• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)技術(shù)和方法的研究進(jìn)展

    2022-11-08 12:35:04姜桂來(lái)郁舒陽(yáng)俞莞茜周宇軒周哲敏
    中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:耐藥性測(cè)序抗生素

    姜桂來(lái), 郁舒陽(yáng), 俞莞茜, 周宇軒, 周哲敏, 李 恒

    抗生素的過(guò)度使用加速了細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。2017年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布對(duì)人類(lèi)健康最具威脅的12種“超級(jí)細(xì)菌”,表明細(xì)菌抗生素耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。2022年Lancet發(fā)布的最新研究指出,2019年全球有127萬(wàn)例患者死亡和抗生素耐藥直接相關(guān);約495萬(wàn)例因耐藥菌感染病逝[2]。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延,是當(dāng)今人類(lèi)社會(huì)三大死亡原因之一[3]。因此,對(duì)于細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)刻不容緩。最近研究表明,在中國(guó)爆發(fā)的多重耐藥細(xì)菌中,以沙門(mén)菌為代表的腸桿菌廣泛攜帶blaOXA-1、blaTEM-1和β-內(nèi)酰胺酶等細(xì)菌耐藥性基因[4]。此外,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌以及鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性也是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的最重要原因之一[5-8]。根據(jù)我國(guó)2014至2019年及2022上半年的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告(www.chinets.com)顯示,耐藥性大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為我國(guó)臨床主要耐藥菌[9]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率雖有下降趨勢(shì),但仍然在30%或以上;碳青霉烯類(lèi)耐藥革蘭陰性菌的檢出率仍保持高位,監(jiān)測(cè)顯示第三代頭孢菌素耐藥腸桿菌目細(xì)菌已流行傳播。多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和快速擴(kuò)散正在將人類(lèi)逐步推向“后抗生素時(shí)代”。鑒于此,細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)、新型細(xì)菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用迫在眉睫。臨床上多重耐藥細(xì)菌的檢測(cè)中,抗生素敏感性試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility testing,AST)是目前較常使用的方法,包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。隨后出現(xiàn)了物理、化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),如應(yīng)用流式細(xì)胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等方法推算細(xì)菌的耐藥性;以及免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)等檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因。如今,隨著測(cè)序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐藥檢測(cè)領(lǐng)域,包括全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)、宏基因組測(cè)序(metagenomics sequencing,mNGS)和微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(microbial-single-cell RNA sequencing,MscRNA-seq)等技術(shù)。基于上述檢測(cè)技術(shù)和方法,本文闡述了各類(lèi)細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)的原理、優(yōu)點(diǎn)和局限性,并對(duì)經(jīng)典技術(shù)和新技術(shù)的關(guān)聯(lián)性及應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行分析,為我國(guó)細(xì)菌耐藥性的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供相關(guān)技術(shù)支持。

    1 基于經(jīng)典方法的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)

    臨床對(duì)于細(xì)菌AST多采用表型檢測(cè)的方法,按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)或者歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)(European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing,EUCAST)頒布的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行。國(guó)內(nèi)外臨床和實(shí)驗(yàn)室常使用的AST包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。此類(lèi)經(jīng)典方法檢測(cè)時(shí)間在18~24 h,常用于臨床耐藥菌株的表型篩查。其優(yōu)點(diǎn)在于便捷、靈敏、可重復(fù)、成本低。但此類(lèi)方法僅限于細(xì)菌耐藥性的表型檢測(cè),無(wú)法檢測(cè)耐藥基因。

    1.1肉湯稀釋法 肉湯稀釋法是細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的傳統(tǒng)方法。肉湯稀釋法一般包括肉湯微量稀釋法和肉湯宏量稀釋法,前者96孔微量板中抗菌藥物稀釋液體積通常是每孔0.1 ml,后者每個(gè)含不同濃度抗菌藥物的測(cè)試管中肉湯體積為≥1 ml(通常為2 ml)。微量肉湯稀釋法是目前已視為藥敏試驗(yàn)的國(guó)際參考方法(CLSI),其主要優(yōu)點(diǎn)在于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的全球標(biāo)準(zhǔn)化,接種和判讀的過(guò)程簡(jiǎn)單,且可同時(shí)對(duì)單株菌株進(jìn)行多種抗菌藥物的測(cè)試。但其缺點(diǎn)在于最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的誤差較大,存在一定的技術(shù)可變性,對(duì)操作者實(shí)驗(yàn)技能和無(wú)菌意識(shí)要求較高。而肉湯宏量稀釋法是一種易于標(biāo)準(zhǔn)化、可靠的標(biāo)準(zhǔn)參考方法,對(duì)以研究為目的或測(cè)試一種藥物對(duì)一株細(xì)菌的MIC值的判讀具有較大的價(jià)值和意義。

