基于分子對接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究補(bǔ)腎健脾活血方通過Wnt信號通路防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制*

吳睿哲，吳 潔，劉 凱，葛殊瑋，伍 強(qiáng)，曾景奇，王 凡

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporesis，OP）是一種以骨量丟失、骨小梁數(shù)量減少、骨密度降低導(dǎo)致全身骨骼強(qiáng)度降低為特征的原發(fā)性疾病，50歲以上女性的發(fā)病率為同齡男性的1.8倍，而絕經(jīng)后女性的發(fā)病率更高。成骨-破骨平衡的改變是OP發(fā)病機(jī)制中備受關(guān)注的一種[1]，據(jù)此防治OP藥物也主要分為骨吸收抑制劑和骨合成促進(jìn)劑。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，激素、細(xì)胞因子、多肽等多種藥物正逐步應(yīng)用于防治OP[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的成骨、成脂分化及其功能的調(diào)控涉及多種蛋白及轉(zhuǎn)錄因子[3]，其中Wnt/β-catenin信號通路是促進(jìn)BMSCs成骨分化不可或缺的重要信號通路。Dickkopf相關(guān)蛋白1（Dickkopf related protein 1，DKK-1）及硬化蛋白（sclerostin，Sost）是Wnt通路的抑制性蛋白，通過與Wnt競爭性結(jié)合細(xì)胞膜表面的相應(yīng)受體，影響下游因子β-catenin在細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)的含量，最終影響通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生主要與腎虛、脾虛、血瘀3個(gè)因素有關(guān)，補(bǔ)腎健脾活血方正是針對“多虛多瘀”的病機(jī)特點(diǎn)所創(chuàng)立。近來，補(bǔ)腎活血類方劑防治骨質(zhì)疏松癥的研究取得了一定的成果[4]，課題組成員前期也已證實(shí)補(bǔ)腎健脾活血方可以促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）的表達(dá)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方中核心成分，利用分子對接計(jì)算探究方中核心成分與DKK-1及Sost蛋白結(jié)合的可能性，并通過含藥血清干預(yù)過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種抑制性蛋白的MG63細(xì)胞，深入研究補(bǔ)腎健脾活血方防治骨質(zhì)疏松癥的具體分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 成分篩選與分子對接

1.1.1 補(bǔ)腎健脾活血方核心成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）及BATMAN數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中分別篩選補(bǔ)腎健脾活血方中10味中藥的有效化學(xué)成分。根據(jù)ADME原則選取滿足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的化學(xué)成分，通過Uniport數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行成分靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化；在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中，以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞搜索疾病靶點(diǎn)，并進(jìn)行篩選，將上述靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒑Y選核心藥物成分。

1.1.2 分子對接 選取方中核心成分與DKK-1以及Sost進(jìn)行分子對接。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）中下載DKK-1及Sost[5-6]的pdb格式結(jié)構(gòu)文件；根據(jù)篩選結(jié)果在ZINC小分子數(shù)據(jù)庫（https://zinc.docking.org/）中下載核心成分的mol2格式結(jié)構(gòu)文件。運(yùn)用AutoDockTools1.5.6對經(jīng)篩選的核心成分與DKK-1及Sost進(jìn)行分子對接，并用Pymol2.4.0對對接結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年SPF級雌性未孕SD大鼠16只，6個(gè)月齡，體質(zhì)量（400±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食，取材時(shí)將大鼠麻醉處死。實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：LL2020070601。實(shí)驗(yàn)過程中參照國家《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》對大鼠進(jìn)行處置，并按照4R原則給予人道關(guān)懷。

