阿維菌素原藥及制劑溶液的熒光光譜特征研究

顏康婷，韓沂芳，王林琳，丁 凡，蘭玉彬*，張亞莉2, *

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)電子工程學(xué)院、 人工智能學(xué)院，廣東 廣州 510642 2. 國家精準農(nóng)業(yè)航空施藥技術(shù)國際聯(lián)合研究中心，廣東 廣州 510642 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510642

引 言

阿維菌素屬十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，是一種具有殺蟲、 殺螨、 殺線蟲活性的廣譜性殺蟲劑。常用于防治果樹紅蜘蛛、 薊馬，蔬菜菜青蟲、 小菜蛾等蟲害，能達到較高的防治效果。但阿維菌素的過度使用會造成農(nóng)作物的農(nóng)藥殘留量超標，影響消費者身體健康及生態(tài)環(huán)境[1]。因而，實現(xiàn)對阿維菌素農(nóng)藥殘留的快速檢測對于保證農(nóng)產(chǎn)品的食品安全和發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)具有重要的研究意義。目前，常用于阿維菌素農(nóng)藥含量檢測的方法為高效液相色譜法(HPLC)、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)等[2]。這些檢測方法的靈敏度、 準確度高，但前期處理復(fù)雜，耗時長，不利于實現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的在線實時檢測。而熒光光譜分析具有選擇性好、 靈敏度高、 檢出限低的特點，且其不需復(fù)雜的前期處理，操作簡單，有利于實現(xiàn)對農(nóng)作物農(nóng)藥殘留的在線快速檢測[3-7]。

本研究對阿維菌素原藥溶液及兩種來自不同生產(chǎn)廠家的阿維菌素制劑溶液進行熒光分析，通過三維熒光光譜及相關(guān)Excitation Emission Matrix(EEM)數(shù)據(jù)，分析原藥及制劑溶液熒光特征峰區(qū)域。通過獲得的最佳激發(fā)波長，掃描二維熒光光譜數(shù)據(jù)，獲得熒光強度值隨溶液濃度變化的規(guī)律，建立預(yù)測模型，從而檢驗熒光分析對阿維菌素含量進行快速檢測的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器

熒光掃描儀器：FP8300熒光分光光度計(日本JASCO)；純水制備系統(tǒng)：Milli-Q Direct純水/超純水一體化系統(tǒng)(皇河儀器科技有限公司)。

1.2 樣品及溶液配制

阿維菌素原藥(湖北康寶泰精細化工有限公司)采用一種即溶于水的有機化合物DMSO作為溶劑進行溶解得到母液，再取不同量的母液加純水稀釋獲得24個濃度梯度的阿維菌素原藥溶液。實驗中使用兩種來自不同生產(chǎn)廠家(制劑1：河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司、 制劑2：河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司)的阿維菌素制劑，劑型為乳油，有效成分含量均為1.8%。阿維菌素制劑通過不同比例的制劑：純水配比獲得23個不同濃度的阿維菌素制劑溶液。阿維菌素原藥溶液及制劑溶液相關(guān)濃度配制如表1所示。

表1 阿維菌素原藥及制劑溶液配制濃度梯度Table 1 Concentration gradient of abamectin technicaland preparation solution preparation

1.3 方法

實驗中激發(fā)波長(Ex)掃描間隔為5 nm，發(fā)射波長(Em)掃描間隔為10 nm，每個樣品重復(fù)掃描三遍取平均值；進行熒光檢測的具體步驟為：超聲波充分震蕩溶液，使用移液槍分別從不同階梯濃度的阿維菌素溶液中吸取3 mL的溶液至10 mm×10 mm×42 mm的石英器皿中；再將石英器皿置于熒光分光光度計中指定的位置；操作JASCO Spectra Manager軟件進行熒光光譜掃描獲取EEM數(shù)據(jù)及二維熒光光譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿維菌素原藥溶液熒光光譜分析