    1.2瓊脂稀釋法 標(biāo)準(zhǔn)化的瓊脂稀釋法是將一種抗菌藥物與瓊脂培養(yǎng)基混合,每塊平板中含有不同濃度的藥物,再將接種物單獨(dú)或者同時(shí)點(diǎn)種在瓊脂表面,培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落形成單位(colony forming unit,CFU)。此外還可以接種到顯色瓊脂培養(yǎng)基,針對(duì)敏感菌株在18~24 h內(nèi)出現(xiàn)的顏色反應(yīng),更快地檢測(cè)和篩查相關(guān)耐藥細(xì)菌。此類(lèi)方法適用于多細(xì)菌的培養(yǎng)物,可用來(lái)區(qū)分菌株和物種[10]。瓊脂稀釋法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低,其測(cè)定的MIC值穩(wěn)定、可靠。

    1.3紙片擴(kuò)散法 紙片擴(kuò)散法也稱(chēng)為Kirby-Bauer(K-B)抗生素試驗(yàn)。藥敏片中的抗生素在瓊脂中呈放射狀擴(kuò)散,藥物濃度隨離培養(yǎng)基距離的增加呈對(duì)數(shù)下降,并在培養(yǎng)基周?chē)纬蓤A形生長(zhǎng)抑制區(qū),其直徑與MIC呈反比。區(qū)域的直徑顯示了分離物的敏感性和藥物通過(guò)瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散速率[11]。這種方法只能定性檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性,無(wú)法得到MIC值。但是該方法簡(jiǎn)便、可重復(fù),無(wú)需昂貴的設(shè)備支持。

    1.4濃度梯度法 Epsilometer testing即E-test,是檢測(cè)細(xì)菌對(duì)于某種抗生素的耐藥性的濃度梯度方法。E-test法使用一面是固定有一系列預(yù)先制備的、濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋的抗菌藥物;另一面是有濃度刻度的MIC值的塑料條。將條帶放置在預(yù)先接種的瓊脂平板上,過(guò)夜培養(yǎng),即可出現(xiàn)橢圓形抑制區(qū),其抑制區(qū)與條帶邊緣之間的交點(diǎn)就是MIC。由于E-test條帶上的抗生素濃度梯度穩(wěn)定,所以該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確,可以讀取具體的MIC值,但此方法較上述傳統(tǒng)方法使用較少[12]。

    2 基于理化性質(zhì)及分子生物學(xué)技術(shù)的細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)

    隨著物理、化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了各類(lèi)新型細(xì)菌耐藥性檢測(cè)技術(shù),如流式細(xì)胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等技術(shù)手段檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性;或應(yīng)用免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)等檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因。此類(lèi)基于細(xì)菌理化性質(zhì)和分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法,檢測(cè)時(shí)間在2~10 h,其省時(shí)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),適用于病原體臨床現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。但相較于傳統(tǒng)方法,無(wú)法提供MIC值。部分技術(shù)如拉曼光譜尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索,基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用存在一定差距。

    2.1基于培養(yǎng)的微流控圖像檢測(cè)技術(shù) 微流控技術(shù)是一種以在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行樣品處理、反應(yīng)、檢測(cè)等復(fù)雜操作為主要特征的科學(xué)技術(shù)。在微流控檢測(cè)方面,Choi等[13]研究人員用瓊脂糖構(gòu)建了一個(gè)微流體瓊脂糖通道,通過(guò)顯微鏡觀(guān)察和追蹤通道內(nèi)單細(xì)菌在抗生素作用下的生長(zhǎng)情況和表型,經(jīng)圖像對(duì)比確定細(xì)菌耐藥性和MIC值。微流控圖像檢測(cè)技術(shù)在單細(xì)胞水平上將細(xì)菌限制在很小的體積中,可以最大限度地減少交叉污染,潛在地加速生化反應(yīng)并使分離條件下標(biāo)志物的濃度迅速增加。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于所需樣本量少、靈敏度高,并提供自動(dòng)化和高通量分析[14]。

