HPLC法同時測定維C銀翹片中8種成分的含量

龐文娟，王麗，張生杰

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

維C銀翹片作為中西藥結(jié)合的代表藥品，既有中醫(yī)的治療特點，又有西藥退熱鎮(zhèn)痛功效。臨床上維C銀翹片用于治療流感引起的發(fā)熱、頭痛、咳嗽、口干和喉嚨痛[1-2]。經(jīng)查詢國家藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)庫，維C銀翹片作為中藥制劑已有批準文號306個，同時維C銀翹片也是一種治療上呼吸道感染非處方藥品，患者可以根據(jù)癥狀自行購買使用。但是據(jù)國家藥品不良反應監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示該品種存在一定的安全風險，雖然引起不良反應的原因是已知化學成分的不良反應，但是患者往往忽略了所添加的化學藥物，造成重復用藥而帶來新的安全風險[3]。此外，生產(chǎn)維C銀翹片的企業(yè)有上百家，每個廠家由于工藝、原輔料的差異使所生產(chǎn)的藥品在質(zhì)量、臨床療效方面都存在很大差異?，F(xiàn)行維C銀翹片質(zhì)量標準僅對馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚、維生素C、綠原酸、牛蒡子苷的含量進行了控制[4]，缺少對連翹和甘草的質(zhì)量控制。這就造成很難用質(zhì)量標準來有效的控制維C銀翹片質(zhì)量。因此，建立能夠同時控制多個指標的方法對維C銀翹片質(zhì)量進行控制，以保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定、安全，確保療效并降低用藥風險具有重要意義。目前已有文獻報道同時測定維C銀翹片多個成分含量的方法，普遍是選擇維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、牛蒡子苷這7種成分中的3種或4種進行同時測定的研究[5-8]，此外，也有研究利用多波長檢測技術或液質(zhì)連用技術實現(xiàn)5～6種成分的同時測定[9-12]。本研究采用高效液相色譜法在同一個色譜條件下測定維C銀翹片中8種指標成分的含量，為通過提高維C銀翹片質(zhì)量標準來控制原藥材質(zhì)量，確保質(zhì)量穩(wěn)定和療效，提供了新的分析方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜，配DAD檢測器（日本島津）；Secura125-1CED型十萬之一電子天平（賽多利斯公司）；UA10MFD型超聲波清洗器（德國wiggens公司）。

1.2 材料 甘草酸銨對照品（批號：110731-201/619，含量：93.1%）、綠原酸對照品（批號：110753-200112，含量：100%）、連翹酯苷A對照品（批號：111810-201606，含量：93.4%）、甘草苷對照品（批號：11052-201611，含量：95.0%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號：100047-200606，含量：99.7%）、連翹苷對照品（批號：110821-201615，含量：94.9%）、牛蒡苷對照品（批號：110819-201007，含量：95.4%）、對乙酰氨基酚對照品（批號：100018-200408，含量：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；維C銀翹片（A廠家，批號：202006020，C20 201120；B廠家，批號：201101；C廠家，批號：20 200803；D廠家，批號：20200601）；乙腈（色譜級）（美國默克公司，批號：10945730812）；甲酸（色譜級）（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10332080）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫時間程序：0～10.0 min，90%B；10.0～20.0 min，90%～80%B；20.0～30.0 min，80%B～70%B；30.0～45.0 min，70%B～80%B；45.0～55.0 min，80%B～90%B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：275 nm；進樣量：20 μL。

BNP屬于多肽類激素一種，是心血管系統(tǒng)的一種具有生物活性的重要激素，能在心肌受損時快速入血進行調(diào)節(jié)，能夠靈敏的反映出心肌受損的情況［6］，并且與心肌受損程度正相關，心肌損傷越嚴重BNP水平越高，它是一種常用且有效的心衰檢測指標。目前BNP已被納入心衰診斷指南，用于心衰患者的預測和診斷工作。本研究中，鉤藤人參高劑量組BNP水平與卡托普利組BNP水平相近，并明顯低于模型組，說明鉤藤人參高劑量組在降低HCHF大鼠BNP水平，改善心功能方面效果顯著。