1.2.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎健脾活血方，方藥組成：淫羊藿10 g，熟地黃10 g，肉蓯蓉10 g，大棗10 g，當(dāng)歸10 g，菟絲子10 g，補(bǔ)骨脂10 g，黃芪10 g，白芍10 g，丹參10 g。上述中藥均購置于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，并由中藥房煎制成水煮液。水煮液生藥濃度為1.43g/mL。MEM培養(yǎng)基（批號：5811492）、MG63細(xì)胞（批號：5202470）購自上海中喬新舟生物科技有限公司；DKK-1過表達(dá)質(zhì)粒（Ad-DKK-1）（批號：0025173）、Sost過表達(dá)質(zhì)粒（Ad-Sost）（批號：0138194）均購自長沙艾碧維生物科技有限公司；LIP2000（批號：2398587）購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；Wnt3a抗體（批號：AF01156173Q）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-catenin抗體（批號：00018600）、βactin抗體（批號：10011066）均購自美國Proteintech公司；堿性磷酸酶（ALP）測試盒（批號：20210320）購自南京建成生物工程研究所。

1.2.3 主要儀器 YT-CJ-2NB型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）；SL02型低速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；DH-160I型直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）；DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；H1650R型臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2.4 動物分組及含藥血清制備 大鼠按照體質(zhì)量分層隨機(jī)分為生理鹽水組和補(bǔ)腎健脾活血方組，每組8只。補(bǔ)腎健脾活血方組大鼠灌胃給予補(bǔ)腎活血健脾方，4.8 g/kg，灌胃給藥容量為10 mL/kg；生理鹽水組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。2次/d，灌胃間隔約5 h，連續(xù)灌胃7 d。最后一次灌胃2 h后予腹主動脈取血后人道主義處死各組大鼠，3 000 r/min離心15 min，取血清，滅活，過濾除菌，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 MG63細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS+1%雙抗的MEM專用培養(yǎng)基，2～3 d換一次液，細(xì)胞匯合率達(dá)80%左右，胰酶消化細(xì)胞，一分為二進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長的細(xì)胞接種在6孔板中待細(xì)胞貼壁，按以下分組進(jìn)行如下處理?？蛰d對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載；過表達(dá)DKK-1組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-DKK-1過表達(dá)質(zhì)粒；過表達(dá)Sost組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-Sost過表達(dá)質(zhì)粒；過表達(dá)DKK-1+Sost組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-DKK-1和Ad-Sost過表達(dá)質(zhì)粒。各組分別使用空白血清及含藥血清干預(yù)。

1.2.6 ALP活性檢測 血清干預(yù)細(xì)胞72 h后，收集提取總蛋白，BCA法定量檢測蛋白濃度，按照ALP活性檢測試劑盒操作說明檢測細(xì)胞ALP活性。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞鈣離子濃度 用無血清培養(yǎng)液稀釋（1∶1 000）離子熒光探針，加入上述去除細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞鈣離子濃度。

1.2.8 Western blotting 檢測通路蛋白Wnt3a、β-catenin表達(dá) 血清干預(yù)細(xì)胞72 h后，加入200 μL RIPA裂解液，超聲破碎刮取的細(xì)胞懸液，BCA法定量檢測蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度至上樣濃度，取20 μL樣品上樣進(jìn)行電泳，電泳恒定電壓75 V，時(shí)間130 min，轉(zhuǎn)膜后PBST配制5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫放置60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min，按比例依次加入Wnt3a、β-catenin、β-actin一抗室溫放置90 min孵育，洗滌，加入按比例稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min，暗盒內(nèi)與X膠片曝光30 s，顯影沖洗條帶。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩種血清干預(yù)組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎健脾活血方核心成分篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫及BATMAN數(shù)據(jù)庫中檢索補(bǔ)腎健脾活血方成分，符合ADME原則進(jìn)行二次篩選后，滿足OB≥30%，DL≥0.18的主要成分共98種，通過Uniport數(shù)據(jù)庫成分靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“Osteoporosis”，限定來源為“Homo sapiens”，通過中位數(shù)限制Relevance score＞1.013 324 261共獲取1 107個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將補(bǔ)腎健脾活血方與OP靶點(diǎn)取交集共獲得127個(gè)交集基因，將上述靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出Dgree值排名前5的核心藥物成分。（見表1）