    2.2基于飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)方法 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是當(dāng)下物種鑒定較流行的方法。而MALDI Biotyper(MBT)是一種基于MALDI-TOF MS的微生物快速鑒定系統(tǒng),可在幾分鐘內(nèi)對(duì)微生物進(jìn)行無(wú)偏鑒定。MBT耐藥性檢測(cè)包括抗菌藥物耐藥性的選擇性檢測(cè)(MBT-STAR)、β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)(MBT-STAR-BL)、抗菌藥物敏感性快速檢測(cè)(MBT-ASTRA)和耐藥性檢測(cè)(MBT-RESIST)等方法。其中,MBT-STAR-BL原理是通過(guò)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素被產(chǎn)酶菌株水解而引起的分子量變化從而確定菌株耐藥情況。配備MBT-STAR-BL模塊的MBT系統(tǒng)能夠同時(shí)快速鑒定細(xì)菌種類(lèi)以及血液培養(yǎng)菌株的β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的耐藥性[15];而MBT-ASTRA通過(guò)計(jì)算和生長(zhǎng)在含有抗生素或不含抗生素的細(xì)菌光譜曲線(xiàn)下面積(area under the curve,AUC)并比較AUC大小以評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng),可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到敏感菌株和耐藥菌株之間的差異。最近一項(xiàng)研究?jī)?yōu)化了MBT-ASTRA,已成功應(yīng)用于白念珠菌和光滑念珠菌等酵母菌的敏感性檢測(cè)[16]。MBT-RESIST基于非放射性同位素標(biāo)記介質(zhì),使細(xì)菌在含有12C或者13C碳組分的培養(yǎng)基中平行生長(zhǎng),并將含抗生素同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌與在無(wú)抗生素標(biāo)記的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)菌質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比較。耐藥細(xì)菌可以在含有13C的抗生素中生長(zhǎng),導(dǎo)致質(zhì)譜中峰向更高的m/z移動(dòng),進(jìn)而通過(guò)峰位的移動(dòng)來(lái)判定耐藥性。Sparbier等[17-18]通過(guò)13C標(biāo)記的賴(lài)氨酸培養(yǎng)基來(lái)測(cè)試金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林和頭孢西丁的耐藥性。MBT-RESIST和MBT-ASTRA理論上應(yīng)用于所有種類(lèi)的抗生素和微生物,但仍存在微生物培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、需要摸索抗生素使用條件等缺點(diǎn),需要進(jìn)一步優(yōu)化。

    2.3其他光譜學(xué)圖像檢測(cè)法 其他光譜學(xué)檢測(cè)方法包括了表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)、拉曼光譜等物理化學(xué)技術(shù)方法。其中拉曼光譜通過(guò)特定的光譜模式識(shí)別,可以快速、高效地識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞和抗生素耐藥性。但通常臨床樣品中細(xì)菌濃度低,所以對(duì)臨床細(xì)菌病原體進(jìn)行拉曼光譜的研究需要在瓊脂平板中培養(yǎng)[19]。相反的,表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)可以促進(jìn)細(xì)菌病原體的無(wú)培養(yǎng)鑒定。最近一項(xiàng)研究中將SERS作為一種無(wú)創(chuàng)且無(wú)標(biāo)記的方法,通過(guò)計(jì)算分析將碳青霉烯類(lèi)敏感肺炎克雷伯菌(carbapenem-susceptibleKlebsiellapneumoniae,CSKP)菌株與碳青霉烯類(lèi)耐藥性肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)菌株區(qū)分開(kāi)來(lái),并成功地預(yù)測(cè)肺炎克雷伯菌的碳青霉烯類(lèi)敏感性和耐藥性[20]。雖然拉曼光譜具有低成本、無(wú)標(biāo)記和無(wú)損的特性,且具有區(qū)分細(xì)菌潛在感染的潛力,但是該技術(shù)尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索,基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間仍然存在差距。

