鹽酸阿霉素通過DRP1/FUNDC1信號通路調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭

夏 冉，朱國旗，高 兵，汪 恒，朱 夢，李凌基，王 祝，王 莖，戴小華

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.針炙推拿學(xué)院、3.新安醫(yī)學(xué)教育部實驗室，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

癌癥的發(fā)病率、住院率及死亡率逐年上升，全球估計13.1億人將于2030年死于癌癥[1]。鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)是一種非選擇性Ⅰ類強效蒽環(huán)類抗生素，具有廣譜抗腫瘤活性作用，但因其心臟毒性作用，使用過程中易造成不可逆的充血性心力衰竭，導(dǎo)致臨床使用受限[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，DOX是一種線粒體毒素，線粒體損傷是DOX誘導(dǎo)的心臟功能障礙和細胞死亡的核心[3-4]。線粒體依賴于動力蛋白家族GT Pases調(diào)節(jié)，正常情況下，線粒體通過融合產(chǎn)生能量；而在應(yīng)激條件下，線粒體通過分裂將受損的線粒體分離出來進行自噬清除[5]。因此，線粒體的融合與分裂對于維持心肌細胞穩(wěn)態(tài)和心臟健康至關(guān)重要。然而，過度的分裂會損害心肌細胞，導(dǎo)致心室重構(gòu)[6]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，阿霉素在復(fù)制大鼠模型時，心肌細胞凋亡及自噬水平均有所上升[7-8]。因此，我們猜測DOX可能通過線粒體動力學(xué)導(dǎo)致心肌細胞死亡引發(fā)心力衰竭。

臨床表明，心力衰竭的嚴(yán)重程度與抗癌治療過程中累積的DOX劑量相關(guān)[9]。為了避免實驗誤差，本研究采用DOX腹腔注射不同劑量構(gòu)建大鼠心衰模型[10]，通過超聲心動圖、B型腦鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)及心肌病理檢測判定心衰發(fā)展程度，并選出最優(yōu)劑量組。再聯(lián)用線粒體分裂抑制劑Mdivi-1，通過Western blot檢測大鼠相關(guān)動力學(xué)蛋白指標(biāo)及涉及的相關(guān)信號通路分子改變，探索DOX誘導(dǎo)心衰的發(fā)生機制，為臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料動物：SPF級SD ♂大鼠(200～250) g，84只，購于山東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥經(jīng)絡(luò)研究所大學(xué)動物房(清潔級)，所有實驗均根據(jù)實驗動物護理指南進行。本研究獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為AHUCM-rats-2020026。

1.2 藥品與試劑注射用鹽酸阿霉素(10 mg/支，山西普德藥業(yè)股份有限公司)，Mdivi-1(25 mg/支，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔多抗DRP1(ab184247，英國Abcam公司)；兔多抗OPA1(bs-11764R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，兔多抗FUNDC1(A16318，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；大鼠B型腦鈉肽(BNP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL底物液(武漢賽維爾生物有限公司)。

1.3 儀器電子天秤：梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；酶標(biāo)檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司)；電泳儀電源(北京六一儀器廠)；脫色搖床(武漢賽維爾生物科技有限公司)；磁力攪拌器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)印電泳儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；感光膠片(愛普生有限公司)，Philips SONOS 5500超聲儀(荷蘭Philips公司)。

2 方法

2.1 分組與干預(yù)實驗一：SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為Control組(n=12)、DOX 1組(n=12)、DOX 2組(n=12)、DOX 3組(n=12)。Control組等體積腹腔注射生理鹽水；DOX各組均采用DOX交替腹腔注射，將阿霉素與0.9% 氯化鈉溶液制備成注射液(1 mg·mL-1)，根據(jù)大鼠體質(zhì)量，DOX 1組以2 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到12 mg·kg-1；DOX 2組以2.5 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到15 mg·kg-1；DOX 3組以3 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到18 mg·kg-1[11]。實驗二：SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為Control組(n=12)、DOX 2組(n=12)、DOX 2+Mdivi-1組(n=12)，Control、DOX 2組實驗方法同前，DOX 2+Mdivi-1組在累計劑量達到15 mg·kg-1后，予以每日交替腹腔注射Mdivi-1(1 mg·kg-1)，干預(yù)3周。

2.2 超聲心動圖檢查實驗一結(jié)束后，以生理鹽水制備3%戊巴比妥鈉溶液，按30 mg·kg-1給予大鼠腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，將大鼠仰臥位固定于鼠架板，胸部脫毛處理并涂抹超聲偶合劑，采用Philips SONOS 5500超聲儀，探頭頻率為12 MHz進行超聲心動圖檢查。以M型超聲心動圖進行測量各組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractional shortening，LVFS)。

