雙白蓮合劑中對香豆酸的含量測定及其抑制食管癌細(xì)胞生長的機(jī)制

鄭伊琳,姚笑睿,辛淑波,李慶南,黃國鑫

(汕頭市中心醫(yī)院,廣東汕頭 515000)

食管癌(esophagus cancer,EC)是我國居民臨床好發(fā)的惡性腫瘤類型之一。根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2018年全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,食管癌位列我國惡性腫瘤發(fā)病率的第5位,致死率位列第4位[1]。由于EC發(fā)現(xiàn)晚、致死率高及預(yù)后差等特點(diǎn),給我國國民的經(jīng)濟(jì)與人民健康造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。臨床上針對EC治療主要包括手術(shù)、放化療、靶向、免疫療法等,但由于基因、病理病因等個(gè)體差異,復(fù)發(fā)、耐藥及藥物毒副作用等仍然是困擾臨床治療的難題[2]。近年來,源于中藥的有效成分、有效部位以及復(fù)方中藥的制劑,因其安全有效、低毒副作用等優(yōu)點(diǎn),越來越受到重視。中藥制劑的使用,在多種癌癥的治療與輔助治療中日益普遍。

雙白蓮合劑為我院自主研發(fā)的院內(nèi)制劑(制劑批準(zhǔn)文號:粵z20070031),其組方含半枝蓮、白花蛇舌草、兩面針和白英,在本院已有20多年的使用記錄。雙白蓮合劑功效為祛瘀散結(jié)、消腫止痛、清熱解毒,臨床上廣泛用于多種癌癥的治療與輔助治療。通過近5年來該合劑1 041 例患者的使用與隨訪記錄發(fā)現(xiàn)(圖1),雙白蓮合劑主要使用患者為EC 患者(占比55.6%),可有效提高癌癥患者的生存率。但由于該合劑是我院早期申請生產(chǎn)使用的院內(nèi)制劑,在成分分析、質(zhì)量控制及其抗癌作用機(jī)制方面缺乏深入的研究。因此,完善雙白蓮合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和抗癌活性作用機(jī)制研究是其在臨床上安全有效地運(yùn)用的重要保障。在前期運(yùn)用高效液相串聯(lián)飛行質(zhì)譜的研究中發(fā)現(xiàn),雙白蓮合劑主要成分為對香豆酸(pcoumaric acid,PCA)、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏 酸(ferulic acid)和山柰素(kaempferitin)等。本研究以對香豆酸為研究對象,采用高效液相色譜法對其在雙白蓮合劑中的含量進(jìn)行分析測定,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)方法對其抑制食管癌細(xì)胞的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

圖1 我院近5年來雙白蓮合劑使用患者群的分布情況Fig.1 The distribution of patients treated with Shuang Bailian mixture in Shantou Central Hospital in recent 5 years

1 材料與方法

1.1 試劑

雙白蓮合劑為汕頭市中心醫(yī)院院內(nèi)中藥制劑,組成藥材為半枝蓮、白花蛇舌草、兩面針、白英(白毛藤)。半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草(批號:20180601),白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd)Roxb.的干燥全草(批號:20180601),兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根(批號:20180801),均購于廣東匯群中藥飲片股份有限公司;白英為茄科植物白英Solanum lyratumThunb.的干燥全草(批號:180801861),購于康美藥業(yè)股份有限公司。對香豆酸對照品(批號:B20335-20 mg;含量HPLC≥98%),購于上海源葉生物科技有限公司;順鉑(DDP,批號:601200663,江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司),乙腈、磷酸為色譜純;水為屈臣氏蒸餾水。KYSE30和KYSE140食管癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);細(xì)胞培養(yǎng)基為Gibco 100 mL/L胎牛血清含量的Hyclone 1640培養(yǎng)基;細(xì)胞株消化傳代采用Gibco胰酶;Cell Counting Kit 8(CCK8)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(博士德生物有限公司);cleaved caspase 3、cleaved P ARP、Bad、Bcl-2、p-PI3K 和p-AKT抗體(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司),KQ5200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),VORTEX-5渦旋混合器(其林貝爾儀器制造有限公司),PHS-3E pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司),ME204E電子分析天平(200 g/0.1 mg)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司],5418R高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國有限公司),1374II級A2型生物安全柜(賽默飛世爾科技有限公司),MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下公司),IX73熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司),TC-20 自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國伯樂公司),PowerPac 300電泳儀(美國伯樂公司),VCX130 Vibra cell超聲破碎儀(美國SONICS公司),Multiskan FC酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司),ChemiDoc超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.3 雙白蓮合劑中PCA的含量測定

