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    新疆牛源和人源產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌毒力島的分布

    2022-11-08 03:05:52佟盼盼陳文霞王芋丹張萌萌張毅鄭曉風劉璐瑤蘇戰(zhàn)強謝金鑫
    動物醫(yī)學(xué)進展 2022年11期
    關(guān)鍵詞:牛源人源毒力

    佟盼盼,陳文霞,王芋丹,張萌萌,張毅,鄭曉風,劉璐瑤,蘇戰(zhàn)強,謝金鑫

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

    產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)是與人類出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis,HC)和溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)相關(guān)的食源性病原體[1]。牛和牛肉制品是其主要宿主和傳染源。STEC每年在全世界引起病例數(shù)多達280萬[2]。雖然O157∶H7 STEC是最常報道的血清型,但目前的研究表明,非O157 STEC感染的病例數(shù)有時超過O157 STEC[3]。

    細菌的毒力決定簇主要由移動基因編碼或與遺傳元件相關(guān),如噬菌體、質(zhì)粒、插入元件或轉(zhuǎn)座子。大量毒力決定簇位于毒力島(pathogenicity islands,PAIs)上,可以在不同細菌物種之間交換,并通過選擇壓力組裝和穩(wěn)定,發(fā)生致病性變異[4]。越來越多的證據(jù)表明,致病菌株和非致病菌株的毒力差異不同程度歸因于PAIs上的基因差異[5]。一些致病大腸埃希氏菌利用Ⅲ 型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS),編碼在PAI腸細胞脫落位點(locus of enterocyte effacement,LEE)上,將廣泛的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移到宿主細胞,以破壞細胞信號級聯(lián),促進細菌定植[6]。編碼T3SS基因位于LEE中并分散于染色體各處[6]。在感染人類的致病菌株中除了確定位于LEE上的基因以外,還鑒定到大量的非LEE效應(yīng)基因(non-LEE encoded effectorsnles)位于其他PAIs上,這些基因參與宿主細胞內(nèi)的各種功能,有助于細菌在腸道中定植和毒性,包括抗凋亡活性,破壞宿主固有免疫反應(yīng),增加細胞膜通透性、阻斷細胞分裂、破壞微管細胞骨架和抑制吞噬等[7]?;趎le基因含量檢測的分子風險評估已被用于預(yù)測STEC菌株對人類健康是否構(gòu)成重大風險[8-11]。

    STEC的致病性主要歸因于其攜帶的多個毒力基因組島,如STX(志賀毒素)、LEE PAI和Hly(溶血素),除此之外,一些非LEE基因組O島(O-island,OI)也與細菌毒力相關(guān),如OI-57、OI-71及OI-122與人類暴發(fā)HC和HUS相關(guān)[8-9,11-12]。

    目前,除了LEE以外,關(guān)于STEC的其它PAIs的研究很少?;赑AIs可以作為區(qū)分強毒株和弱毒株的標記,本研究擬調(diào)查OI-36、OI-57、OI-71和OI-122在新疆牛源和人源STEC中的分布和流行情況,以預(yù)測牛源STEC感染人的風險。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株來源 受試菌株為2017年-2021年本實驗室(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床實驗室)保存的139株牛源非O157 STEC[13-14]和3株人源非O157 STEC(來自2019年臨床腹瀉樣本,由烏魯木齊市沙依巴克區(qū)疾病預(yù)防控制中心惠贈)。142株STEC有34株僅攜帶stx1,24株僅攜帶stx2,84株同時攜帶stx1和stx2,9株eae+。用含有終濃度150 mL/L甘油的生理鹽水保菌并儲存于-80℃,從最初分離限次傳代以確保其遺傳穩(wěn)定性。

    1.1.2 主要試劑 Thermo PCR反應(yīng)試劑(2×TaqPCR Green Mix)、Gelgreen(Biotium),中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品;E.coli營養(yǎng)肉湯(EC肉湯)、麥康凱培養(yǎng)基(MAC),中國青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

    1.1.3 主要儀器 PCR儀(TC1000-G),美國SCILOGEX公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6D),中國北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠電泳成像系統(tǒng),美國Bio-Red公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 引物合成 參考文獻[8]合成OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD),OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2),OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2),OI-122(ent/espL2、nleB和nleE)基因的引物;參考文獻[12]合成IO-122上的4個特定基因Z4321、Z4326、Z4332和Z4333的引物(表1),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,按說明書稀釋后保存于-20℃冰箱備用。

    1.2.2 毒力島OI-36、OI-57、OI-71和OI-122的PCR擴增 使用細菌DNA提取試劑盒提取142株受試菌的基因組DNA,利用PCR方法進行PAIs OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD);OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2);OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2);OI-122(ent/espL2、nleB和nleE)基因檢測,PCR反應(yīng)體系:12.5 μLTaqMaster Mix,1 μL細菌DNA模板,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,加入ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性10 s,55℃退火1 min,72℃ 1 min 30個循環(huán);72℃延長10 min。根據(jù)擴增基因的不同,調(diào)整退火溫度,參數(shù)見表1。