三維熒光光譜具有獨特的指紋性[8-11]，為分析阿維菌素原藥的熒光效應(yīng)，實驗對6個階梯濃度阿維菌素原藥溶液(10，15，20，25，30和35 mg·L-1)進行三維熒光光譜掃描。其中，20 mg·L-1的阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜圖如圖1所示。

從三維熒光光譜圖及EEM數(shù)據(jù)分析可知，6個濃度梯阿維菌素原藥溶液在Ex：250～300 nm，Em：280～320 nm處出現(xiàn)熒光特征峰區(qū)域，其中熒光峰1的激發(fā)波長均為Ex=270 nm。因此，選定Ex=270 nm作為阿維菌素原藥溶液的最佳激發(fā)波長，對6個阿維菌素原藥溶液進行二維熒光光譜掃描，相關(guān)數(shù)據(jù)如表2所示。分析可知，6個濃度梯度的阿維菌素原藥溶液在Ex=270 nm，Em=297.5～298 nm處獲得熒光峰特征峰值，熒光強度值隨著阿維菌素原藥溶液濃度的增加而增強。此結(jié)果與Ji等[12]在基于熒光光譜的水果汁阿維菌素殘留檢測的研究結(jié)果相近。

圖1 20 mg·L-1阿維菌素原藥溶液三維熒光光譜圖 1：Ex/Em=270 /297 nm；Int.=111.772Fig.1 Three-dimensional fluorescence spectrum of20 mg·L-1 abamectin technical solution 1：Ex/Em=270 /297 nm；Int.=111.772

其中，實驗采用DMSO作為溶劑對阿維菌素原藥母液進行配制，為討論DMSO的熒光效應(yīng)，對純水及純水+DMSO溶液進行三維熒光光譜掃描。分析可得，純水熒光強度值為55.9，純水+DMSO的熒光強度值為54.5。兩種溶液的熒光強度值均小于阿維菌素原藥溶液熒光強度值，因而不會對實驗分析造成影響。

表2 阿維菌素原藥溶液二維熒光光譜相關(guān)數(shù)據(jù)Table 2 Two-dimensional fluorescence spectroscopydata of abamectin technical solution

為進一步討論阿維菌素?zé)晒夥逄師晒鈴姸扰c溶液濃度的關(guān)系，以Ex=270 nm為最佳激發(fā)波長對阿維菌素原藥溶液校正集進行二維熒光光譜掃描，獲得發(fā)射波長范圍為285～600 nm的發(fā)射光譜圖。利用Origin 2019b對阿維菌素原藥溶液的濃度、 熒光強度相關(guān)數(shù)據(jù)進行線性回歸擬合，結(jié)果顯示其皮爾遜相關(guān)系數(shù)r=0.995，R2=0.990，擬合結(jié)果如圖2所示。由擬合結(jié)果可知，利用Ex=270 nm作為最佳激發(fā)波長進行二維熒光光譜掃描，r=0.995，說明阿維菌素原藥溶液濃度可以解釋利用最佳激發(fā)波段掃描得到的熒光特征峰值處熒光強度99.5%的變異性，兩者存在線性關(guān)系。

利用驗證集對預(yù)測模型的預(yù)測精度進行檢驗，采用origin 2019b對阿維菌素原藥溶液驗證集中的預(yù)測值及實測值進行線性擬合分析，結(jié)果如圖3所示。擬合結(jié)果R2=0.999，RMSE=0.359 mg·L-1。接近1的R2及較小的RMSE說明擬合效果良好，表明該預(yù)測模型對于濃度范圍10～35 mg·L-1內(nèi)的阿維菌素原藥溶液具有良好的預(yù)測精度，能夠通過熒光峰值處的熒光強度來反映對應(yīng)的溶液濃度值。