    2.4其他物理、化學(xué)檢測(cè)法 主要包括流式細(xì)胞儀、耐藥菌微動(dòng)量(micromotion)和微量熱法(microcalorimetry)等檢測(cè)方法。其中流式細(xì)胞儀是一種革命性的工具,可以從單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞角度提供相關(guān)抗生素的耐藥性的檢測(cè)。最近一項(xiàng)研究將定量流式細(xì)胞儀和熒光插層儀相結(jié)合,在1 h內(nèi)可以檢測(cè)到臨床上重要的肺炎鏈球菌耐藥性,為進(jìn)行快速AST提供了一種新途徑[21]。但是此類(lèi)方法的局限性在于:基于流式細(xì)胞儀的AST研究集中于光散射特性、膜電位和膜滲透性的變化,這些參數(shù)是細(xì)菌活力的關(guān)鍵指標(biāo),但此類(lèi)參數(shù)數(shù)據(jù)復(fù)雜、暫無(wú)臨床標(biāo)準(zhǔn)參考值,也缺乏系統(tǒng)的臨床研究來(lái)論證準(zhǔn)確性[22]。

    2.5基于熒光探針技術(shù)的檢測(cè)方法 此類(lèi)方法基于DNA和RNA探針雜交技術(shù),通過(guò)探針攜帶的熒光標(biāo)簽檢測(cè)耐藥基因,包括經(jīng)典的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)。FISH是一種以定量方式可視化目標(biāo)DNA的高度特異性方法,它根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,通過(guò)特殊手段使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標(biāo)DNA接合,通過(guò)熒光顯微鏡直接觀(guān)察目標(biāo)DNA所在位置。目前基于FISH技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)包括XpressFish、QuickFish、RASER-FISH、DVC-FISH等[23-25]。此外,研究人員針對(duì)活細(xì)菌細(xì)胞開(kāi)發(fā)了rRNA探針檢測(cè),rRNA探針技術(shù)可以更好地檢測(cè)活躍細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和耐藥性轉(zhuǎn)錄表達(dá)。美國(guó)Broad研究所開(kāi)發(fā)的GoPhAST-R技術(shù),通過(guò)RNA檢測(cè)以94%~99%的準(zhǔn)確率對(duì)基因型和表型耐藥的細(xì)菌菌株進(jìn)行分類(lèi),并且在數(shù)小時(shí)內(nèi)確定關(guān)鍵抗生素耐藥標(biāo)記[26]。上述基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)耐藥基因具有可視化、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但是此類(lèi)探針無(wú)法檢出新的耐藥基因,對(duì)于具有突變位點(diǎn)的耐藥基因的檢測(cè)準(zhǔn)確率也顯著降低。

    2.6基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法 基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等方法。其中以L(fǎng)AMP最為簡(jiǎn)潔且應(yīng)用廣泛[27]。與常規(guī)PCR相比,LAMP無(wú)需模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀(guān)察等過(guò)程。在等溫(60~65 ℃)條件下,進(jìn)行核酸擴(kuò)增1 h,即能達(dá)到檢測(cè)耐藥基因的目的。最近研究表明,LAMP已成功用于黏菌素耐藥基因mcr-3、β-內(nèi)酰胺酶基因blaAFM-1等檢測(cè)[28-29]。此外,研究人員基于LAMP還開(kāi)發(fā)出smaRT-LAMP、RT-LAMP等技術(shù)和產(chǎn)品[30-31]。綜上所述,基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)且經(jīng)濟(jì),適用于臨床細(xì)菌耐藥基因的快速診斷和篩查。

    2.7基因芯片技術(shù)檢測(cè) 基因芯片又稱(chēng)為DNA微陣列,是一種同時(shí)將大量探針固定于固相表面,核酸樣本經(jīng)熒光標(biāo)記或擴(kuò)增后,利用核酸雜交的特異性對(duì)大批量未知樣品進(jìn)行檢測(cè)、分析的方法。2000年P(guān)erreten團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種可以在1 h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)革蘭陽(yáng)性菌中90多種耐藥基因的基因芯片[32]。目前,基因芯片技術(shù)發(fā)展較為成熟,基于此類(lèi)技術(shù)方法可以快速篩查臨床環(huán)境中病原菌及耐藥菌,從而為抗生素的選擇和使用提供參考?;蛐酒夹g(shù)具有高通量篩選耐藥基因的潛力,具有同時(shí)檢測(cè)數(shù)千個(gè)基因的特征優(yōu)勢(shì),但其局限性在于表型和基因型標(biāo)記之間的相關(guān)性差、無(wú)MIC值、無(wú)法檢測(cè)新的或非特征性的耐藥基因等。

