發(fā)酵黑洋蔥皂苷的提取及降血糖活性研究

王麗媛，周 寧，寧月寶

（內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010）

0 引言

洋蔥中富含皂苷類、黃酮類和多糖類等多種生物活性成分，以及人體所需的多種維生素、微量元素，具有預(yù)防癌癥、維護(hù)心血管健康、抗衰老、降血壓等作用[1-5]。皂苷具有降低血漿膽固醇、抗菌活性、抗腫瘤和抗癌的功效[6-8]。將新鮮的紫皮洋蔥放置在恒溫恒濕箱中自然發(fā)酵，發(fā)生美拉德反應(yīng)，洋蔥整體顏色變黑，刺激性氣味減少，活性提高，即可得到黑洋蔥[9-10]。發(fā)酵后的黑洋蔥與洋蔥相比，營養(yǎng)價(jià)值顯著提高，自由基清除能力得到增強(qiáng)，能夠有效地延緩衰老、緩解糖尿病、降低血糖活性[11-12]。

目前，關(guān)于黑洋蔥皂苷降血糖活性的報(bào)道較少，且市場上售賣的降血糖藥物多為人工合成，在一定程度上容易引起不良反應(yīng)。本文通過對(duì)高血糖大鼠灌胃黑洋蔥中提取的皂苷，觀察大鼠血糖值變化，并對(duì)從中提取出的皂苷進(jìn)行成分分析，檢測皂苷中含有的成分，對(duì)降血糖藥物的研發(fā)具有很大的意義。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

SD大鼠（30只，健康， 體重180～220 g，雄性），購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。紫皮洋蔥，購自包頭市昆都侖區(qū)友誼菜市場。

1.2 藥品及主要試劑

薯蕷皂苷標(biāo)品（成都麥德生科技有限公司）；四氧嘧啶（Sigma公司）；生理鹽水（吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司）；無水乙醇、香草醛、正丁醇（天津永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

DFT-200型手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；SHB型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；JA5003型分析天平、FA5003型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；601型超級(jí)恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；751型玻璃比色皿（晶科光學(xué)儀器有限公司）；GA-3型血糖儀、血糖試條（三諾生物傳感股份有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑洋蔥的發(fā)酵

將處理好的洋蔥放入恒溫恒濕箱內(nèi)，按照規(guī)定的條件（溫度68.0±1.0 ℃，相對(duì)濕度95.0%±1.0%）進(jìn)行自然發(fā)酵，在多種菌的作用下，發(fā)生美拉德反應(yīng)，發(fā)酵30 d即可得到黑洋蔥發(fā)酵品。

2.2 黑洋蔥皂苷的提取

采用乙醇回流提取法[13-17]，以75%乙醇為溶劑，提取溫度75 ℃，回流次數(shù)3次，每次1.5 h，料液比分別為 1：10，1：8，1：6。

用手提式高速萬能粉碎機(jī)將發(fā)酵好的黑洋蔥進(jìn)行粉碎，得到的粉末過100目篩，得到更細(xì)的粉末，以便試驗(yàn)使用。準(zhǔn)確稱量20 g黑洋蔥粉末于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL乙醇，置于75 ℃水浴鍋中回流提取1.5 h，提取3次，合并3次得到的提取液。將冷卻后的提取液用布氏漏斗過濾，除去其中懸浮的粉末。過濾后的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無醇味，得到濃縮液。將濃縮液加入少量的蒸餾水溶解，然后用等體積的石油醚萃取脫脂多次，至石油醚層近無色，取水層將其濃縮，減少體積以便下一步處理。將濃縮后的水溶液用水飽和的正丁醇萃取多次，至正丁醇層近無色。將得到的正丁醇層溶液置于電熱恒溫風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，蒸干正丁醇后即得到黑洋蔥粗皂苷制品。

2.2.1 水飽和正丁醇溶液的配制

將蒸餾水和正丁醇混合（體積比例1：1），混合液充分搖勻震蕩后，放置過夜。得到的混合液分層，上層為水飽和的正丁醇溶液，下層為正丁醇飽和的水溶液，試驗(yàn)取上層溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

皂苷的含量采用香草醛比色法測定，取薯蕷皂苷標(biāo)品加入甲醇，使之完全溶解，配制成0.1 mg/mL的溶液，分別精密吸取配制好的薯蕷皂苷溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 至具塞試管于水浴鍋中揮發(fā)溶劑。揮發(fā)溶劑后分別加入5%的香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL。波長545 nm處測其吸光度，以薯蕷皂苷的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制薯蕷皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.018 2x+0.028 3，R2=0.996 8。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測條件

色譜柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He，0.8 mL/min；升溫程序：柱初始溫度為30 ℃，保持 2 min，以 4 ℃ /min 速率升溫至 220 ℃；進(jìn)樣口的溫度在250 ℃；分流比是4：1；進(jìn)樣量是1 μL。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電能量子70 eV；電子倍增器電壓1 635 V；質(zhì)量掃描的范圍30～450 amu，離子源溫度230 ℃；傳輸線的溫度240 ℃；四極桿的溫度150 ℃。

2.4 高血糖大鼠模型的建立

2.4.1 動(dòng)物模型

采用化學(xué)誘導(dǎo)法建立2型糖尿病大鼠模型，四氧嘧啶產(chǎn)生超氧自由基而破壞β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素合成減少，胰島素缺乏，誘發(fā)糖尿病。將大鼠隨機(jī)分組，選取對(duì)照組10只，試驗(yàn)組20只，對(duì)試驗(yàn)組一次性腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液建立2型糖尿病大鼠模型[18]，對(duì)照組注射等量的生理鹽水作空白對(duì)照，在注射前對(duì)大鼠禁食不禁水12 h。根據(jù)血糖值的不同將試驗(yàn)組大鼠分為中高血糖組與高血糖組。試驗(yàn)組與對(duì)照組每日灌胃200 mg/kg黑洋蔥皂苷溶液，持續(xù)4周，記錄灌胃期間大鼠的血糖變化。