圖2 阿維菌素原藥溶液線性擬合曲線Fig.2 Fitting curve of abamectin technical solution

圖3 阿維菌素原藥驗證集中預(yù)測值與實測值線性擬合

2.2 阿維菌素制劑溶液熒光光譜分析

2.2.1 阿維菌素制劑溶液熒光峰分布規(guī)律

實驗分別對兩種阿維菌素制劑的三個階梯濃度的溶液進行三維熒光光譜掃描(1∶2 100，1∶1 000，1∶650)，其中制劑：純水配比為1∶1 000的三維熒光光譜掃描結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，阿維菌素制劑溶液三維熒光光譜圖出現(xiàn)兩個較明顯的熒光特征峰區(qū)域(1：Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm；另一個區(qū)域在Ex=250～400 nm，Em=380～470 nm)。對比可知，熒光峰1與阿維菌素原藥溶液三維熒光光譜中所出現(xiàn)的熒光峰1相似，判斷為阿維菌素有效成分的熒光效應(yīng)。而在另一個熒光特征峰區(qū)域在阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜中并未出現(xiàn)，認為是阿維菌素制劑中的其他成分，填充劑或助劑所產(chǎn)生。比較阿維菌素原藥、 制劑溶液的三維熒光光譜可知，制劑中的阿維菌素有效成分依然保持其熒光特性，并產(chǎn)生了跟阿維菌素原藥溶液相似的熒光峰1，對應(yīng)Ex均為270 nm。

圖4 1∶1 000阿維菌素制劑溶液三維熒光光譜圖 (a)：制劑1；(b)：制劑2Fig.4 1∶1 000 abamectin pharmaceutical solutionthree-dimensional fluorescence spectrum (a)：Formulation 1; 1：Ex/Em=270/291.5 nm，Int.=2 901.22 (b)：Formulation 2；1：Ex/Em=270/291 nm，Int.=2 774.06

2.2.2 阿維菌素制劑溶液熒光強度變化規(guī)律

以Ex=270 nm作為最佳激發(fā)波長分別掃描5個濃度阿維菌素制劑溶液(10.02，15.45，20.88，24.64和32.16 mg·L-1)得到二維熒光光譜，相關(guān)數(shù)據(jù)如表3所示。分析可知，隨著阿維菌素制劑溶液濃度的增大，熒光峰1熒光強度值呈負增長狀態(tài)，與阿維菌素原藥中溶液濃度與熒光強度值的正相關(guān)關(guān)系不同。查閱相關(guān)資料可知，在進行溶液的熒光檢測時會存在濃度效應(yīng)[13]，其會造成內(nèi)濾效應(yīng)、 溶質(zhì)間相互作用等現(xiàn)象從而影響溶液熒光強度。經(jīng)分析，認為阿維菌素制劑溶液中出現(xiàn)的負增長趨勢是由于溶液內(nèi)濾效應(yīng)引起。即當溶液濃度過高時，溶液中的雜質(zhì)對入射光的吸收作用增強，降低激發(fā)光的強度。阿維菌素制劑溶液中除了阿維菌素有效成分外，其余雜質(zhì)成分較多，因而阿維菌素有效成分濃度相當?shù)脑幦芤号c制劑溶液相比，制劑溶液的內(nèi)濾效應(yīng)會更加明顯。

為進一步討論阿維菌素制劑溶液濃度與相應(yīng)熒光強度值之間的關(guān)系，以Ex=270 nm為最佳激發(fā)波長對阿維菌素制劑溶液校正集進行二維熒光光譜掃描，利用origin 2019b分別對兩個校正集中15個樣品的濃度及對應(yīng)的熒光強度值進行擬合分析。

表3 阿維菌素原藥溶液二維熒光光譜相關(guān)數(shù)據(jù)

查閱資料，溶液熒光強度的理論計算公式為：If=2.303YfI0εbc。其中If為熒光強度，Yf為物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，I0為入射光強度，ε為摩爾吸光系數(shù)。在一定的頻率及強度的激發(fā)光照射下，溶液熒光強度和溶液的濃度呈線性關(guān)系；如果εbc≥0.05時，則熒光強度和溶液的濃度不呈線性關(guān)系，應(yīng)考慮冪級數(shù)中的二次方甚至三次方[13]。