2.5 精密度試驗 在所建色譜條件下，混合對照品溶液重復進樣6次，得到各待測組分峰面積，計算對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.06%、0.05%、0.20%、0.04%、0.45%、0.58%、0.51%、1.35%，表明所使用高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨、對乙酰氨基酚對照品適量，用50%甲醇配成含對乙酰氨基酚（4 662 μg/mL）、綠原酸（222.5 μg/mL）、牛蒡苷（225.1 μg/mL）、馬來酸氯苯那 敏（135.73 μg/mL）、連翹酯苷A（60.12 μg/mL）、甘草苷（51.64 μg/mL）、甘草酸銨（87.48 μg/mL）、連翹苷（48.55 μg/mL）8種對照品的混合對照品溶液。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取維C銀翹片（批號：201101），平行制備6份供試品，按“2.1”項下色譜條件，考察24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性，每隔4 h取樣檢測1次，記錄待測成分峰面積，計算峰面積RSD值。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.15%、0.62%、0.88%、0.59%、0.91%、0.62%、0.28%、0.68%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，去除包衣，精密稱取細粉約0.20 g，置于棕色容量瓶中，精密加50%甲醇20 mL，稱質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用50%甲醇補足質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即可。

2.9 含量測定 取5批維C銀翹片樣品，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，外標法計算樣品含量，結(jié)果見表3。

證明：假設(x(t),y(t),u(t),v(t))T為系統(tǒng)(1.1)的解，由系統(tǒng)(1.1)的第一個方程得，則由引理2.1的結(jié)果，易知

表1 8 種化學成分的線性關系、定量限和檢出限

2.2 溶液的制備

2.4 線性關系、定量限和檢出限考察 將混合對照品溶液逐步稀釋6、5、3、2倍，與混合對照品組成毓?jié)舛忍荻龋础?.1”項下色譜條件測定，以進樣量（μg）為橫坐標（x），峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸分析，求得回歸方程、相關系數(shù)（r）和線性范圍；通過連續(xù)稀釋混合對照溶液確定定量限和檢測限，當信號和噪聲之間的比值為3時所對應的濃度確定為檢測限，信號和噪聲之間的比值為10時所對應的濃度確定為定量限[13]，結(jié)果見表1。

她從頭到尾見證了他們被屠殺的過程。人的殘忍真是沒有極限，沒有止境。天下是沒有公理的，否則一群人怎么跑到別人的國家如此撒野?把別人國家的人如此欺負?她哭還因為自己國家的人就這樣軟弱，從來都是受人欺負。書娟哭得那個痛啊，把沖天冤屈都要哭出來。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取每份約0.10 g已知含量的維C銀翹片（批號：201101）6份，加入與待測組分含量相當?shù)膶φ杖芤海唇⒌纳V條件進行分析，用回歸方程計算相應含量，并計算待測組分的平均加樣回收率和RSD值。結(jié)果表明，8種待測組分的加樣平均回收率在95.82%～101.08%之間，RSD＜2.0%，表明所建HPLC色譜方法的準確度良好。（見表2）

2.7 重復性試驗 取維C銀翹片（批號：201101）樣品細粉6份，按供試品溶液制備方法平行制備，按所建立的色譜條件進行分析，計算待測成分含量。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨含量RSD值分別為0.48%、0.57%、0.74%、1.28%、1.30%、1.55%、0.75%、0.78，表明所建方法重復性良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3 專屬性試驗 按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL混合對照品溶液和供試品溶液進行專屬性分析。測定結(jié)果表明，混合對照品8種待測成分，在供試品溶液保留時間（±0.5%）處都有特征峰，分離度、拖尾因子理論塔板數(shù)均滿足定量分析要求，其他成分峰對待測成分無干擾。（見圖1）