    3 基于高通量測(cè)序技術(shù)的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)

    隨著測(cè)序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐藥檢測(cè)領(lǐng)域,包括WGS、mNGS和MscRNA-seq等技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間通常在14~20 h,能夠提供細(xì)菌的耐藥基因型,發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因,以及獲得單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的耐藥基因轉(zhuǎn)錄情況。但此類(lèi)技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),成本高,步驟復(fù)雜,缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的分析流程,目前僅局限于臨床復(fù)雜疾病的病原體診斷篩查。

    3.1WGS WGS是指獲得一個(gè)物種全基因序列的過(guò)程。在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)領(lǐng)域,WGS可以提供細(xì)菌全面的耐藥基因譜,并通過(guò)耐藥基因預(yù)測(cè)其耐藥表型,揭示相關(guān)耐藥機(jī)制[33]。多項(xiàng)研究對(duì)WGS和表型AST檢測(cè)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果呈高度一致性[34-35],證明了通過(guò)WGS預(yù)測(cè)細(xì)菌耐藥性的準(zhǔn)確性。此外,通過(guò)WGS鑒定耐藥細(xì)菌基因組中染色體和質(zhì)粒編碼的抗生素耐藥基因,有助于了解耐藥基因的移動(dòng)和傳播背后的機(jī)制[30],還可以對(duì)耐藥菌株的爆發(fā)流行進(jìn)行監(jiān)控[36]。但是此類(lèi)技術(shù)檢測(cè)周期較長(zhǎng),價(jià)格較貴,且樣本需要純細(xì)菌培養(yǎng)物,對(duì)臨床細(xì)菌的鑒定分離要求較高。

    3.2mNGS mNGS是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)特定環(huán)境樣品中微生物群體的基因組信息。通過(guò)生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行病原體鑒定、微生物組分析、宿主相互作用分析和細(xì)菌耐藥性預(yù)測(cè)。在臨床細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)中,mNGS能診斷未知病原體的感染,并挖掘其耐藥基因,為臨床合理使用抗生素提供參考?;趍NGS技術(shù),Wang等[37]在1例免疫功能低下的重癥肺炎患者的培養(yǎng)陰性肺組織樣本中鑒定出肺炎克雷伯菌,并進(jìn)一步鑒定出blaSHV-12、blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-65等抗性基因。此外,mNGS還可用于新型耐藥基因的檢測(cè)。Torres-Cortés等[38]通過(guò)mNGS技術(shù),從土壤樣本中確定了11種新的抗生素耐藥基因,包括新型氨芐西林耐藥基因、慶大霉素耐藥基因、氯霉素耐藥基因和甲氧芐啶耐藥基因等。mNGS的優(yōu)點(diǎn)在于直接從原始樣本進(jìn)行無(wú)偏檢測(cè),在對(duì)現(xiàn)有耐藥基因篩查的基礎(chǔ)上挖掘新型耐藥基因。但是該技術(shù)成本高,步驟復(fù)雜,缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的分析流程,對(duì)細(xì)菌耐藥基因的大規(guī)模篩查較為困難。

    3.3MscRNA-seq 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)是指對(duì)單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,從而獲得轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息,揭示細(xì)胞群差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系[39]。MscRNA-seq是近年最新的檢測(cè)技術(shù),其原理是將scRNA-seq應(yīng)用于單個(gè)微生物,如細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中。但是MscRNA-seq的發(fā)展受限于微生物mRNA含量低、部分細(xì)菌獨(dú)特的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及mRNA無(wú)多聚腺苷酸化等原因,技術(shù)壁壘高,發(fā)展較為困難。美國(guó)華盛頓大學(xué)Georg Seelig研究團(tuán)隊(duì)利用基于分割池連接的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(split-pool ligation-based transcriptome sequencing,SPLiT-seq)技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組microSPLiT測(cè)序(microbial split-pool ligation transcriptomics),首次通過(guò)低成本、高通量的方法成功進(jìn)行細(xì)菌單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析工作[40]。microSPLiT通過(guò)組合條形碼標(biāo)記RNA的細(xì)菌細(xì)胞來(lái)源,一次實(shí)驗(yàn)可分析數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)菌細(xì)胞。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,MscRNA-seq技術(shù)克服了mRNA含量低、細(xì)胞多樣性和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜等困難,通過(guò)此類(lèi)技術(shù)挖掘臨床超級(jí)細(xì)菌中耐藥基因的轉(zhuǎn)錄組,理解耐藥基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)移等問(wèn)題,對(duì)進(jìn)一步檢測(cè)和篩查臨床多重耐藥性具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