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(25μm,4.6 mm×250 mm);0.45μm 微孔濾膜;流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0～33 min,10%A;33～40 min,10%→100%A;40～48 min,100%A);檢測波長:310 nm;進(jìn)樣量:20μL;流速:1.00 mL/min;柱溫:40℃。

1.3.2 對照品溶液的制備 取低溫干燥保存的對香豆酸對照品適量,精密稱定,加100 mL/L 乙腈溶液制成濃度為1 mg/m L 的對香豆酸對照品儲備液,即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取上述對照品儲備液適量置于量瓶中,再加100 mL/L乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為15、20、22.5、25、30、40μg/m L的混合對照品溶液,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 供試品溶液的制備 取雙白蓮合劑藥材粉末(半枝蓮∶白花蛇舌草∶兩面針∶白英=5∶5∶2∶2,過三號篩)約0.84 g,精密稱定,置具塞圓底燒瓶中,精密加入水10 mL,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,搖勻,濾過,取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下混合對照品溶液20μL,在“1.3.1”項(xiàng)下液相色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以峰面積A(y)對濃度C(x)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。

1.3.5 精密度試驗(yàn) 取對香豆酸對照品溶液,在“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。RSD 采用計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以算術(shù)平均值,用以評估試驗(yàn)精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取雙白蓮合劑供試品溶液,分別于在室溫處理配制后、4℃短期儲存、-20℃長期儲存和反復(fù)凍融循環(huán)后進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算峰面積的RSD。評估雙白蓮合劑供試品溶液中對香豆酸的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知對香豆酸含量的雙白蓮合劑藥材粉末各6 份(756μg/m L 原藥濃度,16.84μg/m L對香豆酸含量),精密稱定,分別加入已精密稱定的對香豆酸對照品(對香豆酸對照品含量98%,終濃度為13.7μg/m L),按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液、“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,根據(jù)公式:回收率=(C測-C樣)/C對香豆酸×100%,計(jì)算加樣回收率。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一濃度的雙白蓮合劑供試品溶液,共6份,在“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算峰面積的RSD,評估儀器性能。

1.3.9 雙白蓮合劑中對香豆酸的含量測定 精密稱定,按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定對香豆酸峰面積,按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法(對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=204 402x+360 904)計(jì)算對香豆酸的含量。

1.4 CCK8法檢測PCA的抗腫瘤活性

采用1640 培養(yǎng)基(100 mL/L 胎牛血清)培養(yǎng)KYSE30、KYSE140 食管癌細(xì)胞株,置于50 mL/L CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞株增殖至80%培養(yǎng)皿面后進(jìn)行傳代;將食管癌細(xì)胞接種于96孔板,共6組,每組6個(gè)復(fù)孔,以空白培養(yǎng)基為空白組,以未給藥食管癌細(xì)胞為對照組,采用培養(yǎng)基溶液配置分別含有1、5、12.5、25、50、100μg/m L 對香豆酸的細(xì)胞培養(yǎng)液,分別作用于對數(shù)生長期的KYSE30、KYSE140食管癌細(xì)胞,采用CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測藥物干預(yù)前后腫瘤細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞給藥培養(yǎng)48 h后加入CCK8溶液,培養(yǎng)箱避光孵育1 h后用酶標(biāo)儀檢測不同分組的食管癌細(xì)胞在450 nm 處吸光度,計(jì)算相對細(xì)胞存活率和相對細(xì)胞抑制率、半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),考察對香豆酸對食管癌細(xì)胞的抗腫瘤活性作用。

1.5 Western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

分別將KYSE30、KYSE140細(xì)胞傳代,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿80%后分別加入空白培養(yǎng)基、順鉑(100μg/mL)、對香豆酸(KYSE30和KYSE140細(xì)胞分別為36μg/mL和55μg/m L)、順鉑聯(lián)合對香豆酸溶液,加藥48 h后冰浴中加入細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑),待細(xì)胞充分裂解后收集細(xì)胞,置于微量離心管中12 000 r/min離心10 min,取上清液得腫瘤細(xì)胞總蛋白液。采用BCA 法測定細(xì)胞中蛋白含量,配平濃度制備蛋白樣品。配置120 mL/L分離膠、50 mL/L濃縮膠后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用70 V電壓待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓至100 V。出現(xiàn)完整Mark條帶后終止電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,根據(jù)檢測的蛋白分子量裁膜,分別用一抗鼠抗人β-actin、兔抗人cleaved caspase 3、兔抗人cleaved PARP、兔抗人Bad、兔抗人Bcl-2、兔抗人p-PI3K和兔抗人p-AKT,置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜,TBST洗膜3次(每次5 min以上),二抗孵育1 h,洗膜,化學(xué)發(fā)光成像,檢測。

