產(chǎn)后抑郁患者腸道微生物的特征

楊 再 ,張玉丹 ,穆鑫 ,裴美麗 ,高媛 ,范雅娟 ,趙斌斌,馬現(xiàn)倉

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神心理衛(wèi)生科,陜西西安 710061;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,陜西西安 710061;3.西安交通大學(xué)附屬西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心,陜西西安 710061;4.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安 710061)

產(chǎn)后抑郁(postpartum depression,PPD)是指產(chǎn)婦在分娩之后出現(xiàn)的以情緒持續(xù)性低落為基礎(chǔ)特征的一組精神障礙,是分娩最常見的并發(fā)癥[1]。PPD不僅會影響產(chǎn)婦的自身健康,而且對嬰幼兒的生長發(fā)育和情緒行為等也會產(chǎn)生不良影響[2]。目前研究認(rèn)為,PPD 主要是由于產(chǎn)婦激素改變、遺傳以及生產(chǎn)環(huán)境等因素引起的[3]。PPD 癥的治療主要包括心理干預(yù)和抗抑郁藥物,但是心理干預(yù)在預(yù)防PPD 癥的有效性方面缺乏明確的證據(jù)[4],而因藥物可能對嬰兒的影響[5]。因此,探索PPD 的機(jī)制,為PPD 提供新的治療方向是臨床亟需解決的問題。

人體的腸道微生物含量巨大且復(fù)雜,主要參與宿主的營養(yǎng)吸收、代謝、免疫及炎癥反應(yīng),維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等,在人體新陳代謝以及生理機(jī)能中發(fā)揮著重要作用。有研究提示,腸道菌群參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteria的相對豐度顯著增加,并且Faecalibacterium與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[10]。關(guān)于中國深圳地區(qū)的產(chǎn)婦腸道菌群研究表明,PPD 患者的β多樣性較高,Enterococcaceae和Escherichia-Shigella出現(xiàn)過度增長[11]。但是腸道微生物的多樣性主要受宿主種群、所處地理環(huán)境和生活方式的影響。因此,本研究通過對中國西北地區(qū)產(chǎn)婦的腸道菌群進(jìn)行分析,初步探討腸道菌群與PPD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年2月至12月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院和西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)后復(fù)查的產(chǎn)婦60名。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),倫理批件號:XJTU1AF2021LSK-002。所有受試者入組前均自愿簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):20歲≤年齡＜45歲的女性;已婚、產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi)復(fù)查;能有效溝通、能完成量表評估;飲食結(jié)構(gòu)評估大體一致,自愿參加并簽署書面知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn):患有嚴(yán)重的精神疾病或有精神疾病家族史;曾有抑郁病史者;患有嚴(yán)重的器質(zhì)性病變者;患有糖尿病、胃腸道疾病等慢性疾病,挑食患者。

1.3 方法

1.3.1 一般資料的采集 所有受試者在入組當(dāng)天詳細(xì)詢問病史,并進(jìn)行體格檢查及精神檢查,收集臨床資料,包括年齡、身高、體質(zhì)量、產(chǎn)后天數(shù)、分娩方式和愛丁堡PPD 量表(EPDS)評分。本研究參考Carolina de Vargas Nunes Coll[12]等的方式,主要用EPDS量表來篩查PPD,主要評估的是PPD 癥狀,有部分入組對象并不能達(dá)到抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn),所以未用精神疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。將EPDS≥13 的入組為PPD 組(PPD 組),EPDS＜13 的入組為產(chǎn)后健康對照組(PPHC組)[13]。