    4 小結(jié)

    本文總結(jié)了基于傳統(tǒng)經(jīng)典方法、分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法,三種檢測(cè)方法的比較見(jiàn)表1。傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法能提供細(xì)菌耐藥的表型信息,但需要長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和鑒定,且無(wú)法檢測(cè)耐藥基因。以物理、化學(xué)和分子生物學(xué)方法為基礎(chǔ)的新技術(shù),其細(xì)菌耐藥性檢測(cè)周期短、靈敏度高,但是無(wú)法檢測(cè)未知耐藥基因及突變基因。而基于高通量測(cè)序的檢測(cè)技術(shù)對(duì)經(jīng)典方法的表型檢測(cè)進(jìn)行補(bǔ)充,可以準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的耐藥基因,發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因及突變位點(diǎn)。筆者認(rèn)為在未來(lái)細(xì)菌耐藥性的表型和基因型的綜合檢測(cè),對(duì)于控制耐藥細(xì)菌感染及流行至關(guān)重要,也為相關(guān)感染性疾病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)支持。

    表1 細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)技術(shù)的比較

    猜你喜歡
    耐藥性測(cè)序抗生素
    杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    長(zhǎng)絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    皮膚受傷后不一定要用抗生素
    中老年保健(2021年6期)2021-08-24 06:53:34
    二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    抗生素的故事
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級(jí),普及耐藥性檢測(cè)意義重大
    貓抓病一例及抗生素治療
    基因捕獲測(cè)序診斷血癌
    童年重負(fù):“被攝入”的抗生素
    国产综合懂色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 国产高清有码在线观看视频| 久久精品夜色国产| 亚洲成av人片在线播放无| 成人毛片60女人毛片免费| 少妇丰满av| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久色成人| 国产精品电影一区二区三区| 久久热精品热| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产麻豆成人av免费视频| 国产日韩欧美在线精品| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av免费在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费看日本二区| 在线播放无遮挡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 我要看日韩黄色一级片| 秋霞在线观看毛片| 麻豆成人av视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| av黄色大香蕉| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲美女视频黄频| 色播亚洲综合网| 性欧美人与动物交配| 久久亚洲国产成人精品v| 男的添女的下面高潮视频| 深夜精品福利| 美女cb高潮喷水在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| eeuss影院久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 国产探花极品一区二区| 草草在线视频免费看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 精品国内亚洲2022精品成人| 两个人的视频大全免费| 国产av不卡久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产av一区在线观看免费| h日本视频在线播放| 国内揄拍国产精品人妻在线| 插阴视频在线观看视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产爱豆传媒在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 久久精品国产亚洲网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 我要搜黄色片| 亚洲不卡免费看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久99热这里只有精品18| 好男人视频免费观看在线| 中出人妻视频一区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产高清激情床上av| 毛片一级片免费看久久久久| 高清在线视频一区二区三区 | 小说图片视频综合网站| 五月玫瑰六月丁香| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲人成网站在线观看播放| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美激情在线99| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品1区2区在线观看.| 日本色播在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美极品一区二区三区四区| 熟女电影av网| 国产精品一区二区三区四区久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 看黄色毛片网站| 免费看a级黄色片| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲人与动物交配视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产成人一区二区在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产三级中文精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| www日本黄色视频网| 99在线人妻在线中文字幕| 69av精品久久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 中出人妻视频一区二区| 国产精品野战在线观看| 小说图片视频综合网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品久久久久久久末码| 久久精品国产亚洲网站| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久久久久成人| 欧美精品一区二区大全| 久久久久久久午夜电影| 精品日产1卡2卡| av福利片在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 免费看日本二区| 一级黄色大片毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲欧美98| 免费看光身美女| 久久久成人免费电影| 男插女下体视频免费在线播放| 成人美女网站在线观看视频| 日韩精品青青久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品三级大全| 中文字幕免费在线视频6| 国产熟女欧美一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 老司机福利观看| 在线天堂最新版资源| 久久精品影院6| 久久久久性生活片| 婷婷精品国产亚洲av| 日韩欧美三级三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 大香蕉久久网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av成人精品一区久久| 两个人的视频大全免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 波多野结衣巨乳人妻| 免费观看a级毛片全部| 久久午夜福利片| 中文字幕久久专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美激情在线99| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| av视频在线观看入口| 日韩欧美国产在线观看| 波多野结衣高清无吗| 成人午夜高清在线视频| 亚洲在线自拍视频| 看非洲黑人一级黄片| 免费观看的影片在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人91sexporn| 