糧食及其制品中真菌毒素檢測(cè)技術(shù)與風(fēng)險(xiǎn)法分析

⊙ 文 邢榮花 封琳 劉勝男 趙芳 華向美 張淑霞（通信作者） 鄭州海關(guān)技術(shù)中心

糧食是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，是一個(gè)民族發(fā)展的根本，而真菌毒素在全球范圍內(nèi)廣泛存在，嚴(yán)重危害人類健康和糧食安全。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織調(diào)查，全球每年約有25%的糧食會(huì)受到真菌毒素的污染，特別是小麥、花生、玉米、大米等主要的糧食作物。長(zhǎng)期食用被污染的糧食會(huì)嚴(yán)重危害人體健康，在當(dāng)前全球糧食供應(yīng)短缺的背景下，這無(wú)疑使世界糧食安全狀況更加惡化。因此，對(duì)糧食及其制品中的真菌毒素尤其是那些具有致癌性、致畸性和致突變性的高毒性物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，是糧食安全管理部門的當(dāng)務(wù)之急。

當(dāng)前，對(duì)真菌毒素的監(jiān)測(cè)、預(yù)警與處理技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)際關(guān)注的熱點(diǎn)，通過(guò)對(duì)糧食及其制品中真菌毒素的監(jiān)測(cè)，預(yù)警掌握污染的發(fā)展動(dòng)態(tài)，并對(duì)受污染的糧食及其制品進(jìn)行科學(xué)地處置。本文以糧食及其制品食品中真菌毒素檢測(cè)技術(shù)為研究重點(diǎn)，分析了不同檢測(cè)技術(shù)各自的優(yōu)缺點(diǎn)，并簡(jiǎn)要介紹了相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法，以期更好地保障糧食安全和人民健康。

一、糧食及其制品中真菌毒素的主要種類

在糧食生產(chǎn)的季節(jié)，氣候條件、病蟲害、干燥率、機(jī)械損傷、水分、溫度等環(huán)境因子都是造成真菌污染的主要外在原因。近年來(lái)，我國(guó)糧食及其制品中的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯族、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和雜色曲霉毒素，它們具有較好的穩(wěn)定性、較低的溶解性、較高的熔點(diǎn)和沸點(diǎn)，常規(guī)的處理很難將其消解，所以它們會(huì)在食品生產(chǎn)過(guò)程中累積并聚集起來(lái)，從而對(duì)人體和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的威脅。

二、樣本采集及制備

在糧食及其制品食品中真菌毒素的檢測(cè)工作中，由于所檢測(cè)的毒性組分樣本數(shù)量龐大、基質(zhì)種類繁多、含量低、分布不均勻，在某一區(qū)域開展污染物監(jiān)控與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究時(shí)，常會(huì)遇到極大的困難。因此，必須建立一個(gè)科學(xué)的采樣方案，確保隨機(jī)、均勻、有代表性地進(jìn)行樣本采集和制備，這是取得客觀精確的試驗(yàn)結(jié)果的首要步驟。

從現(xiàn)有的檢測(cè)工作來(lái)看，比較復(fù)雜的部分是真菌毒素抽樣的分布，很多國(guó)家采取隨機(jī)和統(tǒng)一的方法來(lái)計(jì)算抽樣樣本的數(shù)量。我國(guó)頒布了《糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法》，但卻沒有規(guī)定樣品的最小重量，在糧食和油料的雜質(zhì)分析中，樣本采集應(yīng)該由樣品的種類、批次的重量、雜質(zhì)的類型等決定，最終采集樣本的重量應(yīng)為1.0-10kg。

樣品制備需要進(jìn)行混合樣品的分離、粉碎、混合、還原，以得到均勻的樣品，從而能夠反映樣品的整體成分、質(zhì)量。目前，一般采用機(jī)械混合（四分法和分樣器法）、粉碎、篩分、研磨和攪拌等方法來(lái)制備糧食及加工制品的樣本。

三、常用的檢測(cè)方法

近幾年，隨著人們對(duì)真菌毒素的研究和重視，已經(jīng)出現(xiàn)了很多檢測(cè)方法，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化和完善，新技術(shù)手段亦不斷得到研究、應(yīng)用和推廣，比如化學(xué)分析法、免疫分析法、儀器分析法等。

薄層色譜法（TLC）是最早、最經(jīng)典的一種化學(xué)分析技術(shù)，在真菌毒素的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，主要是通過(guò)提取、濃縮、薄層分離得到真菌毒素樣品，并對(duì)其進(jìn)行定性、半定量和定量研究。不過(guò)，該方法具有操作繁瑣、靈敏度低、重復(fù)性差、對(duì)真菌毒素的常規(guī)檢測(cè)能力差等缺陷，在真菌毒素的檢測(cè)中存在一定的局限性。

