基于LC-MS/MS 法的玄麥甘桔顆粒中麥冬及山麥冬的檢查

湯珺，譚志偉

吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 吉安 343000

玄麥甘桔顆粒是一種在臨床使用較為普遍的中成藥，具有祛痰利咽和清熱滋陰等功效，主要用于虛火上浮、陰虛火旺、咽喉腫痛和口鼻干燥等癥狀。該制劑由麥冬、玄參、甘草和桔梗四味藥材等量制成，其中麥冬清心熱養(yǎng)胃陰，是該制劑中的一味重要藥材。麥冬來源廣泛，市場(chǎng)上流通品種較多，2020 年版《中國(guó)藥典》收載的麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬的干燥塊根，主產(chǎn)于浙江、四川［1］。山麥冬為百合科山麥冬屬植物湖北麥冬或短葶山麥冬的干燥塊根［1］，主產(chǎn)于湖北、山東、福建。由于山麥冬產(chǎn)量大、價(jià)格低、與麥冬形態(tài)相近，部分廠家為降低生產(chǎn)成本，在投料時(shí)摻入山麥冬的情況時(shí)有發(fā)生［2-6］。

玄麥甘桔顆?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)甘草、玄參兩味藥材通過鑒別、含量測(cè)定等方法予以質(zhì)量控制，對(duì)麥冬的質(zhì)量控制尚未做要求［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,麥冬和山麥冬的化學(xué)成分存在較大差異,如麥冬中富含高異黃酮類化合物而山麥冬中少含或不含該類化合物［7-8］，甲基麥冬黃烷酮A 和甲基麥冬黃烷酮B 是麥冬的有效成分；湖北麥冬和短葶山麥冬含有麥冬中沒有的山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 兩種成分［9-11］。本研究通過建立玄麥甘桔顆粒中甲基麥冬黃烷酮A 和甲基麥冬黃烷酮B（麥冬的有效成分），以及山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C（山麥冬的特征性成分）的含量測(cè)定方法，為該藥品質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管提供更科學(xué)、更有效的技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

WatersVevoTQ-S 液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；AR2140 電子天平；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 KHZ）；對(duì)照品：甲基麥冬黃烷酮A（批號(hào)RDD-J7111805017，純度99.96%），甲基麥冬黃烷酮B（批號(hào)RES-J07202106004，純度99.46%），購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；山麥冬皂苷B（批號(hào)111907-201804，純度98.6%），短葶山麥冬皂苷C（批號(hào)111908-201102，純度99.5%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，水為屈臣氏純凈水；玄麥甘桔顆粒30 批，均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液（60∶40）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI 電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓，±3.5 kV；脫溶劑氣溫度，500 ℃；碰撞氣，氬氣；采用正負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)見表1，各成分離子流色譜圖見圖1。

圖1 各成分離子流色譜圖：A.甲基麥冬黃烷酮A；B.甲基麥冬黃烷酮B；C.山麥冬皂苷B；D.短葶山麥冬皂苷C

表1 待測(cè)組分質(zhì)譜參數(shù)

2.3 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液和混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 四種對(duì)照品，加甲醇制成含量分別為1 203.52、529.13、415.70、455.71 ng/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，至5 mL 量瓶中，加60%乙腈溶液定容，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取玄麥柑桔顆粒樣品，研細(xì)，精密稱取20 g，精密加入甲醇20 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷后補(bǔ)重，取上清液濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.5 陰性樣品溶液的制備

按玄麥甘桔顆粒的處方比例,制成缺麥冬藥味的陰性樣品,如“2.4”所述方法制成陰性樣品溶液。

2.6 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備

取“2.5”所述陰性樣品，分別加入甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 四種成分，如“2.4”所述方法制成陽(yáng)性對(duì)照溶液。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性實(shí)驗(yàn)取上述陰性樣品溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液和混合對(duì)照品溶液按“2.1”和“2.2”所述方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示混合對(duì)照品分離度好，陰性樣品溶液無干擾，表明方法專屬性良好，見圖2。

圖2 各溶液總離子流圖：A.混合對(duì)照品溶液；B.陽(yáng)性對(duì)照溶液；C.陰性樣品溶液；D.供試品溶液

2.7.2 線性關(guān)系考察分別精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL、10 mL，至10 mL 容量瓶中，加60%乙腈定容，搖勻，制成每1 mL 含甲基麥冬黃烷酮A 為24.07、60.18、120.35、601.76、1 203.52 ng，含甲基麥冬黃烷酮B 為10.58、26.46、52.91、264.56、529.13 ng，含山麥冬皂苷B為8.31、20.78、41.57、207.85、415.70 ng，含短葶山麥冬皂苷C 為9.11、22.79、45.57、227.86、455.71 ng的系列混合溶液，分別進(jìn)樣。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，四種待測(cè)組分的線性范圍見表2。

表2 4種成分的線性范圍

2.7.3 檢出限和定量限取“2.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）3∶1、10∶1 為檢出限、定量限，測(cè)得上述四種成分的檢出限分別為1.20、0.53、0.42、0.46 ng/mL，定量限分別為4.0、1.77、1.4、1.53 ng/mL。