對實驗數(shù)據(jù)擬合：制劑1進行二次多項式擬合分析，制劑2進行線性擬合分析，均符合關(guān)于溶液熒光強度的理論計算分析，擬合結(jié)果如圖5所示。制劑1、 2的擬合結(jié)果R2分別為0.969和0.963，表明模型的擬合結(jié)果較好，制劑溶液濃度與對應(yīng)熒光強度具有良好的相關(guān)性。

圖5 阿維菌素制劑溶液擬合曲線 (a)：制劑1；(b)：制劑2Fig.5 Fitting curve of abamectin preparation solution (a)：Formulation 1; (b)：Formulation 2

利用驗證集中8個濃度梯度阿維菌素制劑溶液分別對兩種制劑的預(yù)測模型的預(yù)測精度進行檢驗，其分析結(jié)果如圖6所示。制劑1、 2驗證集中預(yù)測模型的濃度預(yù)測值與實測值線性擬合結(jié)果分別為，R2=0.935，R2=0.985，RMSE=1.945 mg·L-1，RMSE=0.858 mg·L-1。接近1的R2和較小的RMSE表明，通過最佳激發(fā)波長Ex=270nm進行二維熒光光譜掃描獲取相關(guān)數(shù)據(jù)進行預(yù)測模型建立，利用預(yù)測模型對阿維菌素制劑溶液進行溶液濃度值預(yù)測具有較好的預(yù)測精度。

圖6 阿維菌素制劑驗證集中預(yù)測值與實測值線性擬合曲線 (a)：制劑1；(b)：制劑2

綜合以上分析，發(fā)現(xiàn)阿維菌素原藥溶液及阿維菌素制劑溶液的三維熒光光譜圖在Ex約為250～290 nm，Em約為280～320 nm區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)了熒光特征峰區(qū)域。在組分更為復(fù)雜的阿維菌素制劑溶液中阿維菌素有效成分仍然能表現(xiàn)出熒光效應(yīng)，但其會受到內(nèi)濾效應(yīng)的影響而呈現(xiàn)區(qū)別于阿維菌素原藥溶液的變化規(guī)律；阿維菌素原藥及兩種制劑溶液驗證集中預(yù)測值與實測值線性擬合的R2分別為0.999，0.935和0.985，RMSE分別為0.359，1.945和0.858 mg·L-1，具有較好的預(yù)測精度。

3 結(jié) 論

(1)阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜圖出現(xiàn)明顯熒光峰1，其熒光峰區(qū)域范圍約為Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm。熒光峰1的峰值均在Ex=270 nm取得。確定Ex=270 nm為阿維菌素的最佳激發(fā)波長，此熒光峰區(qū)域為阿維菌素的熒光特征峰區(qū)域。

(2)阿維菌素制劑溶液的三維熒光光譜圖出現(xiàn)兩個明顯的熒光峰區(qū)域(1：Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm；另一區(qū)域：Ex=250～400 nm，Em=380～470 nm)。熒光峰1與阿維菌素原藥溶液產(chǎn)生的熒光特征峰相近，判斷為制劑中阿維菌素有效成分產(chǎn)生的熒光效應(yīng)。另一熒光特征峰區(qū)域判斷為制劑溶液中其他填充劑及輔助劑所產(chǎn)生的熒光效應(yīng)。

(3)由阿維菌素原藥溶液及兩種不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的阿維菌素制劑溶液所出現(xiàn)的相同熒光特征峰區(qū)域Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm，可以判斷阿維菌素有效成分的熒光效應(yīng)在組分更為復(fù)雜的制劑溶液中能夠不被其他成分所掩蓋。以此熒光峰區(qū)域內(nèi)的最大熒光強度與對應(yīng)溶液濃度建立關(guān)系，能夠得到相應(yīng)的預(yù)測模型。本研究進一步驗證了利用熒光光譜檢測阿維菌素含量的可行性，為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中阿維菌素農(nóng)藥殘留的快速檢測提供數(shù)據(jù)參考。