lncRNA XIST通過(guò)miR-375-Notch1軸調(diào)控急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖、侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

陸小琴 雷嬌嬌 劉雨欣 趙華清

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)主要由骨髓和外周血中的T淋巴細(xì)胞異常增生所致[1]，好發(fā)于兒童，病情進(jìn)展迅速，發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的RNA，參與機(jī)體細(xì)胞正常生理過(guò)程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。lncRNA-X失活特異性轉(zhuǎn)錄本(lncRNA-XIST)在喉鱗狀細(xì)胞癌、骨肉瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等疾病中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]，但lncRNA-XIST在T-ALL中作用的研究鮮有報(bào)道。

miR-375是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，表達(dá)水平與癌癥患者生存率相關(guān)[4]。Notch信號(hào)激活與腫瘤有密切的聯(lián)系，Notch配體-受體結(jié)合或Notch基因突變可激活Notch信號(hào)[5]。Notch1與T-ALL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，通過(guò)調(diào)控Notch1的表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]。生物信息分析顯示miR-375是lncRNA-XIST的潛在靶點(diǎn)，miR-375與Notch1可能存在結(jié)合位點(diǎn)?；诖耍覀兺茰y(cè)lncRNA-XIST可能通過(guò)miR-375-Notch1軸調(diào)控T-ALL細(xì)胞增殖與侵襲。因此，本研究探討lncRNA XIST通過(guò)miR-375-Notch1軸調(diào)控對(duì)T-ALL細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2018年6月—2021年3月于重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院確診的T-ALL患者57例為觀察對(duì)象(T-ALL組)，其中男35例，女22例，年齡8～35歲，平均(23.32±7.36)歲，患者均依據(jù)世界衛(wèi)生組織修訂的急性淋巴細(xì)胞白血病的分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[7]。另選55例健康體檢者為對(duì)照組，其中男34例，女21例，年齡9～34歲，平均(23.83±6.97)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月無(wú)感染；(2)近1個(gè)月無(wú)出血；(3)近1個(gè)月未服用免疫抑制劑。兩組性別和年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意(倫理編號(hào)：LL-2022-02)，所有納入對(duì)象入組后，均詳細(xì)告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒀芯啃再|(zhì)，并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和材料

人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞細(xì)胞株(CCRF-CEM)(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)GE公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；si-lncRNA XIST及其各自的陰性對(duì)照(GenePharma，中國(guó)上海)；TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；miR-375、Notch1擴(kuò)增引物(上海生工)；miR-375 mimic和miR-NC(廣州銳博生物公司)，Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑(碧云天)；β-action單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(碧云天生物科技有限公司)；Notch1、Hes1、ADAMl7多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

CCRF-CEM細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2飽和濕度。以CCRF-CEM細(xì)胞為對(duì)照(Control組)，在CCRF-CEM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST(si-lncRNA XIST組)、si-NC(si-NC組)，及miR-375 mimic(miR-375組)和miR-NC(miR-NC組)。具體方法如下：Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑(5 μL)與載體DNA混勻(5 μL)，室溫放置15 min，然后加至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，培養(yǎng)8 h后更換含血清的完全培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和定量實(shí)時(shí)PCR

取T-ALL組和對(duì)照組的外周靜脈血3～5 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA；收集CCRF-CEM細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20℃保存待測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：2.5 μL引物，2.5 μL的cDNA，12.5 μL的qPCRmix(含熒光染料)，dd水補(bǔ)足至25 μL；XIST PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；miR-375 PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；Notch1 PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)。GAPDH和U6作為參考基因，以2-△△Ct計(jì)算相對(duì)含量。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。T-ALL組和對(duì)照組均完成PCR檢測(cè)，細(xì)胞株進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各基因引物序列

1.5 免疫印跡

收集T-ALL組和對(duì)照組外周血，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞；收集完成轉(zhuǎn)染等處理的CCRF-CEM細(xì)胞。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉3 h，添加兔抗人ADAM-17、Notch1、Hes1及β-action一抗(1∶1 000)，在4℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗3次，添加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h。使用PierceTMECL顯影，分析條帶灰度值。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞增殖

分別收集轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)0、24、48、72和96 h的CCRF-CEM細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。每孔添加10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度OD值。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 侵襲實(shí)驗(yàn)

分別收集轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h的CCRF-CEM細(xì)胞，將完全培養(yǎng)液與基質(zhì)膠按照1∶9比例配制混合液，以100 μL/孔加入Transwell小室內(nèi)，每個(gè)小室接種5×104個(gè)細(xì)胞，下室用500 μL培養(yǎng)基(含10%FBS)做誘導(dǎo)趨化因子，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4 h后取出，棉簽擦拭小室內(nèi)膜，甲醛固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS沖洗3次，拍照，用顯微鏡計(jì)數(shù)3個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，制備成每1 mL含106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，1 000×g離心10 min，棄去上清，依次加入Binding Buffer 400 μL、Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.9 熒光素酶試驗(yàn)