高效薄層色譜法和薄層掃描儀的問(wèn)世，使得TLC的分離、靈敏度、重復(fù)性得到了一定的提高。張鵬等采用高效薄層層析技術(shù)，對(duì)花生中的黃曲霉毒素B、B、G、G進(jìn)行了分析。具體來(lái)說(shuō)，采用100mL的乙腈/水混合物（9+1、V/V）混合提取，在MFC柱中進(jìn)行純化，以丙酮/氯仿（9+1、V/V）高效TLC進(jìn)行分離，并用薄層掃描法對(duì)其進(jìn)行定量。最終得到的檢測(cè)結(jié)果是，黃曲霉毒素B為0.50μg/kg、B為0.43μg/kg、G為0.39μg/kg、G為0.31μg/kg，檢出限均在0.50μg/kg以下，回收率為86.5%-99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.67%-10.21%。

現(xiàn)有的高效薄層色譜技術(shù)主要有加壓薄層色譜（OPLC）、膠束薄層色譜（M-TLC）、棒狀薄層色譜（TLC-FID）、二維薄層（2DTLC）、離心薄層色譜（CTLC）、包合薄層色譜（ICC）等。與其它分析技術(shù)相結(jié)合，在醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、食品分析、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近幾年，在糧食及糧食制品中，利用儀器及TLC技術(shù)進(jìn)行真菌毒素的檢測(cè)還比較少見，有待于進(jìn)一步的深入研究和開發(fā)。

免疫分析法以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，可以進(jìn)行定量、定性檢測(cè)。20世紀(jì)80年代，Morris等人首先采用免疫學(xué)方法，第一次檢測(cè)了雜色曲霉素（ST）。此后，由于靈敏度高、特異性高、快速、低成本等優(yōu)勢(shì)，免疫分析法吸引了許多科學(xué)家的關(guān)注。目前，常用的免疫檢測(cè)技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）、膠體金免疫層析法、熒光免疫法、放射免疫法等。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）是一種比較典型的免疫分析法。在免疫檢測(cè)中，即使相同的項(xiàng)目，也常常有不同的反應(yīng)模式，其中，夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法可用于檢測(cè)抗原，也可用于檢測(cè)抗體，而間接法、捕獲法僅可用于檢測(cè)抗體。由于檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果可以通過(guò)儀器檢測(cè)來(lái)證實(shí)，所以得到了大規(guī)模的推廣應(yīng)用。近年來(lái)，隨著抗體制備技術(shù)的發(fā)展，多克隆抗體、單克隆抗體等技術(shù)也得到了發(fā)展，在敏感性、特異性等方面有著明顯的優(yōu)越性。

膠體金免疫層析法是利用磁性粒子等來(lái)替代已標(biāo)記酶，用單克隆抗體對(duì)樣本進(jìn)行純化，并將其與熒光技術(shù)結(jié)合起來(lái)。在檢測(cè)過(guò)程中，樣品和標(biāo)記的探頭與層析包裝的抗原或抗體發(fā)生特異反應(yīng)，從而得到一種能用肉眼進(jìn)行定性檢測(cè)或用信號(hào)收集器進(jìn)行定量檢測(cè)分析的信號(hào)波段。膠體金免疫層析技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，抗霉菌毒素的抗體主要有高特異和廣譜兩種，可以滿足一次或多次的檢測(cè)需求。目前，新型的前處理試劑、受體技術(shù)、奈米抗體等技術(shù)已經(jīng)廣泛用于真菌毒素的檢測(cè)，利用膠體金標(biāo)記進(jìn)行多重檢測(cè)則是需要重點(diǎn)關(guān)注的一種快速檢測(cè)方法。

熒光免疫法、放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法分別使用熒光物質(zhì)、同位素、化學(xué)發(fā)光劑，將免疫特異性與光譜敏感性相結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果比較全面。近年來(lái)，液相芯片技術(shù)不斷發(fā)展，流式檢測(cè)運(yùn)用也比較廣泛，其與芯片技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，使得流式檢測(cè)平臺(tái)得到了極大的擴(kuò)展。該方法適合于對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，能夠在少量的樣本中同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)體進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)的免疫檢測(cè)技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于樣品量小、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)范圍廣、重復(fù)性好、產(chǎn)量高、自動(dòng)化水平高。

