南寧地區(qū)遺傳代謝性肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的臨床特征及基因分析

龐智東 顏云盈 徐江燕 闕宇晨

嬰兒膽汁淤積癥(infantile cholestasis，ICH)是嬰兒期最常見的肝膽疾病，雖然目前國內(nèi)尚缺乏嬰兒膽汁淤積癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但是已成為中國兒童肝病的首位住院原因[1]。若嬰兒膽汁淤積癥持續(xù)不緩解，可加速肝細(xì)胞損傷，隨病程進(jìn)展而發(fā)展為肝纖維化和肝硬化，不但嚴(yán)重影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至危及患兒健康及生命[2]。嬰兒膽汁淤積癥的病因較多，并且部分肝內(nèi)膽汁淤積癥臨床表現(xiàn)不典型，常規(guī)檢查無特異性，臨床診斷困難。近年來隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用，其在新生兒遺傳性疾病的檢測(cè)或診斷以及部分常見病的輔助診斷方面應(yīng)用越來越廣泛。基因檢測(cè)的應(yīng)用使越來越多原因不明的嬰兒膽汁淤積癥得以確診，具有重要的臨床價(jià)值[3]。但是，目前國內(nèi)關(guān)于基因檢測(cè)診斷嬰兒膽汁淤積癥的研究報(bào)道有限。本文對(duì)南寧地區(qū)疑似遺傳代謝性肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的臨床特征及遺傳基因進(jìn)行分析，為該地區(qū)遺傳代謝性嬰兒膽汁淤積癥的診斷和治療提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)像

選取2016年1月至2020年12月在南寧市婦幼保健兒科接受治療的116例疑似遺傳代謝性肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒在南寧地區(qū)出生；②年齡≤1歲；③臨床表現(xiàn)符合美國兒科學(xué)會(huì)推薦的膽汁淤積癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，兼具膽汁淤積和肝病兩部分臨床征象；④均接受代謝性肝病相關(guān)基因檢測(cè)；⑤排除膽道閉鎖等器質(zhì)性病變；⑥家長(zhǎng)知情同意。以下患兒不參加本研究：①年齡≥1歲；②未接受代謝性肝病相關(guān)基因檢測(cè)；③存在膽道閉鎖等器質(zhì)性病變的患兒；④家長(zhǎng)知情但是不同意參與本研究。本研究得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

(一)臨床資料的收集 采用自制調(diào)查表收集每例膽汁淤積癥患兒的臨床資料，包括性別、發(fā)病年齡、就診年齡、體重、喂養(yǎng)方式、皮膚黃染時(shí)間、大便顏色、肝功能、腹部彩超(肝、脾、膽囊)。其中，肝功能包括血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(Albumin，Alb)、球蛋白(globulin，Glb)等指標(biāo)。

(二)基因檢測(cè) 抽取患兒外周血，采用血液全基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技公司)按照說明書操作提取基因組DNA，制備全基因組文庫并進(jìn)行質(zhì)控。應(yīng)用GenCap 液相捕獲目標(biāo)基因技術(shù)，捕獲代謝性肝病相關(guān)基因的編碼外顯子區(qū)域，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用Sanger進(jìn)行驗(yàn)證。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、患兒的臨床特征

116例患兒中男67例(57.76%)，女49例(42.24%)，發(fā)病年齡為(1.0±0.5)個(gè)月；就診年齡為(3.4±2.7)；體質(zhì)量為(6.14±1.57)kg。母乳喂養(yǎng)例55例(47.41%)，人工喂養(yǎng)26例(22.41%)和混合喂養(yǎng)35例(30.17%)；皮膚染黃時(shí)間1～30 d，其中<3 d 47例(40.52%)、3～15 d 34例(29.31%)，≥15 d 35例(30.17%)；116例患兒全部為黃疸；35例(30.17%)患兒出現(xiàn)白陶土色便。ALT(214.40±72.36)U/L，AST(341.25±95.49)U/L，γ-GGT(116.03±57.36)U/L，ALP(546.06±245.94)U/L，TBA(141.52±72.36)μmol/L，TBil(154.36±64.42)μmol/L，TP(54.35±7.64)g/L，Alb(37.02±5.82)g/L，Glb(16.59±4.21)g/L。肝臟彩超顯示35例(30.17%)肝臟基本正常，81例(69.83%)肝臟腫大，腫大(1.65±0.84)cm；脾臟彩超顯示76例(65.52%)脾臟基本正常，40例(34.48%)脾臟腫大，腫大(0.57±0.51)cm；膽囊彩超顯示41例(35.34%)患兒膽囊基本正常，75例(64.66%)膽囊異常(發(fā)育異?；蚴湛s欠佳)。