2.7.4 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.3”所述混合對(duì)照品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法，連續(xù)進(jìn)樣6 次，四種成分峰面積的RSD 分別為0.8%、0.9%、1.1%、0.8%。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取檢出山麥冬皂苷B 的樣品，按“2.4”項(xiàng)下平行制備6 份，進(jìn)樣分析，測(cè)得甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B 平均含量分別為26.33 ng/g、132.60 ng/g、279.61 ng/g，另取檢出短葶山麥冬皂苷C 的樣品，同法平行制備6 份，進(jìn)樣分析，測(cè)得短葶山麥冬皂苷C 的平均含量為346.64 ng/g，四種成分的RSD 分別為2.3%、1.9%、2.6%、1.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.7.5”項(xiàng)下制備好的檢出山麥冬皂苷B 的供試液一份，分別于0、12、24、36、48 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B 三種成分的峰面積RSD 分別為2.8%、1.9%、2.3%；另精密吸取“2.7.5”項(xiàng)下制備好的檢出短葶山麥冬皂苷C 的供試液一份，分別于0、12、24、36、48 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，短葶山麥冬皂苷C 的峰面積RSD 為2.5%。結(jié)果表明供試品在室溫下，放置48 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.7.7 回收率試驗(yàn)采用加樣回收試驗(yàn)，取檢出山麥冬皂苷B 且已知含量的同一批號(hào)樣品，研細(xì)，精密稱取9 份，每份10 g，分別精密加入含甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B 高、中、低（120%、100%、80%）三種濃度的對(duì)照品溶液各3 份，同“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、山麥冬皂苷B的平均回收率分別為103.2%、91.1%、93.6%；另取檢出短葶山麥冬皂苷C 且已知含量的樣品，研細(xì)，精密稱取9 份，每份10 g，精密加入含短葶山麥冬皂苷C 高、中、低（120%、100%、80%）三種濃度的對(duì)照品溶液各3 份，同法處理和測(cè)定，計(jì)算加樣回收率為95.6%，結(jié)果表明本方法回收率良好。

3 樣品的測(cè)定

取市售30 批玄麥甘桔顆粒（涉及13 家生產(chǎn)企業(yè)），如“2.4”所述方法制備成供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3，其中2 批檢出山麥冬皂苷B，1 批檢出短葶山麥冬皂苷C，提示企業(yè)存在麥冬與山麥冬混用情況；30 批樣品中，甲基麥冬黃烷酮A 和甲基麥冬黃烷酮B 的含量相差較大，其中最高和最低相差10 倍以上，提示各生產(chǎn)廠家所使用的麥冬藥材質(zhì)量參差不齊，可能存在使用劣質(zhì)藥材投料或投料不足的情況。

表3 三十批樣品測(cè)定情況 ng/g

4 討論

實(shí)驗(yàn)嘗試采用TLC 法、HPLC 法對(duì)四種待測(cè)成分進(jìn)行檢測(cè)，但TLC 法中，優(yōu)化的展開系統(tǒng)和樣品前處理方法的前提下，仍舊無法避免雜質(zhì)斑點(diǎn)的干擾；HPLC 法中嘗試采用不同的流動(dòng)相，四種成分始終不能達(dá)到有效分離，兩種方法的靈敏度均無法滿足實(shí)驗(yàn)要求。LC-MS/MS 法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，且能簡(jiǎn)化樣品的前處理過程，縮短進(jìn)樣時(shí)間，提高準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)效率，故最后確定此法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

樣品處理方法采用回流、超聲、震蕩提取三種不同前處理方法，前處理時(shí)間分別選取30、45、60 min，經(jīng)比對(duì)，震蕩提取效果不佳，回流和超聲提取效果相當(dāng)，三個(gè)不同提取時(shí)間所提取的樣品經(jīng)測(cè)定待測(cè)組分含量無明顯差異，故最后確定采取超聲30 min 作為樣品處理方法。

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液以及兩者之間的比例進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明流動(dòng)相采用乙腈-0.1%甲酸溶液（60∶40）時(shí)，被測(cè)組分峰形較好，分離效果佳。

對(duì)四種成分分別進(jìn)行了正、負(fù)離子掃描，結(jié)果顯示甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 和短葶山麥冬皂苷C 在負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下基線噪音小、響應(yīng)較好，而山麥冬皂苷B 在正離子監(jiān)測(cè)模式下基線噪音小、響應(yīng)較好，因此，實(shí)驗(yàn)采用正負(fù)離子模式對(duì)四個(gè)成分進(jìn)行掃描，同時(shí)選擇離子豐度較高的一組離子對(duì)作為定量離子對(duì)，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化碰撞能量和錐孔電壓。

《中國(guó)藥典》2020 年版中使用麥冬的成方制劑（120 余個(gè)）遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過使用山麥冬的制劑（3 個(gè)），兩者在市場(chǎng)的需求量相差甚遠(yuǎn)，生產(chǎn)過程中存在山麥冬摻偽麥冬的可能。此外，山麥冬替代麥冬投料的報(bào)道也屢見不鮮［3-7］，并在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)建立的LC-MS/MS 法檢測(cè)玄麥甘桔顆粒中麥冬與山麥冬混用情況，對(duì)進(jìn)一步提高該制劑藥檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中麥冬質(zhì)量控制的盲點(diǎn)，促使生產(chǎn)企業(yè)規(guī)范性投料，起到了積極作用。此外，鑒于質(zhì)譜分析方法的高選擇性，其他處方中含有麥冬的成方制劑亦可參照本方法進(jìn)行測(cè)定。