表1 補(bǔ)腎健脾活血方核心成分信息表

2.2 分子對接結(jié)果及呈現(xiàn) 為進(jìn)一步評價(jià)方劑中核心成分與DKK-1及Sost的親和能力，使用AutodockTools對篩選出的有效成分及目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接計(jì)算，對接結(jié)果見表2。根據(jù)DENNIS G J等[7]研究報(bào)道，結(jié)合能≤-4.0 kcal/mol表明分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol表明分子與靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol表明分子與靶點(diǎn)具有明顯結(jié)合活性，故選用結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol作為結(jié)合有效指標(biāo)。結(jié)果顯示，方劑核心成分與DKK-1結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有5種；與Sost結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的核心成分有2種，采用Pymol2.4.0對核心成分與DKK-1及Sost對接結(jié)合能絕對值排名前3，且結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，其中DC4進(jìn)行可視化呈現(xiàn)時(shí)無法構(gòu)建氫鍵，其余結(jié)果見圖1。

表2 有效成分與DKK-1 及Sost 分子對接結(jié)果

圖1 核心成分與靶點(diǎn)蛋白對接結(jié)果可視化呈現(xiàn)

2.3 各組MG63細(xì)胞ALP水平比較 經(jīng)含藥血清干預(yù)的空載對照組MG63細(xì)胞ALP水平與經(jīng)空白血清干預(yù)的空載對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)含藥血清干預(yù)的過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組MG63細(xì)胞ALP水平均分別高于經(jīng)空白血清干預(yù)的過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組（P＜0.01）。（見圖2）

圖2 各組MG63 細(xì)胞ALP 水平比較（）

2.4 各組MG63細(xì)胞鈣離子濃度比較 經(jīng)含藥血清干預(yù)的空載對照組MG63細(xì)胞鈣離子濃度明顯低于經(jīng)空白血清干預(yù)的空載對照組（P＜0.05）；經(jīng)含藥血清干預(yù)的過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組MG63細(xì)胞鈣離子濃度均分別低于經(jīng)空白血清干預(yù)的過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組MG63 細(xì)胞鈣離子濃度比較（）

