HPLC 雙波長切換法同時測定不同產(chǎn)地牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚的含量

李曉艷，張俠，張紫微，王朋，陳慶

安徽宏方藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800

牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，主要分布于山東、山西、安徽、河南等地，是安徽道地藥材之一，具有活血化瘀，清熱涼血的作用［1-4］。牡丹皮中除了丹皮酚含量較高外，也含有較多的單萜類成分［5-8］，如含量較高的芍藥苷。芍藥苷作為牡丹皮的主要活性成分［9-11］，2020 年版《中國藥典》中僅收載丹皮酚作為牡丹皮含量測定的檢測指標(biāo)。因此，增加芍藥苷作為牡丹皮含量測定的指標(biāo)成分［12-15］，更好地控制牡丹皮的質(zhì)量是十分必要的。

本研究同時測定牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚兩種有效成分，建立了準(zhǔn)確可靠的檢測方法，并用于不同產(chǎn)區(qū)的牡丹皮質(zhì)量差異的對比［16-19］。結(jié)果表明，此法可對牡丹皮的質(zhì)量進(jìn)行全面、有效地控制。

1 材料與儀器

1.1 試藥與試劑

牡丹皮藥材（編號：S1～S20，分別購自山西、山東、湖北、安徽、河南等地）；丹皮酚（批號：110708-201407，含量：99.9%），芍藥苷（批號：110736-202044，含量：96.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配置四元泵、DAD 檢測器、化學(xué)工作站、HP compaq 計算機(jī)系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司）；XP26 型百萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；BT224S 型萬分之一天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；BSA822-CW 型百分之一天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XL-300 型多功能搖擺式粉碎機(jī)（上海潤實電器有限公司）；JL-360 型超聲提取器（上海吉理儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈，0.1%磷酸溶液分別為流動相A 和B，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長：0～20 min，232 nm，20～40 min，274 nm；流 速：1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷和丹皮酚峰計算，應(yīng)分別不低于5 000、7 000。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取丹皮酚、芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含丹皮酚0.10 mg、芍藥苷0.06 mg 的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取牡丹皮藥材粉末（過四號篩）約0.3 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）40 min，放冷至室溫后再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.3 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、80%甲醇（空白對照溶液）、供試品溶液各10 μL，分別采樣，色譜圖見圖1。檢測結(jié)果顯示，供試品中芍藥苷和丹皮酚與相鄰色譜峰分離效果良好，且與對照品峰保留時間一致，空白對照溶液無干擾，表明專屬性較強(qiáng)。

圖1 HPLC色譜圖：A.空白對照溶液；B.混合對照溶液；C.供試品溶液

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷對照品3.016 mg，丹皮酚對照品3.009 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取儲備液5 mL、1 mL、0.2 mL、0.04 mL、0.02 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成不同濃度對照品溶液，見表2。以峰面積峰值（y）為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得芍藥苷和丹皮酚回歸方程分別為y=13 905x+1.828，r=1.000 0；y=49 712x+36.714，r=0.999 9。芍藥苷和丹皮酚分別在0.000 6～0.291 9 mg/mL；0.000 6～0.300 6 mg/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 混合對照品濃度表 mg/mL

2.5 精密度試驗

取供試品（編號：S02）0.3 g，精密稱定，按“2.2.2”制備供試品溶液，根據(jù)上述的色譜條件進(jìn)行分析，重復(fù)6 次進(jìn)樣。結(jié)果：牡丹皮中芍藥苷峰面積RSD為0.64%；丹皮酚峰面積的RSD 為0.55%，表明儀器具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，在48 h 內(nèi)分時段進(jìn)樣。檢測結(jié)果顯示，供試品溶液中芍藥苷和丹皮酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.48%、1.60%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗

取供試品（編號：S02）0.3 g，平行6 份，精密稱定，按“2.2.2”制備供試品溶液，按上述色譜條件精密吸取供試品溶液10 μL，測定。供試品溶液中芍藥苷和丹皮酚的含量分別為1.01%、2.08%，RSD 分別為1.00%、1.05%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取供試品（編號：S02）0.15 g，精密稱定，平行6 份，精密加入含有對照品（芍藥苷：1.531mg，丹皮酚：3.136 mg）的80%甲醇各50 mL,按“2.2.2”制備供試品溶液，計算平均回收率。結(jié)果芍藥苷平均回收率為101.50%，RSD 為0.53%；丹皮酚平均回收率為99.40%，RSD 為1.28%，表明該方法加樣回收率良好。見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 耐用性試驗

考察了3 個廠家的色譜柱（Agilent5 HC-C18、Agilent Eclipse Plus C18、LC AQ-C18 色譜柱）；并考察了不同柱溫（20、25、30 ℃），流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），進(jìn)樣量（5、10、15 μL）等因素對牡丹皮（編號：S02）含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表4，表明該方法具有良好的耐用性。

表4 耐用性試驗結(jié)果

2.10 20 批不同產(chǎn)地牡丹皮的含量測定

取不同產(chǎn)地的牡丹皮粉末約0.3 g，精密稱定,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測定。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚的含量，結(jié)果表明牡丹皮中丹皮酚含量為0.74%～2.84%，芍藥苷的含量為0.24%～1.76%。其中，河南平頂山產(chǎn)的牡丹皮中丹皮酚的含量為0.74%，低于2020 年版《中國藥典》規(guī)定的1.2%，具體檢測結(jié)果見表5?？梢姴煌a(chǎn)地的牡丹皮中，不論是芍藥苷還是丹皮酚含量均具有較大差異。

表5 不同產(chǎn)地牡丹皮芍藥苷和丹皮酚測定結(jié)果 %

3 討論

通過HPLC-DAD 對芍藥苷和丹皮酚對照品在190～400 nm 進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷和丹皮酚分別在232 nm 和274 nm 處有最大吸收，所以選擇上述兩個波長來分別測定牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚的含量更為準(zhǔn)確。為了得到更好的提取效果分別考察了供試品溶液制備的提取溶劑和時間，試驗發(fā)現(xiàn)以80%甲醇提取40 min 時，丹皮酚和芍藥苷的提取率最高，因此選擇80%甲醇超聲提取40 min 為牡丹皮供試溶液的制備方法。實驗考察了不同流動相組成、不同流動相比例、不同色譜柱等對實驗效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用C18 色譜柱和乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖的峰形較好，且芍藥苷和丹皮酚的分離度均大于1.5，符合《中國藥典》要求。

本實驗建立了HPLC 雙波長切換法同時測定牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚含量的方法。此方法簡單易操作，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度較好，并且穩(wěn)定可靠，能夠為牡丹皮的品控提供保障。