    表1 本研究中編碼OI毒力基因的引物序列

    1.2.3 OI-122特定基因的PCR擴增 利用PCR擴增IO-122上的4個特定基因Z4321、Z4326、Z4332和Z4333。根據(jù)Karmali M A提出的模塊化方式分析檢測結(jié)果,同時檢出這4個基因為完整的OI-122(COI-122),檢出1個~3個基因為不完整的OI-122(INC),4個基因都未檢出,表明不存在OI-122(ABS);進一步劃分為模塊1(Z4321)、模塊2(nleB、nleE、ent/espL2和Z4326)和模塊3(Z4332、Z4333),每個模塊至少檢測出1個基因標記即可判斷存在OI-122[12]。

    2 結(jié)果

    2.1 編碼OI單個毒力基因的檢出情況

    在142株非O157 STEC中編碼OI單個毒力基因的檢出頻率不同,牛源和人源STEC均不同程度攜帶20種OI毒力基因,但有24株未攜帶其中任意一種,單個毒力基因中nelG9(OI-71)檢出率最高,為63%;Z4321和Z4326(OI-122)次之,分別為33%和36%;nleC(OI-36)檢出率最低,為1%。這2株菌均為人源分離株。

    2.2 編碼OI的毒力譜分布

    編碼OI的毒力譜的分布,(a)OI-36有6種毒力譜,其中nleD+nleH1-1組合最多,占40%;(b)OI-57有4種毒力譜,其中nleG2-3+nleG5-2組合最多,占43%;(c)OI-71有11種毒力譜,nleG9最多,占83%;(d)OI-122顯示7種毒力譜,其中Z4321最多,占43%。OI-122由位于島上不同區(qū)域的7個標記基因確定,在142株受試菌株中,84株(59%)至少攜帶1種OI-122毒力基因,9株為eae+。

    2.3 編碼OI-122毒力基因的模塊化分析

    OI-122的特定基因PCR擴增結(jié)果顯示,142株受試菌株中有83株(58%)攜帶不完整的OI-122,58株攜帶1種毒力基因,25株攜帶2種~3種毒力基因,59株(42%)不存在OI-122。模塊1、模塊2和模塊3分別出現(xiàn)在33%、37%和6%的菌株中。

    2.4 編碼OI毒力基因與eae和stx關(guān)系分析

    142株受試菌,攜帶編碼OI毒力基因在11種以上(包含11種)的菌株有10株,如表2所示,9株為eae+菌株,其中有6株eae+菌株至少攜帶14種編碼OI毒力基因,且均攜帶stx1基因,表明編碼OI-36、OI-57、OI-71和OI-122的毒力基因與eae+STEC高度相關(guān)。

    表2 攜帶11種以上編碼OI毒力基因的非O157 STEC

    3 討論

    本研究首次在國內(nèi)牛源和人源非O157 STEC上調(diào)查PAIs的分布。單個編碼OI毒力基因的檢測結(jié)果與Soledad-Cadona等的檢測結(jié)果相比[6],相同之處在于nleC(OI-36)的檢出率都很低(分別為1%和2%),本研究中2株攜帶nleC的STEC來自于人,Soledad-Cadona等檢出的4株中有3株也來源于人[6];不同之處在于本研究發(fā)現(xiàn)nleG9(OI-71)的檢出率最高(63%),而Soledad-Cadona等發(fā)現(xiàn)Z4321(OI-122)的檢出率最高(61%)[6]。雖然我們了解NleG蛋白為泛素連接酶,但對nleG9的確切功能還不清楚。通過分析每種OI毒力譜分布發(fā)現(xiàn)在非O157 STEC中有多種編碼OI毒力基因的缺失,這印證了Soledad-Cadona等的假設(shè),PAIs在STEC中可能不穩(wěn)定[6]。

    位于PAIs上的毒力基因可用于識別新出現(xiàn)的致病菌[12,15-16]。已有研究表明,同時檢出eae、ent/espL2、nleB、nleE和nleH1-2的STEC菌株對人的毒性更高[11]。nleB和nleE是NF-KB通路的抑制因子,nleB通過阻止免疫調(diào)節(jié)因子NF-κB易位至細胞核進而抑制宿主細胞的炎癥反應(yīng),并拮抗死亡受體誘導(dǎo)感染的細胞凋亡[17]。本研究中9株eae+菌株(6株牛源+3株人源)攜帶了11種及以上編碼OI的毒力基因,值得注意的是,eae、ent/espL2、nleB、nleE和nleH1-2同時存在于4株牛源和1株人源STEC菌株中,表明eae+且同時攜帶多種編碼OI毒力基因的非O157 STEC潛在感染人的風險。24株未攜帶任何被檢基因,且均為eae-,表明eae-菌株,似乎更容易缺乏OI基因。

    已有研究表明COI-122陽性菌株與HUS暴發(fā)相關(guān)[10,18-19],LEE的核心區(qū)域缺乏可能與移動遺傳元件相關(guān),有研究指出OI-122的核心區(qū)域包含幾個與移動遺傳元件相關(guān)的基因[14],可能導(dǎo)致OI不如LEE穩(wěn)定。本研究中142株STEC中均未攜帶完整的COI-122,可能與其核心區(qū)域的遺傳元件相關(guān),還需進一步研究確認。

    本研究發(fā)現(xiàn)PAIs在牛源和人源非O157 STEC上分布不同,PAIs與eae+菌株關(guān)系密切。與牛源STEC相比,腹瀉患者源STEC攜帶的編碼PAIs的毒力基因更豐富,部分牛源STEC同人源分離株攜帶同種編碼PAIs的毒力基因,提示其潛在感染人的風險。

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