二、基因突變分析

有35例發(fā)生基因突變，其中SLC25A13 基因突變11例(31.43%)，JAG1 基因突變8例(22.86%)，ABCB11 基因突變7例(20.00%)，HSD3B7 基因突變5例(14.29%)，CFTR 基因和AKR1D1 基因突變各2例(5.71%)。基因突變患兒中有希特林蛋白缺乏癥11例(31.43%)，Alagille綜合征8例(22.86%)，進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型7例(20.00%)，先天性膽汁酸合成障礙1型4例(11.43%)先天性膽汁酸合成障礙2型3例(8.57%)，囊性纖維化2例(5.71%)。見表1。

三、基因突變和非基因突變患兒臨床資料比較

基因突變膽汁淤積癥患兒ALT水平較非基因突變膽汁淤積癥患兒顯著升高(P<0.05)，而兩組患兒的性別、發(fā)病年齡、就診年齡、體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、皮膚染黃時(shí)間、白陶土色便、AST、γ-GGT、ALP、TBA、TBil、TP、Alb、Glb、肝臟彩超情況、脾臟彩超情況和膽囊彩超情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 膽汁淤積癥患兒基因突變情況

表2 基因突變和非基因突變患兒臨床資料的比較

討 論

嬰兒膽汁淤積癥是指由各種原因?qū)е旅?xì)膽管膽汁形成、分泌和(或)排泄異常，在肝細(xì)胞和膽管內(nèi)膽汁淤積引起的肝臟疾病。嬰兒膽汁淤積癥兼具膽汁淤積和肝病兩部分臨床征象，膽汁淤積以膽紅素升高，皮膚、鞏膜黃染為主要表現(xiàn)，肝病以血清ALT和(或)AST水平增高等肝功能異常為主要表現(xiàn)。嬰兒膽汁淤積癥起始于膽汁酸淤積，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞增生和壞死，繼而發(fā)生膽管性肝纖維化和肝硬化，或肝功能衰竭而進(jìn)入肝病終末期[4]，是嬰兒期致死或致殘的重要原因之一。嬰兒膽汁淤積癥包括肝外膽汁淤積和肝內(nèi)膽汁淤積。肝內(nèi)膽汁淤積癥的病因復(fù)雜，有將近1/3的病因不明確，從而導(dǎo)致臨床預(yù)后差異顯著，早期診斷、早期治療可改善患兒預(yù)后[5-7]。高通量測(cè)序技術(shù)因其速度快、通量高等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床，在分子生物學(xué)研究及疾病診斷方面發(fā)揮巨大作用?？紤]到肝內(nèi)膽汁淤積癥是一種發(fā)病率較高的常染色體隱性遺傳代謝病，因此高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷意義重大。本研究116例患兒，通過目標(biāo)基因捕獲結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)證實(shí)有35例患兒發(fā)生基因突變，包括SLC25A13 基因突變、JAG1 基因突變、ABCB11 基因突變、HSD3B7 基因突變、CFTR 基因和AKR1D1 基因突變。

希特林蛋白缺乏癥是由 SLC25A13 基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，該基因突變可導(dǎo)致位于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的Citrin 蛋白即天冬氨酸/谷氨酸載體2型蛋白功能缺陷，從而導(dǎo)致各種代謝紊亂[8]。在本研究中有11例為希特林蛋白缺乏癥患兒，均測(cè)出有SLC25A13 基因突變。Takahashi等[9]研究表明，約70%的SLC25A13突變攜帶者為851 de14 突變，而約1/17嬰兒膽汁淤積性黃疸患兒攜帶851 de14突變。羅玲英等[10]通過檢測(cè)40例希特林蛋白缺乏癥導(dǎo)致的嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒發(fā)現(xiàn)，SLC25A13突變基因主要包括851de14、IVS16ins3kb和IVS6+5GD>A等。白欣立等[11]對(duì)希特林蛋白缺乏癥導(dǎo)致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的4例患兒的SLC25A13基因突變進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示突變包括c.851_854delGTAT、c.851_854delGTAT/c.115G>T、c.1064G>A/c.1157G>T和c.1078C>T/c.IVS4+6A>G。在本研究中，檢測(cè)到希特林蛋白缺乏癥導(dǎo)致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的SLC25A13基因突變包括c.1078C>T/g.IVS4+6A>G、c.852_855del/c.615+5G>A、c.736delG/IVS16ins3kb、c.1095delT/c.1064G>A、c.G1064G>A/c.G1157G>T和g.IVS11+1G>A/g.IVS16ins3kb。因此SLC25A13是希特林蛋白缺乏癥導(dǎo)致的嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的常見突變基因，但是各個(gè)研究檢測(cè)到的突變位點(diǎn)差異較大。