1.6 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)

Nude小鼠,20只,雄性,體質(zhì)量為16～20 g,由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供,許可證號為SCXK(粵)2020-0054,飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心動物房。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃,濕度65%～70%,所有小鼠均可正常獲取食物和水。取對數(shù)生長期的KYSE30食管癌細(xì)胞,消化后用不完全培養(yǎng)液配成密度不低于107/m L的細(xì)胞懸液,于裸鼠右上肢皮下注射0.2 mL 細(xì)胞懸液。每日觀察腫瘤生長情況,待出瘤后,使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積,腫瘤體積=(D×d2)/2(D:腫瘤的長徑;d:腫瘤的短徑)。當(dāng)腫瘤體積為80～150 mm3時(shí),將裸鼠隨機(jī)分成4組,分別為模型對照組、順鉑(DDP)對照組、對香豆酸(PCA)組、DDP 聯(lián)合PCA 給藥組,每組5只。實(shí)驗(yàn)過程PCA 每2 d口服給藥1次,順鉑每3 d腹腔注射,連續(xù)30 d給藥。實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行數(shù)據(jù)測量和分析:每3d觀察測量裸鼠腫瘤生長情況,計(jì)算腫瘤相對體積,以每組動物移植瘤體積的平均值,繪制移植瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在超凈臺上對裸鼠進(jìn)行拍照,完整剝離腫瘤后拍照,用游標(biāo)卡尺對腫瘤的大小進(jìn)行測量,用電子天平稱量移植瘤重量。腫瘤組織剪碎后加入RIPA裂解液,加入少量玻璃珠,冰浴上超聲破碎處理10 s,靜止10 s,循環(huán)6次后4℃、12 000 r/min離心5 min,取上清即為腫瘤總蛋白,進(jìn)行后續(xù)Western blotting實(shí)驗(yàn)(條件同“1.5”項(xiàng))。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0、Graph Pad Prism7.0、和R 軟件處理。數(shù)據(jù)以mean±SD 表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),采用LSD 檢驗(yàn)或DunnettT3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。荷瘤小鼠移植瘤體體積變化采用R 軟件做重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙白蓮合劑主要成分PCA的含量測定方法建立

2.1.1 對照品及樣品HPLC圖譜 在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下,對香豆酸色譜峰的對稱性、分離度和理論塔板數(shù)均能滿足要求,對照品及樣品圖譜見圖2。

圖2 對香豆酸對照品和雙白蓮合劑的HPLC圖Fig.2 HPLC for p-coumaric acid and Shuang Bailian mixture

2.1.2 對香豆酸線性回歸分析 根據(jù)對照品溶液色譜圖,以峰面積A(y)對濃度C(x)進(jìn)行線性回歸,得對香豆酸回歸方程為y=204 402x+360 904,R2=0.995 0,結(jié)果表明,對香豆酸在15～40μg/m L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(圖3)。

圖3 對香豆酸的峰面積A(y)對濃度C(x)的線性回歸圖Fig.3 Linear regression diagram of peak area A (y)to concentration C(x)of p-coumaric acid

2.1.3 精密度試驗(yàn) 計(jì)算對香豆酸對照品溶液峰面積的RSD,結(jié)果顯示,對香豆酸峰面積的RSD為2.66%,表明儀器精密性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對香豆酸在室溫處理(24 h)、4℃短期儲存(72 h)、-20℃長期儲存(30 d)和反復(fù)凍融循環(huán)(3次)后的RSD 分別 為2.35%、3.22%、1.58%、4.08%,表明供試品溶液在前處理和貯存不同溫度環(huán)境下被測物的穩(wěn)定性良好,RSD 均小于5%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算雙白蓮合劑供試品溶液峰面積的RSD,結(jié)果顯示,6批樣品中對香豆酸峰面積的RSD 為4.01%,表明儀器重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)公式回收率=(C測-C樣)/C對香豆酸×100%,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表1。加樣回收率RSD 值為6.16%,表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

