

2.2 SPINT1-AS1 在TNBC 細胞株的定位既往研究顯示，lncRNA 的功能與其表達位置存在相關性。為了研究lncRNA 的可能機制，本課題首先檢測了SPINT1-AS1 的細胞定位。見圖2，使用共聚焦顯微鏡探索SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 以及BT549 細胞中的定位，發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 主要表達于細胞質。說明SPINT1-AS1 作為一個lncRNA，主要是以轉錄后調控方式作用于細胞，具體調控機制有待進一步研究。

圖2 SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 與BT549 細胞株的定位Fig.2 The localization of SPINT1-AS1 in MDA-MB-231 and BT549 cell lines

2.3 SPINT1-AS1 對TNBC 細胞增殖活性的影響為了研究SPINT1-AS1 對乳腺癌細胞株的影響，本實驗首先檢測SPINT1-AS1 不同表達水平細胞株之間的增殖能力差異。在MDA-MB-231 與BT549 細胞中過表達SPINT1-AS1，能顯著降低細胞克隆形成能力（MDA-MB-231：t= 64.00，BT549：t= 10.74，P＜0.01，圖3A）。在MDA-MB-231 細胞敲減SPINT1-AS1 后，與對照組相比，實驗組的克隆形成能力明顯增強（shSPINT1-AS1#1：t= 11.43，shSPINT1-AS1#2：t= 10.01，P＜0.01，圖3B）。進一步使用CCK-8 檢測SPINT1-AS1 對TNBC 增殖活性的影響。在MDA-MB-231 與BT549 細胞過表達SPINT1-AS1，能顯著降低細胞增殖能力（MDA-MB-231：96 h，t= 3.63，BT549：96 h，t= 4.30，P＜0.05，圖3C）。在MDA-MB-231 細胞干擾SPINT1-AS1 后，與對照組相比，增殖能力明顯增強（shSPINT1-AS1#1：t= 3.28，shSPINT1-AS1#2：t= 4.29，P＜0.05，圖3D）?？傊?，上述結果提示SPINT1-AS1 抑制TNBC細胞增殖。

圖3 過表達與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細胞株增殖的影響Fig.3 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the proliferation of TNBC cell lines

2.4 SPINT1-AS1 對TNBC 細胞凋亡的影響使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，當在TNBC 細胞系中過表達SPINT1-AS1 時，實驗組細胞的總凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）高于對照組，在BT549細胞中表現(xiàn)尤為明顯（MDA-MB-231：t= 5.24，BT549：t= 10.19，P＜0.05，圖4A）。然而，當敲低SPINT1-AS1 時，實驗組的總凋亡率低于對照組（shSPINT1-AS1#1：t= 6.28，shSPINT1-AS1#2：t=9.70，P＜0.05，圖4B）。上述結果提示SPINT1-AS1能促進TNBC 凋亡。

圖4 過表達與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細胞株凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the apoptosis of TNBC cell lines

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥、也是導致死亡的重要原因之一［18-19］。與非TNBC 相比，TNBC具有高度異質性和更強侵襲性，因為其不表達雌激素受體、孕激素受體、Her-2 等標志物，所以目前缺乏靶向治療TNBC 的方法［20］。因此，探究針對TNBC 的新治療靶點尤為重要。既往研究顯示，lncRNA 可以參與調控TNBC 細胞增殖、凋亡、轉移等病理生理過程［21］。因此lncRNA 成為治療TNBC的潛在靶標。本實驗研究了lncRNA SPINT1-AS1在TNBC 中的作用，結果顯示SPINT1-AS1 能抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡。

