基于脂肪源性干細(xì)胞的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體的構(gòu)建及其對血管生成的抑制作用

朱 強 ,張斌斌 ,李瑞春 ,郭世文 ,梁晨

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西西安 710061;2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西延安 716000)

膠質(zhì)瘤是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的顱腦腫瘤,在接受手術(shù)+放療+輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案后,患者的預(yù)后仍不盡如人意[1]。血管生成在膠質(zhì)瘤的發(fā)生及進(jìn)展中扮演了十分重要的角色[2],因此抗血管生成治療被認(rèn)為是一種十分有前景的治療策略[3]。alphastatin肽是一種由24個氨基酸構(gòu)成的短肽,其來源于人纖維蛋白原α鏈氨基末端[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),alphastatin肽能夠在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成,并在動物模型中抑制膠質(zhì)瘤血管生成進(jìn)而抑制腫瘤生長[5]。脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一種來源于脂肪組織、具有間充質(zhì)及神經(jīng)譜系分化潛質(zhì)的干細(xì)胞,由于其對惡性腫瘤的靶向性,因而被認(rèn)為是腫瘤基因治療的良好載體[6]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上構(gòu)建基于ADSCs的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體,并對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步評估。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞、SHG44 膠質(zhì)瘤細(xì)胞、293T 細(xì)胞、HLF-1人成纖維細(xì)胞以及HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購于武漢Procell公司,ADSCs購于蘇州Cyagen公司。U87、SHG44及293T細(xì)胞使用含100 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Gibco)的DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng),HLF-1 及HUVEC 細(xì)胞使用含100 mL/L FBS的F12K 培養(yǎng)基(Procell)培養(yǎng)。ADSCs使用人脂肪源性干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(Cyagen)培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在50 mL/L CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 基于ADSCs的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體的構(gòu)建

慢病毒載體質(zhì)粒p LVX-mCMV-ZsGreen-IRESPuro購于Viraltherapy公司,由于單獨的alphastatin序列無法在哺乳動物細(xì)胞中有效表達(dá)和分泌,因此需要將人神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4(human neurotrophin-4,NT-4)信號肽序列和前導(dǎo)序列與alphastatin 肽序列融合(NT4-Al),從而實現(xiàn)alphastatin 肽的分泌表達(dá)[7]。由于alphastatin肽暫無可供檢測的抗體,因此在其序列末端加上FLAG 標(biāo)記序列便于檢測。包含NT4信號肽序列-alphastatin 肽序列-FLAG 標(biāo)記序列(NT4-Al-FLAG)融合基因片段的p UC57-NT4-alphastatin質(zhì)粒由Genscript公司設(shè)計并合成。NT4-Al-FLAG 序列被克隆進(jìn)p LVX-mCMV-ZsGreen-IRES-Puro中并經(jīng)過酶切分析及測序鑒定。使用慢病毒包裝試劑盒(Viraltherapy)通過轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞構(gòu)建alphastatin慢病毒表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染48h后收集含慢病毒的上清液。隨后用alphastatin慢病毒感染ADSCs細(xì)胞,獲得能夠表達(dá)alphastatin肽的膠質(zhì)瘤靶向載體(Al-ADSCs)(MOI=20)。

1.3 檢測轉(zhuǎn)染后ADSCs的干細(xì)胞表面標(biāo)志物

利用流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物評估慢病毒轉(zhuǎn)染是否影響ADSCs的生物學(xué)特征?；贏DSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體(Al-ADSCs)及普通ADSCs以5×105/孔接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)48 h。隨后收集細(xì)胞并用0.1 mL 含有5 mL/L 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS)重懸。分別加入APC標(biāo)記抗人CD13抗體(biolegend)、APC標(biāo)記抗小鼠/人CD44抗體(biolegend)、PE/Cyanine7 標(biāo)記抗人CD90(Thy1)抗體(biolegend)及PE標(biāo)記抗人CD105(Endoglin)抗體(eBioscience),4℃孵育30 min。細(xì)胞用含5 mL/L BSA 的PBS沖洗2次后,加入0.2 mL PBS制備單細(xì)胞懸液并上機檢測。