久久久国产成人免费| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品影院6| 久久久国产成人精品二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产成人福利小说| 九九爱精品视频在线观看| 悠悠久久av| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩高清综合在线| 国产伦理片在线播放av一区 | 在线免费十八禁| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美三级亚洲精品| 免费看美女性在线毛片视频| 青春草视频在线免费观看| 精品人妻视频免费看| 最近手机中文字幕大全| 内射极品少妇av片p| 美女国产视频在线观看| 久久精品夜色国产| 免费观看在线日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | а√天堂www在线а√下载| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 深夜a级毛片| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品人妻久久久久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产人妻一区二区三区在| 内射极品少妇av片p| 深夜精品福利| 男人狂女人下面高潮的视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲av一区综合| 一本精品99久久精品77| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 少妇高潮的动态图| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热这里只有精品一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品久久国产高清桃花| 特级一级黄色大片| 国产一区二区激情短视频| 国产精品久久久久久久久免| 欧美又色又爽又黄视频| 免费观看的影片在线观看| 特级一级黄色大片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人毛片a级毛片在线播放| 日日干狠狠操夜夜爽| 99热这里只有是精品50| 国产精品无大码| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 可以在线观看的亚洲视频| 九草在线视频观看| 免费看美女性在线毛片视频| 赤兔流量卡办理| 亚洲av男天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本免费a在线| 亚洲在线自拍视频| 99热网站在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 色哟哟哟哟哟哟| 两个人视频免费观看高清| 免费观看精品视频网站| 免费av毛片视频| 可以在线观看的亚洲视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 一个人免费在线观看电影| 国内精品久久久久精免费| av免费观看日本| 国产成人aa在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 午夜亚洲福利在线播放| 免费观看精品视频网站| 丰满的人妻完整版| 精品无人区乱码1区二区| 伦精品一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品影院6| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜视频国产福利| 日日啪夜夜撸| 免费看美女性在线毛片视频| 91精品国产九色| 国产精品国产高清国产av| 日韩制服骚丝袜av| 最后的刺客免费高清国语| 99热这里只有是精品50| 边亲边吃奶的免费视频| 97在线视频观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 色综合色国产| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产亚洲精品久久久com| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲自拍偷在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚州av有码| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久人人精品亚洲av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久伊人网av| 国产片特级美女逼逼视频| 在线国产一区二区在线| 26uuu在线亚洲综合色| 嫩草影院入口| 国产色爽女视频免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 我要搜黄色片| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩三级伦理在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 色吧在线观看| 直男gayav资源| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲成人久久爱视频| 欧美区成人在线视频| 久久6这里有精品| 日韩欧美在线乱码| 国产视频首页在线观看| 看黄色毛片网站| 欧美精品国产亚洲| 亚洲在线观看片| 久久这里只有精品中国| 国产精品久久电影中文字幕| avwww免费| 久久精品久久久久久久性| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产午夜福利久久久久久| 亚洲五月天丁香| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美性猛交黑人性爽| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日本黄色片子视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品人妻熟女av久视频| 国产乱人视频| 能在线免费观看的黄片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 2022亚洲国产成人精品| 99riav亚洲国产免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲高清免费不卡视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 在线观看av片永久免费下载| 国产黄色小视频在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久精品94久久精品| 亚洲av不卡在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费看av在线观看网站| 69av精品久久久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品不卡国产一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 成人性生交大片免费视频hd| 成人永久免费在线观看视频| 久久久成人免费电影| 久久精品夜色国产| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人福利小说| 欧美极品一区二区三区四区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久综合国产亚洲精品| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品福利在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 午夜福利视频1000在线观看| 伦精品一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 久久久久性生活片| 黄色日韩在线| 91久久精品国产一区二区成人| 国内精品一区二区在线观看| 日韩av在线大香蕉| 小说图片视频综合网站| 久久国内精品自在自线图片| 边亲边吃奶的免费视频| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品青青久久久久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品一区二区三区视频在线| 久久精品人妻少妇| 成年免费大片在线观看| eeuss影院久久| 中文字幕免费在线视频6| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产探花在线观看一区二区| 久久久精品94久久精品| 欧美日韩国产亚洲二区| av视频在线观看入口| 久久久久国产网址| 免费搜索国产男女视频| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 在线观看66精品国产| 91久久精品国产一区二区三区| 国产在视频线在精品| 色吧在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 日本色播在线视频| 日本三级黄在线观看| 99久久精品热视频| 亚洲在线自拍视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线国产一区二区在线| 