1.3.2 糞便標(biāo)本的采集 入組當(dāng)天給每位受試者分發(fā)專門用于糞便DNA 保存的無菌糞便采集套裝,并告知每位受試者糞便采集套裝的使用方法,于第2天清晨采集糞便樣本。所有受試者采集新鮮糞便標(biāo)本約5 g于5 mL無菌采集管內(nèi),并盡快轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 糞便中基因組DNA 的提取 糞便采集后1周內(nèi)使用DNA提取試劑盒(OMAGE,D4015)進(jìn)行基因組DNA的提取。先將含有糞便保存液的糞便進(jìn)行離心,棄去上清,取200 mg沉淀并根據(jù)試劑商的說明進(jìn)行DNA的提取。用核酸定量分析儀進(jìn)行DNA 濃度以及純度的檢測,并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 完整性檢測,將檢測合格的DNA保存于-20℃冰箱備用。

1.3.4 16S r DNA 擴(kuò)增子測序及生物學(xué)分析 將糞便標(biāo)本中提取的16S r RNA 基因,在北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測序,即根據(jù)保守區(qū)(V3+V4區(qū))設(shè)計(jì)上游引物 338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3',下游引物806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3',在引物末端加上測序接頭,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫并質(zhì)檢,合格的文庫用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)通過拼接、過濾、聚類,獲得OTU 數(shù)據(jù)。以Silva為參考數(shù)據(jù)庫,使用比對的方法對特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋,可得到每個(gè)特征對應(yīng)的物種分類信息,進(jìn)而在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成,利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R4.0.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以ˉx±s描述,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。組間計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)。α多樣性采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn),β 多樣性采用PERM ANOVA 檢驗(yàn)和unweighted unifrac 的PCo A 分析。采用RDA 線性模型的多元直接梯度分析反映抑郁癥狀評分與腸道菌群的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般資料

共納入PPD 組樣本30例,PPHC組樣本30例。兩組之間的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、產(chǎn)后時(shí)間、分娩方式等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表1)。

表1 兩組研究對象的一般人口學(xué)資料分析Tab.1 Analysis of demographic data of the two groups

2.2 腸道菌群相對豐度分析

對所有受試者的糞便樣本進(jìn)行測序,共獲得5 189 630對Reads。對雙端Reads質(zhì)控、拼接共產(chǎn)生4 397 016條Clean Reads,其中Q20、Q30均在97%以上,表明質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)良好,能夠滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。

2.2.1 PPD 組的α多樣性降低 α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性,可以在物種豐富度和多樣性兩個(gè)方面顯示PPD 組和PPHC組產(chǎn)婦腸道菌群的特點(diǎn),有多種衡量指標(biāo):Chao1、Ace、Shannon、Simpson等。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少;Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性。糞便α多樣性指數(shù)如圖1 所示,與PPHC組相比,PPD組可以觀察到的OTU 數(shù)量明顯減少(t=4.769,P＜0.001)、α多樣性顯著降低。Chao1(t=5.222,P＜0.001)和Ace(t=4.926,P＜0.001)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,PPD 組的Shannon指數(shù)(t=1.686,P=0.098)和Simpson指數(shù)(t=1.183,P=0.241)均低于PPHC組,但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 α多樣性分析Fig.1 Analysis of α diversity

2.2.2 β多樣性分析 β多樣性是對不同組間進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較,本研究基于非加權(quán)UniFrac距離矩陣進(jìn)行了主坐標(biāo)分析。坐標(biāo)圖上距離越近的樣品,相似性越高,差異越小。如圖2所示,與PPHC組相比,PPD 組內(nèi)樣本分布更離散,而且兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)。