2.5 各組MG63細(xì)胞Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達(dá)量比較 經(jīng)含藥血清干預(yù)的空載對照組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組MG63細(xì)胞β-catenin蛋白相對表達(dá)量均分別高于經(jīng)空白血清干預(yù)的空載對照組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組、過表達(dá)DKK-1+Sost組（P＜0.01）；經(jīng)含藥血清干預(yù)的空載對照組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組MG63細(xì)胞Wnt3a蛋白相對表達(dá)量均分別高于經(jīng)空白血清干預(yù)的空載對照組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK-1組（P＜0.01）；經(jīng)含藥血清干預(yù)的過表達(dá)DKK-1+Sost組MG63細(xì)胞Wnt3a蛋白相對表達(dá)量與經(jīng)空白血清干預(yù)的過表達(dá)DKK-1+Sost組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的“成骨-破骨”動態(tài)平衡變化一直是研究骨組織新生修復(fù)、維持骨量的關(guān)鍵，兩種細(xì)胞分別來自BMSC以及造血干細(xì)胞的分化[8]。Wnt信號通路在2001年被證實(shí)與骨代謝關(guān)系密切，一方面可通過影響ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨鈣素等多種蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控BMSCs的成骨、成脂分化趨向[9-10]；另一方面Wnt信號通路可通過影響轉(zhuǎn)錄因子（T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子）（TCF/LEF）的表達(dá)間接調(diào)控成骨細(xì)胞BMP-2的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)調(diào)控BMSCs對BMP-2的結(jié)合活性，最終影響B(tài)MSCs的成骨分化[11-12]。破骨方面，經(jīng)典的Wnt信號通路并未直接參與破骨細(xì)胞的分化和功能調(diào)控，而是通過促進(jìn)成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的表達(dá)調(diào)控破骨細(xì)胞的功能，影響骨吸收過程[13]。YAN D Y等[14]發(fā)現(xiàn)通過影響Wnt信號通路中間產(chǎn)物AKT/GSK3-β/β-catenin的調(diào)控軸不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，還可以抑制破骨細(xì)胞的分化，而β-catenin的轉(zhuǎn)錄因子Catenin beta 1在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)BMSCs中的表達(dá)低于健康患者[15]，因此調(diào)控β-catenin是骨重建的動態(tài)平衡中重要的一環(huán)。DKK-1和Sost均可通過與Wnt競爭性結(jié)合細(xì)胞表面的LRP5/6受體調(diào)控下游β-catenin的表達(dá)，但不同的是DKK-1與該受體結(jié)合時(shí)可與LRP5/6上各有的4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域同時(shí)作用，Sost只與LRP5/6上的第1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域作用。Wnt3a誘導(dǎo)BMSCs成骨分化實(shí)驗(yàn)顯示，DKK-1對Wnt信號通路的抑制作用強(qiáng)于Sost[16]，故而抑制DKK-1的表達(dá)可能更有利于防治骨質(zhì)疏松癥。研究發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量指數(shù)與骨密度存在正相關(guān)關(guān)系[17]，研究者認(rèn)為機(jī)械性的應(yīng)力刺激可增強(qiáng)骨重塑過程以對抗BMI的增加[18]。MORSE A等[19]通過構(gòu)建脛骨壓縮負(fù)荷小鼠模型觀察骨重塑與骨量改變的研究發(fā)現(xiàn)，敲除DKK-1基因的小鼠骨體積和骨量均明顯增加，而Sost的表達(dá)并沒有隨著DKK-1的缺失出現(xiàn)代償性上升，相反出現(xiàn)了下降，表明機(jī)械負(fù)荷可以促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)，而DKK-1和Sost對骨量改變的作用可能是互相獨(dú)立而不是互補(bǔ)的。研究發(fā)現(xiàn)DKK-1還可以激活非經(jīng)典的Wnt信號通路及Smad信號通路促進(jìn)成骨分化，而Sost在抑制Wnt信號通路的同時(shí)還可以通過影響OPG和RANKL的比例，增加破骨細(xì)胞數(shù)量并促進(jìn)骨吸收[20-21]。

圖4 各組MG63 細(xì)胞Wnt3a、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較（）

分子對接計(jì)算顯示，補(bǔ)腎健脾活血方中部分核心成分可以和DKK-1以及Sost進(jìn)行對接，且與DKK-1的結(jié)合活性相對較好。其中谷甾醇（Sitosterol）與DKK-1結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol，表明這一成分很可能是補(bǔ)腎健脾活血方與DKK-1作用的主要成分；而Sost的對接活性相對較差，并且與谷甾醇對接后無法進(jìn)行氫鍵的構(gòu)建，這可能與Sost通過短肽而非通過氫鍵與LRP6進(jìn)行結(jié)合有關(guān)[22]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白血清比較，經(jīng)補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清干預(yù)的MG63細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)均呈有利表達(dá)。ALP水平與成骨細(xì)胞的分化和活性水平呈正相關(guān)，除空載對照組外，其余各組經(jīng)含藥血清干預(yù)的MG63細(xì)胞ALP水平均高于空白血清干預(yù)的細(xì)胞（P＜0.05）；細(xì)胞鈣離子濃度的上升可導(dǎo)致鈣超載及細(xì)胞凋亡的發(fā)生[23]，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測結(jié)果提示經(jīng)含藥血清干預(yù)的細(xì)胞鈣離子濃度均明顯下降。Western blotting結(jié)果提示過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin蛋白明顯下降，經(jīng)含藥血清干預(yù)后Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)抑制效果明顯改善。

補(bǔ)腎健脾活血方可能通過提高Wnt3a蛋白的表達(dá)量，抑制DKK-1及Sost對Wnt信號通路的抑制作用，影響成骨細(xì)胞中Wnt信號通路的表達(dá)，最終提高成骨細(xì)胞的活性及分化能力，從而防治OP。