真菌毒素?zé)o損檢測(cè)法是一種無(wú)損的新型檢測(cè)方法，可以在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，根據(jù)樣品的光學(xué)、電學(xué)和聲波性能對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行精確、快速的測(cè)定。研究顯示，該方法雖然在檢測(cè)糧食中的真菌毒素污染方面有了一定的進(jìn)展，但是諸如近紅外光譜法、高光譜成像法、電子鼻等無(wú)損檢測(cè)技術(shù)還處在起步階段，目前多用于定性的篩選，而對(duì)數(shù)量的測(cè)定很少，使用范圍有限。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷發(fā)展，基于色譜法的微生物分析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中得到了快速的發(fā)展。現(xiàn)代色譜技術(shù)具有高效的分離性能，克服了傳統(tǒng)方法的選擇性低、干擾大等弊端，還可以根據(jù)被測(cè)組分的理化性質(zhì)選擇不同的檢測(cè)器，抗干擾能力更強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，整體工作質(zhì)量更高。特別是質(zhì)譜儀和高分辨質(zhì)譜儀，不但靈敏度高，對(duì)分子結(jié)構(gòu)的確認(rèn)也提供了大量的信息，而且具有快速、高效的特點(diǎn)，因此可以把色譜技術(shù)與超高效液相色譜技術(shù)結(jié)合使用，綜合它們的靈敏度、確認(rèn)性、通用性等特點(diǎn)。

有研究人員對(duì)糧食及加工制品中的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在4種常用的糧食基質(zhì)（小麥、玉米、大米和大麥）中，16種真菌毒素的回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，可以滿足日常監(jiān)測(cè)工作的需要。部分研究人員采用簡(jiǎn)便、快捷的樣品制備方法，對(duì)16種糧食制品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，真菌毒素的檢出率為85.3%-114%，相關(guān)系數(shù)大于0.999?？傊瑑x器分析法具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，能夠?qū)Σ煌N類的毒素進(jìn)行檢測(cè)與分析，在糧食及加工制品中的真菌毒素污染檢測(cè)方面具有極大的價(jià)值。

四、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)

如今常用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)是點(diǎn)估算法、簡(jiǎn)單分布法、概率評(píng)估法、累計(jì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估法等，這些技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)。

點(diǎn)估算法是近年發(fā)展起來(lái)的一種食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法，將食品的消費(fèi)量乘以食品中的殘留物總量，得出累計(jì)的曝光量。2020年，很多人采用點(diǎn)估算法對(duì)嘔吐毒素的危害進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷物、方便食品的RAS95數(shù)值不符合標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明它們存在著與嘔吐毒素的接觸。點(diǎn)估算法可以利用數(shù)據(jù)表或數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行模型化，通常僅需測(cè)量數(shù)值的上四分位和下四分位，但是在評(píng)價(jià)食物中的化學(xué)污染物時(shí)，所能得到的信息相對(duì)較少且比較保守。

簡(jiǎn)單分布法是從食品攝入量和化學(xué)污染水平中估算化學(xué)污染暴露量，優(yōu)點(diǎn)是能夠確定化學(xué)品攝入量，且比點(diǎn)估算方法更實(shí)際，因?yàn)辄c(diǎn)估算法在估算暴露危險(xiǎn)時(shí)沒有考慮到濃度的改變。

概率評(píng)估法以概率估算為基礎(chǔ)，相對(duì)于單純的點(diǎn)估算或者簡(jiǎn)單分布法，其可以估算出更多的潛在人口，并且能夠描述食物中化學(xué)污染的危險(xiǎn)分布。

累計(jì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估法的應(yīng)用比較廣泛，包括離點(diǎn)指數(shù)法、危險(xiǎn)指數(shù)法。

食品安全指數(shù)法是將殘留檢測(cè)與食物接觸監(jiān)測(cè)相結(jié)合的一種新方法，綜合了受調(diào)查者的飲食習(xí)慣，并結(jié)合不同食物、化學(xué)物質(zhì)的殘留，檢測(cè)結(jié)果的數(shù)值越低，說(shuō)明食品越安全。這項(xiàng)技術(shù)較多地用于農(nóng)藥或者獸藥的殘留檢測(cè)中，用于真菌毒素危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的研究相對(duì)較少，但隨著相關(guān)規(guī)范的不斷完善，這項(xiàng)技術(shù)必然會(huì)不斷發(fā)展，并在糧食及其制品中真菌毒素危害程度的評(píng)價(jià)中彰顯自身的價(jià)值。

五、結(jié)束語(yǔ)

總而言之，食品安全大于天，尤其是對(duì)于中國(guó)這個(gè)人口大國(guó)來(lái)說(shuō)，保證糧食安全就是保證國(guó)家安全的重要基石。要特別重視糧食及其制品中的真菌毒素污染檢測(cè)，建立起相應(yīng)的檢測(cè)體系，做好相關(guān)的檢測(cè)工作，并重視風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。糧食及其制品中的真菌毒素污染分布極其不均、種類繁多，雖然含量水平低，但健康危害大，未來(lái)需要進(jìn)一步探索相關(guān)的檢測(cè)方法，應(yīng)用更多的新技術(shù)，制定科學(xué)的樣本采集和制備方法，并進(jìn)一步完善糧食及其制品中的污染物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系。