Alagille綜合征為常染色體顯性遺傳病，與JAG1 及 NOTCH2 基因變異有關(guān)[12]，可累及肝臟、心臟、骨骼、眼和面部等多器官，典型肝臟病理表現(xiàn)為小葉間膽管缺乏，但是其臨床表現(xiàn)也不完全一致。本研究中有8例Alagille綜合征患兒，均為JAG1 基因突變，突變位點(diǎn)包括c.439+1G>A、c.3521C>T、c.1655C>T和c.2906T>C。王美娟等[13]對(duì)3例Alagille綜合征患兒基因突變檢測(cè)結(jié)果顯示也均為JAG1基因突變，突變位點(diǎn)與本研究結(jié)果一致。程映等[14]采用DNA 直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Alagille綜合征患兒的JAG1基因存在c.2419delG突變，但是該突變位點(diǎn)在本研究中未發(fā)現(xiàn)。

進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥為嬰兒期或兒童期起病的常染色體隱性遺傳性疾病，根據(jù)致病基因不同分為1型(ATP8B1基因突變導(dǎo)致家族性肝內(nèi)膽汁淤積相關(guān)蛋白1缺陷)、2型(ABCB11基因突變導(dǎo)致膽鹽排泄泵缺陷)和3型(ABCB4基因突變導(dǎo)致多耐藥糖蛋白3缺陷)。本研究篩選出7例ABCB11 基因突變導(dǎo)致的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型，基因突變的位點(diǎn)有c.2594C>T/c.239T>C、c.3334G>T/c.908+1G>A和c.2594C>T/c.667C>T，與王美娟等[13]報(bào)道的ABCB11 基因突變位點(diǎn)一致。金萌等[15]報(bào)道了3例ABCB11 基因突變導(dǎo)致的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型患兒，基因突變的位點(diǎn)包括c.2594C>T/c.239T>C、c.2332G>A/c.2077C>G、c.1493T>C/c.1331T>C，與本研究?jī)H有c.2594C>T/c.239T>C突變位點(diǎn)一致。

先天性膽汁酸合成障礙是一類由于合成膽汁酸過程中的酶缺陷引起，大多屬于常染色體隱性遺傳病，也可以是自身基因自發(fā)突變導(dǎo)致，臨床罕見。本研究篩選出4例先天性膽汁酸合成障礙1型，發(fā)生HSD3B7 基因突變，突變位點(diǎn)為c.557C>T/c.968C>G和c.1031 A>G；3例先天性膽汁酸合成障礙2型患兒，CFTR 基因和HSD3B7 基因發(fā)出突變，HSD3B7 基因突變位點(diǎn)為c.396C>A/c.722A>T，CFTR 基因突變位點(diǎn)為c.317_324del/c.1456G>T；2例囊性纖維化患兒，發(fā)生AKR1D1 基因突變，突變位點(diǎn)為c.158A>G/c.658A>C和c.579+2delT/c.853C>T。

通過分析基因突變和非基因突變患兒的臨床資料結(jié)果顯示，除基因突變患兒血清ALT水平稍高于非基因突變患兒外，其他臨床資料包括性別、發(fā)病年齡、就診年齡、體重、喂養(yǎng)方式、皮膚染黃時(shí)間、白陶土色便、AST、γ-GGT、ALP、TBA、TBil、TP、Alb、GLB、肝臟彩超情況、脾臟彩超情況和膽囊彩超情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此基因突變和非基因突變患兒的基本臨床征象基本相似，通過臨床征象診斷基因突變的遺傳代謝性肝內(nèi)膽汁淤積癥難度比較大。

因此，南寧地區(qū)發(fā)生基因突變的肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒病因繁多，臨床特征無顯著特征，通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臨床疑似遺傳代謝病的肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒的診斷有重要價(jià)值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。