2.4.2 試劑配制

精確稱取0.6 g四氧嘧啶溶于30 mL生理鹽水中，配置成2%的四氧嘧啶溶液放置于棕色瓶中。在稱取四氧嘧啶時(shí)避光，且配制好的溶液放在冰盒中，防止四氧嘧啶溶液失效。四氧嘧啶溶液采用現(xiàn)用現(xiàn)配的原則，注射量采用180 mg/kg。

2.4.3 血糖測定

在對(duì)試驗(yàn)組、對(duì)照組注射等量的四氧嘧啶溶液及生理鹽水72 h后，將大鼠禁食不禁水12 h，在尾部取血，使用血糖儀測定其血糖濃度。當(dāng)血糖濃度大于7.0 mmol/L時(shí)即為建模成功[19]。

2.4.4 皂苷溶液配制

通過參考文獻(xiàn)[13]，對(duì)每只大鼠采用200 mg/kg的黑洋蔥皂苷的灌胃量，根據(jù)每只大鼠體重的不同采用不同的灌胃量。將提取好的粗皂苷用蒸餾水溶解，配制粗皂苷溶液濃度為6 mg/mL，將配制好的粗皂苷溶液放置于4 ℃冰箱中保存，以便灌胃時(shí)使用。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 黑洋蔥中粗皂苷的提取率

在75 ℃對(duì)體積比為75%的不同料液比的黑洋蔥粗皂苷進(jìn)行提取，得到黑洋蔥粉中粗皂苷的質(zhì)量，并經(jīng)多次試驗(yàn)，得到粗皂苷的提取率如表1所示。

表1 粗皂苷提取率Tab.1 Yield of crude saponins

3.2 黑洋蔥中純?cè)碥蘸?/h3>

取一定量的粗皂苷，用甲醇溶解，定容到10 mL的容量瓶中，瓶中的溶液即為待測液；然后對(duì)照薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出粗皂苷中純?cè)碥盏暮?。?jīng)多次測量，吸光度如表2所示。

表2 粗皂苷中純?cè)碥蘸勘鞹ab.2 Contents of pure saponins in crude saponins

黑洋蔥中純?cè)碥盏奶崛÷视?jì)算如下式所示：

式中 N——黑洋蔥中純?cè)碥仗崛÷剩?；

W1——黑洋蔥中粗皂苷提取率，%；

W2——粗皂苷中純?cè)碥盏暮浚?。

經(jīng)計(jì)算，黑洋蔥中純?cè)碥盏奶崛÷蕿?.157%。

3.3 皂苷檢測結(jié)果

試驗(yàn)所用的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果見表3。

表3 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果Tab.3 Results of dioscin standard

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)提取出的黑洋蔥皂苷進(jìn)行檢測[20-21]，得出檢測結(jié)果見表4。

表4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測結(jié)果Tab.4 Results of GC-MS

3.4 高血糖大鼠模型的建立結(jié)果

在對(duì)大鼠注射完四氧嘧啶溶液后，根據(jù)其血糖濃度水平不同進(jìn)行分組。將血糖濃度在20～30 mmol/L定為中高血糖組，血糖濃度＞30 mmol/L定為高血糖組。試驗(yàn)組與對(duì)照組一同作為黑洋蔥皂苷降血糖研究對(duì)象。

3.5 黑洋蔥粗皂苷溶液灌胃結(jié)果

將建模成功的大鼠進(jìn)行分組，對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，經(jīng)過28 d的連續(xù)灌胃，測其血糖值，對(duì)比灌胃前后的平均值，得到灌胃前后平均血糖濃度變化，如表5所示。

表5 大鼠血糖濃度變化Tab.5 Changes of blood glucose concentration in rats

對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組灌胃前后血糖濃度值用SPSS19.0軟件分析，得出中高血糖組、高血糖組P＜0.01，對(duì)照組P＞0.05，說明黑洋蔥皂苷溶液可以顯著降低試驗(yàn)組大鼠血糖濃度，而對(duì)照組大鼠的血糖濃度下降不顯著，即黑洋蔥皂苷溶液對(duì)正常的大鼠血糖幾乎沒有影響。

4 結(jié)語

通過對(duì)大鼠腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液建立糖尿病大鼠模型，將成功建模的大鼠分為中高血糖組和高血糖組。在對(duì)試驗(yàn)組、對(duì)照組灌胃相同的皂苷溶液一段時(shí)間后，通過對(duì)比灌胃前后大鼠血糖濃度變化，發(fā)現(xiàn)高血糖組大鼠血糖下降74.22%，中高血糖組血糖下降68.27%，而對(duì)照組的大鼠血糖值下降1.13%，下降不顯著。得出黑洋蔥粗皂苷對(duì)糖尿病大鼠具有顯著的降血糖作用。

在發(fā)酵黑洋蔥時(shí)，為提高產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)選擇新鮮且完整的洋蔥進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中時(shí)刻關(guān)注洋蔥發(fā)酵情況，發(fā)酵完成后及時(shí)進(jìn)行烘干處理，防止腐爛。本文采用回流提取法提取黑洋蔥中的皂苷成分，提取率為0.157%。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)黑洋蔥粗皂苷進(jìn)行檢測，共檢出15種物質(zhì)，但引起血糖下降的具體物質(zhì)尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。