表1 雙白蓮合劑加樣回收率Tab.1 Recovery rate of Shuang Bailian mixture

2.1.7 雙白蓮合劑中對香豆酸的含量 按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法(對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=204 402x+360 904)計(jì)算雙白蓮合劑中對香豆酸的含量,將3批雙白蓮合劑樣品進(jìn)樣后峰面積分別為3 812 004、3 873 380、3 726 394 m AU×min,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算結(jié)果見表2。計(jì)算結(jié)果顯示,雙白蓮合劑含有對香豆酸16.84μg/m L。

表2 雙白蓮合劑中對香豆酸含量平均值Tab.2 The average value of coumaric acid in Shuang Bailian mixture

2.2 PCA 通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信號通路誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PCA 在食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE140的半數(shù)抑制率(IC50)分別為36μg/m L和55μg/m L(圖4A、圖4B)。KYSE30和KYSE140在分別接受DDP、PCA以及PCA 聯(lián)合DDP給藥48 h后,Western blotting結(jié)果顯示,DDP、PCA 以及PCA 聯(lián)合DDP可以有效地提高食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE140中cleaved caspase 3、cleaved PARP 以及Bad的蛋白表達(dá)。同時(shí),降低Bcl-2、p-PI3K 和p-AKT 的蛋白表達(dá)。說明PCA 可以通過癌細(xì)胞凋亡信號通路PI3K/AKT/Bcl-2的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生(圖4C-圖4F)。

2.3 PCA 通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信號通路抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長

裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給藥30 d后,空白對照組小鼠移植的瘤體持續(xù)增大,而DDP 組、PCA 組以及PCA 聯(lián)合DDP給藥組均可有效抑制荷瘤小鼠的移植瘤體的生長(圖5A-圖5C)。此外,通過對剝離的腫瘤組織進(jìn)行分析后,Western blotting結(jié)果顯示,DDP、PCA 以及PCA 聯(lián)合DDP 可以有效地提高 瘤體組織中cleaved caspase 3、cleaved PARP以及Bad的蛋白表達(dá)。同時(shí),降低瘤體組織中Bcl-2、p-PI3K和p-AKT 的蛋白表達(dá)。說明PCA 可以通過癌細(xì)胞凋亡信號通路PI3K/AKT/Bcl-2 的調(diào)節(jié)作用,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡信號通路的發(fā)生,進(jìn)而抑制荷瘤小鼠移植瘤體的生長(圖5D、圖5E)。

圖5 PCA通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Bcl-2凋亡信號通路抑制荷瘤小鼠移植瘤體生長Fig.5 PCA inhibited the growth of transplanted tumor in tumor-bearing mice by regulating PI3K/AKT/Bcl-2 apoptosis signaling pathway

3 討 論

對香豆酸存在于多種藥用植物以及水果和蔬菜中[3]。現(xiàn)有報(bào)道顯示,PCA 具有許多的藥理活性,主要包括抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗血小板聚集、保護(hù)心血管、預(yù)防和改善糖尿病及神經(jīng)保護(hù)作用[3-5]。雙白蓮合劑處方中的半枝蓮和白花蛇舌草等都含有該活性成分[6-7]。本課題前期采用高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜的研究中也發(fā)現(xiàn),該合劑中的主要成分包括PCA、咖啡酸、阿魏酸和山柰素等。本實(shí)驗(yàn)以對香豆酸為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的對象,采用高效液相色譜法建立雙白蓮合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可控,簡單可行,重現(xiàn)性好,可為雙白蓮合劑的鑒別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),也為雙白蓮合劑在臨床上進(jìn)一步的推廣應(yīng)用提供了重要保障。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物發(fā)揮抗癌活性的重要方式。PI3K/AKT/Bcl-2信號通路是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要通路[8-9]。癌基因Bcl-2(即B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)具有明顯抗細(xì)胞凋亡的作用。研究顯示,抑制Bcl-2蛋白的表達(dá),可上調(diào)Caspase-3和Caspase-9的表達(dá),激活內(nèi)源性線粒體外膜通透性,促使癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明,PCA 可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Bcl-2 凋亡信號通路,誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE140的凋亡,進(jìn)而有效抑制癌細(xì)胞的生長。此外,小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)也證明,PCA 可以有效抑制荷瘤小鼠移植腫瘤的生長,PCA可以誘導(dǎo)凋亡信號通路上相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。本研究進(jìn)一步豐富了雙白蓮合劑發(fā)揮抗癌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。