2.3 ELISA法檢測各組大鼠血清BNP含量超聲心動圖檢測后，將大鼠腹主動脈取血，經(jīng)離心后，取得血清學(xué)樣本。加適當(dāng)稀釋的待檢樣品100 μL于包被的反應(yīng)孔中，用封板膜封板后置37 ℃孵育，洗滌后于各孔中加入抗體100 μL，溫育洗滌后，在各孔加入酶結(jié)合物工作液100 μL，重復(fù)溫育洗滌，再于各孔加入TMB底物溶液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)20 min，待終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀上450 nm處，檢測出各孔OD值。

2.4 HE染色檢測各組大鼠心肌細胞病理變化腹主動脈取血后，大鼠開胸，剝離并取出心臟組織，固定于4%組織固定液中，切片。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min二甲苯Ⅱ 20 min無水乙醇Ⅰ 5 min無水乙醇Ⅱ 5 min 75%乙醇5 min，再將切片入蘇木素染液染5 min，入伊紅染液中染色5 min，脫水封片。隨后用顯微鏡鏡檢，并進行圖像采集分析。

2.5 WB法檢測各組大鼠心肌線粒體動力學(xué)及相關(guān)信號通路分子蛋白表達水平實驗二結(jié)束后，取各組大鼠心臟左心室部分組織，將組織用PBS洗滌后置于勻漿管中，勻漿后裂解組織，12 000×g離心10 min，收集上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。沸水水浴變性15 min后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，于脫色搖床上洗3次，將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫孵育30 min。將PVDF膜的蛋白加入ECL溶液充分反應(yīng)，1～2 min后曝光，將膠片掃描，photoshop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

3 結(jié)果

3.1 DOX大鼠一般情況變化實驗6周后，Control組大鼠體質(zhì)量增長正常，DOX各組大鼠精神狀態(tài)變差，食欲減退，毛發(fā)脫落，體質(zhì)量下降，活動緩慢，部分大鼠出現(xiàn)腹瀉。實驗后DOX各組體質(zhì)量與對照組相比，均有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且DOX 3組比DOX1組和DOX 2組體質(zhì)量下降更明顯，如Fig 1E所示。此外，DOX的累積劑量與大鼠的死亡率呈正相關(guān)，DOX 1組大鼠死亡率17%(n=10)，DOX 2組大鼠死亡率25%(n=9)，DOX 3組大鼠死亡率42%(n=7)，對照組無死亡。

3.2 DOX大鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能改變?yōu)榱嗽u估DOX大鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能變化，在實驗6周后，對大鼠進行超聲心動圖檢測。DOX各組大鼠與Control組相比，大鼠均出現(xiàn)左心室擴大，心功能降低(Fig 1A)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與DOX 1組相比，DOX 2組、DOX 3組LVIDd，LVIDs值升高，EF、FS值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與DOX 2組相比，DOX 3組EF、FS值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 1B、C)。我們進一步檢測了心衰定量標(biāo)志物BNP，結(jié)果表明，相比于Control組大鼠，DOX各組大鼠BNP均有所升高(Fig 1D,P<0.01)；與DOX 1組相比，DOX 2組、DOX 3組BNP值升高(Fig 1D,P<0.01)；與DOX 2組相比，DOX 3組BNP值升高(Fig 1D，P<0.01)。

3.3 DOX大鼠心肌病理變化為了明確大鼠心肌病理變化，取大鼠心臟組織進行HE染色。Control組大鼠心肌細胞排列有序，細胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，無細胞肥大、增生，無炎性浸潤；DOX各組大鼠心肌細胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則，間質(zhì)增生，心肌纖維染色不均，伴有肥大細胞和炎性細胞浸潤，且DOX 3組較DOX 1組、DOX 2組心肌細胞損傷更嚴(yán)重(Fig 2)。

3.4 DOX大鼠線粒體動力學(xué)及相關(guān)通路信號分子的變化 通過實驗一數(shù)據(jù)對比，選取了DOX 2組為最優(yōu)劑量。設(shè)立Control組、DOX 2組、DOX 2+Mdivi-1組，進一步檢測心肌組織內(nèi)心肌線粒體分裂蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)、線粒體融合蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)及相關(guān)信號通路蛋白(FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1)(Fig 3A)。與Control組相比，DOX 2組及DOX 2+Mdivi-1組FUNDC1信號通路相關(guān)的線粒體分裂蛋白DRP1表達增強，融合蛋白OPA1表達降低；與DOX 2組相比，DOX 2+Mdivi-1組FUNDC1、DRP1蛋白表達量降低，OPA1表達增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 3B)。4 討論