嫩草影院新地址| 婷婷亚洲欧美| 国模一区二区三区四区视频| 国内精品美女久久久久久| 国产精华一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99在线视频只有这里精品首页| 精品一区二区三区人妻视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 舔av片在线| 国产免费男女视频| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美精品自产自拍| 51国产日韩欧美| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产 一区精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 内地一区二区视频在线| 亚洲精品色激情综合| 免费观看精品视频网站| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美成人一区二区免费高清观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲人与动物交配视频| 久久国产乱子免费精品| av黄色大香蕉| 欧美精品国产亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 在线观看美女被高潮喷水网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久鲁丝午夜福利片| 美女内射精品一级片tv| 成人毛片60女人毛片免费| 热99re8久久精品国产| 欧美日韩在线观看h| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成年版毛片免费区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 特大巨黑吊av在线直播| 97超视频在线观看视频| 18+在线观看网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 九草在线视频观看| 国产亚洲精品久久久com| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美3d第一页| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产在线精品亚洲第一网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 人妻系列 视频| 欧美bdsm另类| 天堂网av新在线| 亚洲精品国产成人久久av| 日本熟妇午夜| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩av不卡免费在线播放| 成人二区视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一级毛片久久久久久久久女| 成人亚洲欧美一区二区av| 99久国产av精品国产电影| 日日啪夜夜撸| 久久精品国产亚洲av天美| 亚州av有码| 国产精品人妻久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久久久久久久中文| 国产黄片视频在线免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精华霜和精华液先用哪个| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 色哟哟·www| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产高潮美女av| 免费看av在线观看网站| 色吧在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久韩国三级中文字幕| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品伦人一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产麻豆成人av免费视频| 青春草国产在线视频 | 韩国av在线不卡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人一区二区视频在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 一级黄色大片毛片| 午夜激情福利司机影院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 联通29元200g的流量卡| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产熟女欧美一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一区福利在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 69人妻影院| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 永久网站在线| 国产亚洲欧美98| 国产精品久久久久久精品电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲国产欧美人成| 国产黄片美女视频| 久久精品夜色国产| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 天天一区二区日本电影三级| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费观看a级毛片全部| 精品久久久噜噜| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 熟女电影av网| 美女高潮的动态| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜老司机福利剧场| 99国产极品粉嫩在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品国产亚洲网站| 高清日韩中文字幕在线| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲四区av| 精华霜和精华液先用哪个| 中文字幕久久专区| 日韩av在线大香蕉| 日韩av不卡免费在线播放| 国产久久久一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 一个人看的www免费观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| avwww免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久热精品热| 高清在线视频一区二区三区 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 只有这里有精品99| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 床上黄色一级片| 国产亚洲精品av在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产精品成人综合色| 在线a可以看的网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 三级国产精品欧美在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩精品青青久久久久久| 成年免费大片在线观看| 精品国产三级普通话版| 亚洲不卡免费看| 久久久久久伊人网av| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品色激情综合| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产视频首页在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲七黄色美女视频| 免费无遮挡裸体视频| 日韩高清综合在线| 日本黄大片高清| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人三级黄色视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日日撸夜夜添| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲无线在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 国产成人影院久久av| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久99热6这里只有精品| 日韩精品有码人妻一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 国国产精品蜜臀av免费| 特级一级黄色大片| 性色avwww在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 国产v大片淫在线免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲最大成人手机在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 悠悠久久av| 免费看日本二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久这里有精品视频免费| 青青草视频在线视频观看|