1.4 Western blotting檢測基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體(Al-ADSCs)中alphastatin肽的表達(dá)

由于alphastatin肽暫無可供檢測的抗體,因此alphastatin肽的表達(dá)通過檢測FLAG 標(biāo)簽的表達(dá)水平間接實現(xiàn)?？偟鞍椎奶崛〖癢estern blotting檢測方法同參考文獻(xiàn)[8]所述。一抗:山羊抗FLAG 標(biāo)簽抗 體(1∶1 000;abcam)、兔 抗GAPDH抗體(1∶5 000;Bioworld);二抗:HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000;博士德)、HRP 標(biāo)記兔抗山羊IgG 抗體(1∶5 000;博士德)。

1.5 Al-ADSCs分泌alphastatin肽的測定

通過FLAG 標(biāo)記蛋白ELISA 試劑盒(biovision)進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染后48 h,取各組ADSCs 培養(yǎng)液,3 000 r/min離心20 min,取離心后上清液按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.6 CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)流式細(xì)胞儀分選

收集常規(guī)培養(yǎng)的U87及SHG44細(xì)胞并用1 mL含5 mL/L BSA 的PBS重懸并加入EP 管中,每管1×106個細(xì)胞。4℃下1 500 r/min離心3 min,用含5 mL/L BSA 的PBS沖洗1次,隨后加入CD133抗體(Invitrogen)4℃孵育30 min。細(xì)胞用含5 mL/L BSA 的PBS沖洗2次并重懸后運用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。

1.7 GSCs體外趨向性的評估

采用細(xì)胞遷移實驗進(jìn)行分析。將CD133+GSCs、CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞或HLF-1細(xì)胞接種在24孔板中,常規(guī)培養(yǎng)過夜,然后將Al-ADSCs及普通ADSCs(3×105/m L)接種于帶有8μm 微孔PET膜的Transwell小室(BD Bioscience)中,放置在24孔板中與下室細(xì)胞常規(guī)共培養(yǎng)過夜。隨后Transwell 小室在4℃下用700 mL/L乙醇溶液固定1 h,并用5 g/L結(jié)晶紫染色。擦去位于小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡(IX51,Olympus)下對遷移細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)(×200)。

1.8 體外血管生成的評估

Al-ADSCs對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響通過體外管腔形成實驗進(jìn)行評估。將Matrigel基質(zhì)膠(Corning)于4℃靜置24 h,隨后以0.1 mL/孔鋪于24孔板中,-20℃預(yù)冷10 min,隨后于37℃孵育30 min。HUVECs(1.5×105/孔)接種于Matrigel基質(zhì)膠上,37℃常規(guī)培養(yǎng)2.5 h。將Al-ADSCs及ADSCs細(xì)胞懸液(3×105/mL)分別接種于薄膜孔徑0.4μm的Transwell小室(BD)中(200μL/孔),隨后將Transwell小室放入接種了HUVECs的24 孔板中共培養(yǎng),37℃常規(guī)孵育8 h。在光學(xué)顯微鏡(IX51;Olympus)下對內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔進(jìn)行觀察及計數(shù)(×100),具體方法同參考文獻(xiàn)[9]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以xˉ±s表示。采用單因素方差分析檢驗Al-ADSCs、ADSCs對GSCs的遷移細(xì)胞數(shù)量以及各組HUVECs體外血管形成數(shù)量等指標(biāo)是否存在差異,進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體特征鑒定

如圖1中所示,在Al-ADSCs中可檢測到FLAG標(biāo)記蛋白表達(dá)(圖1A),這表明Al-ADSCs能夠表達(dá)alphastatin肽,而普通ADSCs無alphastatin肽表達(dá)。此外,在Al-ADSCs培養(yǎng)基上清液中可檢測到FLAG標(biāo)記,質(zhì)量濃度為(54.65±5.63)mg/L(圖1B),表明Al-ADSCs具有分泌alphastatin肽的功能。與ADSCs相比,Al-ADSCs中的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)表面標(biāo)志物如CD13、CD44、CD90和CD105的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1C),表明alphastatin慢病毒轉(zhuǎn)染對Al-ADSCs的干細(xì)胞特征沒有明顯影響。

圖1 基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體特征的鑒定Fig.1 Characterization of the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector

2.2 基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體對GSCs的趨向性

如圖2所示,通過流式細(xì)胞儀從U87和SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離出CD133+GSCs(圖2C)。細(xì)胞遷移實驗表明,與普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞相比,ADSCs及Al-ADSCs對GSCs的趨向性更加明顯,ADSCs對于SHG44、U87、HLF-1、GSCs SHG44、GSCs U87的遷移細(xì)胞數(shù)分別為66.87±3.06、77.20±1.59、32.93±1.42、100.13±0.50、109.47±2.55,Al-ADSCs則分別為68.13±2.20、76.33±2.14、30.87±1.50、99.33±1.17、106.67±2.41,不同目標(biāo)細(xì)胞組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A、圖2B,P＜0.01)。ADSCs及Al-ADSCs在GSCs趨向性上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B,P＞0.05),這表明轉(zhuǎn)染alphastatin慢病毒后,基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體(Al-ADSCs)仍保留與普通ADSCs相同的GSCs趨向性。