圖2 β多樣性PCoA主成分分析Fig.2 Analysis ofβdiversity PCo A principal components

2.2.3 微生物群落的物種分布差異 根據(jù)兩組在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)的物種分布繪制柱狀圖(圖3),計(jì)算不同的水平上兩組菌群的相對豐度差異。在門水平上,p-Planctomycetes 只存在于PPD組,而p-Epsilonbacteraeota只存在于PPHC組,但是它們在兩組中豐度均較低。p-Bacteroidetes和p-Firmicutes在PPD和PPHC中均為優(yōu)勢門,但是相比于PPHC組,PPD 組的p-Bacteroidetes升高,p-Actinobacteria降低。在屬水平上,g-Bacteroides的相對豐度在兩組中均最高,PPD組占32.221%,PPHC組占21.874%,但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。g-Ruminococcus(P=0.008)、g-Bifidobacterium(P=0.021)和g-Kineothrix(P=0.025)在兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.4 組間差異的顯著性分析 LEfSe(linear discriminant analysis effect size,線性判別分析)即LDA Effect Size分析,是一種發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具。為了進(jìn)一步研究兩組間豐度的差異并探討與PPD 相關(guān)的特定菌屬,本研究對兩組的糞便微生物組成進(jìn)行了LEfSe分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)29種細(xì)菌類群的相對豐度在兩組之間存在明顯差異(LDA score＞2.0,P＜0.05,圖4)。在PPD 組中,Acetanaerobacterium、Adlercreutzia、Allobaculum、Alloprevotella、Bifidobacterium、Christensenella、Escherichia、Eubacterium、Faecalicatena、Fusobacterium、Haemophilus、Intestinimonas、Lactobacillus、Megamonas、Monoglobus、Muribaculum、Oscillospira、Paraprevotella、Streptococcus、Raoultibacter、Ruminococcus、Stomatobaculum等菌屬顯著富集,而Kineothrix、Lachnoclostridium、Acinetobacter、Aquisphaera、Enterococcus、Mucispirillum在PPHC組中顯著富集,值得注意的是Kineothrix在PPD 組顯著富集(LDA score=4.124,P=0.001),但Bifidobacterium在PPHC中顯著富集(LDA score=4.126,P=0.026)。

圖4 PPHC組和PPD組患者樣本差異物種的LDA值分布圖Fig.4 The distribution of LDA values of the different species in PPHC group and PPD group

2.2.5 腸道菌群相對豐度與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 如圖5所示,腸道菌群相對豐度與臨床指標(biāo)的潛在關(guān)聯(lián)。根據(jù)冗余分析/典范對應(yīng)分析(RDA/CCA),研究年齡、BMI和EPDS得分和腸道微生物群的相關(guān)性,結(jié)果顯示年齡與Ruminococcus、Subdoligranulum等菌呈正相關(guān);BMI與Roseburia、Bacteroides、Lachnospira呈正相關(guān);EPDS 得分與Prevotella、Kineothrix、Alistipes呈正相關(guān),而與Lachnospira呈負(fù)相關(guān)。

圖5 腸道菌群的相對豐度與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Fig.5 Correlation between relative abundance of intestinal flora and clinical indicators

3 討 論

本研究共納入30例PPD者,30例產(chǎn)后非抑郁的產(chǎn)婦進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,與PPHC組相比,PPD組的α 多樣性降低,β 多樣性升高。門水平上,p-Planctomycetes 只存在于PPD組,而p-Epsilonbacteraeota 只存在于PPHC 組。p-Bacteroidetes 和p-Firmicutes在PPD和PPHC中均為優(yōu)勢門。但是相比 于PPHC組,PPD組的p-Bacteroidetes 升高,而p-Firmicutes和p-Actinobacteria降低。在屬水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),PPD 組中g(shù)-Ruminococcus和g-Bifidobacterium顯著降低,g-Kineothrix顯著升高。