SPINT1-AS1 是一種lncRNA。目前研究發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 在不同癌癥發(fā)揮不同的功能，研究證明［13］SPINT1-AS1 抑制miR-214 進而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號從而驅動宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，驗證SPINT1-AS1 水平升高與宮頸癌患者預后不良有關。LI 等［14］在結直腸癌中發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1在癌組織的表達明顯高于癌旁組織，且發(fā)現(xiàn)高SPNT1-AS1 表達患者更易發(fā)生遠處轉移以及無復發(fā)生存期顯著縮短。然而，在食管鱗癌中SPINT1-AS1 的表達與癌旁組織相比明顯下調，并且通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 表達高的患者總體生存期更長［15］。同樣在一項透明細胞腎母細胞癌的研究中作者從數(shù)據(jù)庫篩選出9 個差異表達lncRNA，SPINT1-AS1 就是其中之一，通過LASSO運算、COX 回歸與生存分析得出SPINT1-AS1 表達高的患者預后更好的結論［16］。因此，在食管鱗癌、腎母細胞癌中高表達的SPINT1-AS1 與預后良好有關。不僅如此，高水平的SPINT1-AS1 可能使胃癌細胞NCL-N87 與乳腺癌細胞MCF-7 對拉帕替尼治療更敏感［22］。上述截然不同的研究結果證明SPINT1-AS1 所發(fā)揮功能是具有癌癥特異性的。在乳腺癌中，雖然ZHOU 等［17］已發(fā)表的研究中表明SPINT1-AS1 具有促進乳腺癌細胞增殖、遷移的作用。但本實驗通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在乳腺正常細胞中SPINT1-AS1 的表達水平高于TNBC 細胞；進一步通過轉染病毒建立過表達與敲低SPINT1-AS1 穩(wěn)轉株，當SPINT1-AS1 水平增加時，TNBC 細胞增殖能力顯著下降，凋亡顯著增加。當敲低SPINT1-AS1 時作用相反。總之，本研究通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 可以顯著抑制TNBC 細胞的增殖并促進其凋亡。雖然本研究的結論與周等人的部分研究結論相反，但這可能與兩個研究采用不同的SPINT1-AS1 轉錄本有關。本研究是針對SPINT1-AS1 的第2 個轉錄本NR_146467.1 進行研究，而周的研究并未明確指出使用具體的轉錄本，這證明SPINT1-AS1 不僅具有腫瘤特異性，而且還可能具有轉錄本特異性。作為調控基因轉錄的lncRNA，SPINT1-AS1 可能通過不同的下游靶點來發(fā)揮不同的生物學效應。因此，SPINT1-AS1 在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中的作用仍需要全方位、多維度、多組學的探索。已有許多研究報道［12］lncRNA在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如lncRNA MIR503HG 抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡，作者從全方位、多維度，多組學驗證了MIR503HG通過miR-224-5p/HOXA9 軸抑制細胞增殖并促進TNBC 細胞凋亡。與本研究相同的是作者同樣使用CCK-8、克隆形成、流式細胞術檢測細胞增殖與凋亡，但作者不局限于此，不僅驗證了MIR503HG在體內同樣發(fā)揮抑癌功能，而且進一步通過生信分析、雙熒光素酶報告基因實驗等探索了lncRNA的下游機制，這是本實驗所缺少的，有待本課題組進一步完善?？傊狙芯拷Y果證明了SPINT1-AS1 能夠抑制TNBC 細胞的增殖并促進其凋亡。并且本研究確認了SPINT1-AS1 主要表達于TNBC細胞的細胞質，極大可能是通過轉錄后途徑參與細胞發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本實驗證實了SPINT1-AS1 抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡。當然，本研究還存在一些不足。首先本研究缺乏體內實驗來驗證SPINT1-AS1 對腫瘤生長、凋亡的作用，其次我們對SPINT1-AS1 在TNBC 細胞的抑癌作用的具體作用機制仍未闡明，我們初步的機制研究結果提示，SPINT1-AS1 主要定位于細胞質，極大可能是通過轉錄后途徑參與細胞發(fā)生發(fā)展。盡管仍需要通過測序或生信分析等方法進一步完善對SPINT1-AS1下游機制的探索，但是這樣的結果已經(jīng)給出了重要的提示，SPINT1-AS1 可能成為治療TNBC 的一個新靶點，這為臨床治療TNBC 提供新方向。因此在今后的研究中，將繼續(xù)深入探索SPINT1-AS1 在TNBC 的作用機制。