圖2 基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體對GSCs趨向性鑒定Fig.2 The identification of GSCs tropism by the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector

2.3 Al-ADSCs在體外對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響

如圖3所示,管腔形成實驗中,Al-ADSCs可以抑制體外HUVECs介導(dǎo)的血管生成,管腔計數(shù)示空白對照組(13.33±0.76)個/HPF,ADSCs組(19.40±1.71)個/HPF,Al-ADSCs組(7.27±0.31)個/HPF,與空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 基于ADSC的alphastatin肽膠質(zhì)瘤靶向載體對內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成的抑制Fig.3 Inhibition of ECs angiogenesis by the ADSC-based alphastatin peptide glioma targeting vector in vitro

3 討 論

目前已經(jīng)證實,alphastatin肽對多種類型的腫瘤如胃癌[10]、乳腺癌[11]、膠質(zhì)瘤[5,12]等都具有抗腫瘤作用,這主要是通過其抗血管生成作用實現(xiàn)的。Alplastatin肽不僅可以抑制腫瘤新生血管生成,也能引起現(xiàn)有腫瘤血管的退化[12]。本課題組前期研究中使用慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞來表達(dá)alphastatin肽[5,12]。研究發(fā)現(xiàn),重組慢病毒介導(dǎo)的alphastatin基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著抑制膠質(zhì)瘤生長和腫瘤血管生成[5,12]。但是,要最大限度地將alphastatin的抗腫瘤作用應(yīng)用于臨床實踐,還必須找到一種合適的藥物傳遞方式。

近年來,藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery system,DDS)在提高藥物療效方面顯示出極大的潛力。DDS能夠顯著增強藥物的藥理作用,同時減少其副作用[13]。與傳統(tǒng)的DDS 相比,以細(xì)胞為載體的DDS具有許多的優(yōu)勢,如在體內(nèi)血液循環(huán)中可維持較長的作用時間,具有豐富的表面配體,具有腫瘤靶向性,易于通過血腦屏障等生物屏障[14]。ADSCs便是其中一種細(xì)胞載體DDS。ADSCs具有易于制備、可供自體移植、便于進(jìn)行基因修飾等特點,被認(rèn)為是一種良好的膠質(zhì)瘤靶向DDS[15]。

本研究使用慢病毒載體感染ADSC 以構(gòu)建Al-ADSCs。結(jié)果表明,經(jīng)alphastatin慢病毒轉(zhuǎn)染并不會影響ADSCs的干細(xì)胞特征及其對GSCs的趨向性。同時,Al-ADSCs可以成功表達(dá)和分泌alphastatin 肽。這些結(jié)果表明,Al-ADSCs 已經(jīng)初步構(gòu)建成功。

隨后,我們研究了Al-ADSCs對體外內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響。結(jié)果表明,基于Al-ADSCs在體外能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。前期研究表明,alphastatin肽抗血管生成的機制主要是通過在血管生成的初始階段阻斷C-JUN N-末端激酶(JNK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化[5],從而影響內(nèi)皮細(xì)胞膜上VE-cadherin 的功能,進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化[12]。另有學(xué)者證實,alphastatin肽可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞鞘氨醇激酶(SPK)活性并減少鞘氨醇1-磷酸鹽(S1P)產(chǎn)生,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[10]。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)ADSCs能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成,這與之前的報道相一致[16-17]。而在alphastatin肽存在的情況下,ADSCs的這種對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的促進(jìn)作用被抑制。ADSCs對內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)作用主要是通過其外泌體中多種促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等實現(xiàn)的[17],而alphastatin肽能夠抑制VEGF或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及分化,這可能是alphastatin肽能夠抑制ADSCs對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成促進(jìn)作用的機制之一,其具體機制有待進(jìn)一步研究。

總之,本研究成功構(gòu)建了Al-ADSCs,并在體外初步證實了其對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的抑制作用。在后續(xù)研究中,將在膠質(zhì)瘤動物模型中進(jìn)一步驗證這一靶向載體的膠質(zhì)瘤趨向性及其抗腫瘤作用。