實驗的病理結(jié)果顯示，DOX具有明顯的心肌細胞損害作用，DOX各組大鼠表現(xiàn)為心功能障礙，且DOX導(dǎo)致的心衰程度與DOX累計劑量呈正相關(guān)，隨著DOX累計劑量的上升，大鼠的心衰發(fā)展及死亡率均有所上升。在進一步探討DOX心衰機制中發(fā)現(xiàn)，DOX導(dǎo)致大鼠心肌內(nèi)DRP1、FUNDC1蛋白表達量增加、OPA1蛋白表達降低。說明一定劑量的DOX誘導(dǎo)慢性心衰發(fā)生，其機制可能與DRP1/FUNDC1介導(dǎo)的心肌線粒體發(fā)生過度分裂、減少線粒體融合有關(guān)。

既往研究表明，大鼠在腹腔注射DOX累計劑量達到12 ～18 mg·kg-1時，可發(fā)生CHF[12]。在實驗一中發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射DOX累積劑量達到12 mg·kg-1時，超聲心動圖顯示大鼠射血分?jǐn)?shù)保留或下降，BNP含量上升；當(dāng)累積劑量越大時，大鼠精神狀態(tài)更差，體質(zhì)量降低明顯，部分伴有腹水發(fā)生，超聲心動圖顯示大鼠的LVIDd、LVIDs更高，LVEF、LVFS值更低。BNP是診斷心衰的重要標(biāo)志物，在左心室超負荷狀態(tài)下，BNP分泌增高，并隨著疾病的嚴(yán)重程度而遞增，對于評估心衰的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要價值。實驗結(jié)果證實，劑量的累積導(dǎo)致大鼠BNP進一步升高，心功能更差?？紤]到DOX 1組存在極少數(shù)射血分?jǐn)?shù)保留情況，DOX 2組死亡率小于DOX 3組，且DOX 2組同DOX 3組比較LVIDd與LVIDs差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，選取了DOX 2組作為最優(yōu)劑量進行實驗二。

Fig 1 Effect of DOX on cardiac structure,cardiac function and body weight of

Fig 2 The morphological changes of heart tissues in four groups(200×)

FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是位于線粒體外膜的蛋白質(zhì)，通過參與線粒體的融合及分裂，維持心臟功能，F(xiàn)UNDC1的缺失會導(dǎo)致心力衰竭[13]。在正常情況下，F(xiàn)UNDC1與位于線粒體內(nèi)膜(IMM)上的線粒體融合蛋白：視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)相互作用，為心肌細胞提供能量；而在應(yīng)激條件下，F(xiàn)UNDC1能夠促進線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)易位至線粒體外膜(OMM)進而誘導(dǎo)線粒體分裂[14]。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DOX誘導(dǎo)的大鼠發(fā)生心衰時，F(xiàn)UNDC1、DRP1蛋白表達量增強，而OPA1蛋白表達量下降。OPA1對線粒體嵴結(jié)構(gòu)的控制發(fā)揮重要作用，能夠阻止細胞色素C的釋放，減少細胞凋亡發(fā)生[15]。OPA1的降低表明DOX導(dǎo)致心肌線粒體受損，心肌線粒體融合減少，能量供應(yīng)降低，心肌細胞死亡風(fēng)險增加。DRP1是線粒體分裂的關(guān)鍵樞紐，主要位于細胞質(zhì)中[16]。在DOX誘發(fā)的大鼠心衰中，F(xiàn)UNDC1、DRP1蛋白表達量增強，表明DOX增強了線粒體的分裂，且兩蛋白趨勢相同提示DOX可能通過FUNDC1通路招募了DRP1蛋白。為了繼續(xù)驗證FUNDC1與DRP1蛋白的關(guān)聯(lián)性，我們使用了線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)。Mdivi-1作為Drp1的選擇性抑制劑，在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中具有保護作用[17]。結(jié)果表明，在聯(lián)用了Mdivi-1之后，DRP1、FUNDC1的蛋白均有所降低，OPA1蛋白表達增強。由此可見，DOX誘導(dǎo)的心衰可能與其通過DRP1/FUNDC1信號通路促進了線粒體過度分裂、減少了線粒體融合有關(guān)。但本實驗只對涉及的通路及機制做了初步探討，后續(xù)可通過基因敲除及檢測蛋白間相互作用，做進一步深入研究。

Fig 3 Effect of DOX on mitochondrial dynamics and

**P<0.01vsControl group;#P<0.05vsDOX 2 group;##P<0.01vsDOX 2 group