表3 維C 銀翹片樣品測定結(jié)果（mg/g）

3 討 論

3.1 待測成分的選擇 維C銀翹片是在經(jīng)典名方銀翹散基礎上添加西藥組成的中西藥復方制劑。在銀翹散方劑中金銀花、連翹發(fā)揮主要療效，相須配伍使用同為君藥，故本研究選擇用綠原酸、連翹脂苷A、連翹苷3個指標成分控制其質(zhì)量。市場銷售連翹飲片質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)連翹分為青翹、老翹，其連翹脂苷A與連翹苷存在明顯差異，用連翹脂苷A、連翹苷兩種成分同時控制連翹質(zhì)量更為全面[14-15]。牛蒡苷為牛蒡子的指標成分，能夠直接反映牛蒡子質(zhì)量狀況，且不同產(chǎn)地牛蒡子中牛蒡苷含量有差異[16]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)甘草苷、甘草酸銨具有明顯的糖皮質(zhì)激素樣作用[17]，甘草苷和甘草酸銨最大的副作用是由高血壓和低鉀血癥引起的繼發(fā)性疾病[18]，故應控制維C銀翹片中甘草的質(zhì)量以保障療效的穩(wěn)定。維C銀翹片不良反應主要是由對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏引起的，對其含量控制是保障維C銀翹片安全性的重要質(zhì)控指標[3]。綜上選擇用上述8種成分能夠更好地控制維C銀翹片質(zhì)量，以減少用藥風險。

周澤贍霍地一下睜開了眼，門外小雞叫聲已沒先前那么大了。周澤贍把被子掀開，猛地坐起，衣服也不穿就跑了出去。

3.2 優(yōu)化色譜條件 本研究對確定的8種待測成分在190～700 nm內(nèi)進行全波長掃描，同時考慮8種成分在維C銀翹片中含量在同一色譜條件下的響應值，為確保各成分峰面積能夠同時滿足定量需求，故確定檢測波長為275 nm。在此波長下待測成分均具有良好的吸收，在供試品色譜中各成分色譜峰能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，且能夠滿足在同一色譜條件下定量分析的系統(tǒng)適用性。因待測成分極性差異較大，為實現(xiàn)8種成分同時測定，需選用梯度洗脫。此外，本研究還考察了不同流動相組成對峰形的影響，試驗證明加入0.1%甲酸時峰形最好，并對梯度洗脫時間程序進行優(yōu)化已實現(xiàn)良好的分離效果?！?.1”項下色譜條件能夠在35 min內(nèi)實現(xiàn)8種待測成分的同時定量分析。

我打算說點什么，想向他保證，我可以撐下去，也許吧——，但話到嘴邊又咽了回去，不知為什么?？赡芤驗槲也幌朐倏吹桨鹂四菑埬?，也不喜歡他盯著我，甚至永遠不想讓他再看我。

3.3 維C銀翹片質(zhì)量分析 本研究通過測定維C銀翹片中8種成分的含量發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的維C銀翹片和同一廠家生產(chǎn)的維C銀翹片8種成分含量存在明顯的差異，尤其是《中華人民共和國藥典》標準中未列出的質(zhì)控成分差別更明顯，比如連翹苷A的最高含量是最低含量的兩倍多，甘草酸差別竟高達3倍。這可能為市場上銷售的維C銀翹片質(zhì)量和療效參差不齊的原因，因此增加維C銀翹片質(zhì)量控制成分，對其安全性和保證療效尤為重要。本試驗因缺少足夠的樣品并未對市售維C銀翹片的質(zhì)量進行系統(tǒng)的評價分析，建議市場監(jiān)督部門加大對維C銀翹片監(jiān)督抽驗，同時應提高維C銀翹片質(zhì)量標準以確保安全性和療效。本分析方法不足之處在于未將維生素C納入此分析方法中進行多成分同時測定。維生素C特殊的化學性質(zhì)，使其在該色譜條件下出峰較早，容易與溶劑峰混淆很難進行定量分析，故本分析方法未能實現(xiàn)同時測定。維生素C常作為抗氧化劑以預防或治療壞血病，超劑量服用可能會導致胃腸道不適、頭痛、失眠等不良反應，且目前尚無具體研究證明其能預防或治療感冒[19]，因此在以后的分析研究中應加以關注。