擴(kuò)增XIST野生型(WT)或突變型(MUT)片段、Notch1 mRNA 3′UTR和突變3′UTR片段，連接到熒光素酶載體對(duì)照載體的下游[8]。將lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT與miR-NC(XIST-WT+miR-NC組，XIST-MUT+miR-NC組)或miR-375(XIST-WT+miR-375組，XIST-MUT+miR-375組)共轉(zhuǎn)染至CCRF-CEM細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表達(dá)

T-ALL組患者外周血單核細(xì)胞及CCRF-CEM細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA XIST、Notch1 mRNA水平明顯高于對(duì)照組，miR-375水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T-ALL組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Notch1蛋白高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

圖1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST后CCRF-CEM細(xì)胞生物學(xué)活性變化

對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST后細(xì)胞增殖率及細(xì)胞侵襲數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲影響

2.3 miR-375的靶標(biāo)分析

將lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT與miR-NC或miR-375共轉(zhuǎn)染至CCRF-CEM細(xì)胞中。結(jié)果顯示，lncRNA XIST-WT+miR-375的熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3)。表明miR-375是lncRNA XIST靶標(biāo)。

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-375對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲的影響

對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-375 mimic以上調(diào)細(xì)胞miR-375(圖4A)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染miR-375后48、72及96 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值低于對(duì)照組和miR-NC組(圖4A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-375后細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組和miR-NC組(圖4B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；轉(zhuǎn)染miR-375后細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)較對(duì)照組和miR-NC組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖4C)。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-375 mimic對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲影響

2.5 lncRNA XIST對(duì)miR-375、Notch1表達(dá)的調(diào)控

通過(guò)轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST，分析lncRNA XIST對(duì)下游miR-375、Notch1的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST后，miR-375升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Notch1 mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。此外，沉默lncRNA XIST后Notch1、ADAM-17及Hes1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B)。

圖5 沉默lncRNA XIST對(duì)miR-375、Notch1表達(dá)的影響

3 討論

lncRNA XIST是一種致癌lncRNA，在骨肉瘤、甲狀腺癌、食管癌等惡性腫瘤中高表達(dá)[9-11]，通過(guò)對(duì)多種腫瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲的影響，起到促癌作用，但在T-ALL患者中表達(dá)是否異常，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)T-ALL患者lncRNA XIST較健康對(duì)照人群顯著升高，并且T-ALL細(xì)胞株CCRF-CEMC細(xì)胞的lncRNA XIST水平也顯著升高，提示高水平lncRNA XIST可能在T-ALL發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)沉默RNA(si RNA)沉默lncRNA XIST，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖能力、侵襲能力明顯下降，而細(xì)胞凋亡明顯增加，表明lncRNA XIST參與T-ALL發(fā)病，起促癌作用。

lncRNA通常不直接作用于靶基因，而是通過(guò)另一種非編碼RNA(miRNA)靶向調(diào)控終端蛋白表達(dá)發(fā)揮功能。miR-375是lncRNA XIST下游靶點(diǎn)之一，通過(guò)miR-375可調(diào)控Wnt1、p53、TET1等信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究結(jié)果顯示，在T-ALL患者和T-ALL細(xì)胞株CCRF-CEMC中miR-375水平均顯著下降，與lncRNA XIST表達(dá)趨勢(shì)相反。為了證實(shí)在T-ALL中miR-375是否是lncRNA XIST的作用靶點(diǎn)，我們首先通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST與miR-375存在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-375是lncRNA XIST下游靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-375模擬物上調(diào)腫瘤細(xì)胞miR-375水平后，腫瘤細(xì)胞增殖能力、侵襲能力明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加。表明lncRNA XIST通過(guò)抑制miR-375參與T-ALL發(fā)生進(jìn)展。

Notch1信號(hào)通路在T-ALL的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。Notch1的異常與T細(xì)胞前體的分化與發(fā)展關(guān)系密切，Notch1是miR-375下游的調(diào)控靶點(diǎn)，該信號(hào)軸在口腔鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中得到證實(shí)[15]。本研究結(jié)果顯示，Notch1的mRNA、蛋白水平在T-ALL患者中都明顯升高，與Mansur等[16]的研究結(jié)果相符。在沉默lncRNA XIST后，miR-375水平明顯增加，而Notch1的mRNA和蛋白水平明顯下降，此外Notch1軸相關(guān)蛋白ADAM-17、Hes1水平也明顯下降，表明lncRNA XIST對(duì)下游miR-375、Notch1具有調(diào)控作用：lncRNA XIST可能通過(guò)下調(diào)miR-375水平以增加Notch1表達(dá)，從而促進(jìn)T-ALL腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，導(dǎo)致T-ALL發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST調(diào)控miR-375-Notch1信號(hào)軸，在T-ALL細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，為探索T-ALL潛在治療靶點(diǎn)提供了新思路。但是本研究存在樣本量小的不足，同時(shí)，lncRNA調(diào)控通路復(fù)雜，其可能存在有多個(gè)靶向miRNA。因此，后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并驗(yàn)證lncRNA XIST更多的調(diào)控途徑。