近年來關(guān)于抑郁癥患者腸道菌群的研究日益增多,但結(jié)論差異較大。ZHOU等[11]對深圳地區(qū)的16例健康對照者和28例PPD 患者進(jìn)行了腸道微生物檢測,發(fā)現(xiàn)PPD組的β多樣性明顯大于對照組,α多樣性在兩組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,門水平分析發(fā)現(xiàn)PPD 組p-Firmicutes的比例高于對照組。HU 等[14]對抑郁癥的研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者的菌群多樣性降低。ZHENG等[15]發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者的腸道菌群與健康對照相比,α多樣性無顯著差異,而β多樣性顯著不同,Actinomycetes數(shù)量增多,Bacteroidetes數(shù)量減少。YANG等[16]通過宏基因組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn),Eubacterium 在重度抑郁的患者中降低。推測結(jié)果不一致可能與地域差異、飲食習(xí)慣、樣本量、測序平臺、樣本保存方法、藥物使用、疾病狀態(tài)等因素有關(guān)。研究表明,飲食對腸道微生物群有一定影響[17]。隨著緯度的增加,人群腸道內(nèi)的p-Firmicutes數(shù)量增多,p-Bacteroidetes相對減少[18]。因此,對不同地區(qū)的PPD患者腸道菌群進(jìn)行分析將有助于更好地解釋疾病的發(fā)生與發(fā)展,為臨床治療提供更大的支持。本研究集中于西北地區(qū)當(dāng)?shù)禺a(chǎn)婦,通過飲食結(jié)構(gòu)詢問,研究人群飲食結(jié)構(gòu)差異較小,排除飲食及地域?qū)τ谀c道菌群干擾,增加了研究結(jié)果的可靠性。

組間差異分析結(jié)果顯示,g-Ruminococcus,g-Bifidobacterium在PPD 組中顯著降低,而g-Kineothrix在PPD 組中升高。與CHEUNG 等[19]對腸道微生物與重度抑郁癥進(jìn)行的系統(tǒng)分析結(jié)果一致。Ruminococcus屬于革蘭氏陽性嚴(yán)格厭氧球菌,主要通過分解宿主消化系統(tǒng)的纖維素來產(chǎn)生乙酸酯、丙酸鹽以及具有抗炎效應(yīng)的丁酸鹽,具有穩(wěn)定腸道屏障、逆轉(zhuǎn)腹瀉、降低結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)、減少腎結(jié)石的功能。Bifidobacterium是人體腸道中最重要的正常菌群之一,對人體健康具有生物屏障、營養(yǎng)、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、改善胃腸道功能、抗衰老等多種重要的生理功能。PINTO-SANCHEZ 等[20]對腸易激綜合征患者的一項(xiàng)雙盲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相比于服用安慰劑,服用Bifidobacterium可以有效緩解患者的抑郁情緒,改善生活質(zhì)量。AIZAWA 等[21]對細(xì)菌qPCR 反應(yīng)研究也發(fā)現(xiàn),Bifidobacterium計(jì)數(shù)較低的個(gè)體在抑郁癥患者更常見。推測PPD 的發(fā)生與Ruminococcus、Bifidobacterium等腸道益生菌的降低有很大的關(guān)系。Kineothrix alysoides是從土壤中發(fā)現(xiàn)的一種厭氧桿菌,可以利用多種碳源產(chǎn)生丁酸[22]。目前尚不明確PPD 患者中Kineothrix alysoides顯著升高的原因,還需要更多的研究來驗(yàn)證本研究的發(fā)現(xiàn)。

本研究通過對腸道菌群相對豐度與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)EPDS得分與Prevotella、Kineothria、Alistipes呈正相關(guān),而與Lachnospira呈負(fù)相關(guān)。與CHEUNG 等[19]的研究結(jié)果一致。Prevotella增加機(jī)體的炎癥反應(yīng),Lachnospira可改善腸道菌群的分布,拮抗有害菌定植有關(guān),進(jìn)一步提示PPD的發(fā)生可能與腸道菌群改變所引起的一系列機(jī)體變化有關(guān),詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,PPD 的形成可能與腸道有益菌的減少引起的腸道菌群紊亂,進(jìn)而引起腸道功能失調(diào)有關(guān)。但是,本研究納入的患者數(shù)量較少,入組主要采取量表評估,僅代表抑郁狀態(tài),無法明確診斷抑郁癥,且對菌群紊亂與抑郁癥狀之間關(guān)系的機(jī)制探索不足。未來的研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,對PPD 患者進(jìn)一步詳細(xì)劃分,同時(shí)輔助基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),對于腸道菌群與PPD 表型及機(jī)制進(jìn)行深入挖掘,期待能為PPD 患者的臨床治療提供新的思路。