結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤遠(yuǎn)癌組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與表達(dá)譜改變

藍(lán)淞耀，龔 晗，韋成江，唐 琪，馮 雁，林 源

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸肛門病區(qū)，廣西 南寧 530021)

腫瘤是一類以細(xì)胞異常增殖為特點的全身性疾病，惡性腫瘤細(xì)胞會侵入健康組織，并通過淋巴或循環(huán)系統(tǒng)擴散到身體的其他部位，同時腫瘤細(xì)胞可以通過釋放細(xì)胞外旁分泌信號來影響微環(huán)境[1]。在目前結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療指南中，手術(shù)治療均有不同程度的肝組織保留[2,3]。為手術(shù)切緣及遠(yuǎn)離腫瘤的組織在常規(guī)病理檢測中檢測不到腫瘤細(xì)胞，因此被認(rèn)為是正常組織，但這些細(xì)胞是否受到腫瘤組織作用還未有研究進行探討。通過亞細(xì)胞層面或基因表達(dá)的改變可能揭示其中的變化。因此本研究通過電鏡觀察人肝轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本及小鼠肝轉(zhuǎn)移模型中腫瘤、癌旁、遠(yuǎn)癌組織細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)改變。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序比較小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤的癌旁、遠(yuǎn)癌和健康對照小鼠正常肝組織的基因表達(dá)差異，評價在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中，腫瘤細(xì)胞對遠(yuǎn)癌肝細(xì)胞組織的影響及機制。

1 資料與方法

1.1研究對象

1.1.1樣品來源:選擇2019年9月至2020年10月，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸肛門病區(qū)收治的5例結(jié)直腸癌合并肝轉(zhuǎn)移患者的肝轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)標(biāo)本進行研究。入組患者均滿足以下入組標(biāo)準(zhǔn)：①通過纖維腸鏡行結(jié)直腸腫物活檢，活檢病理確診為結(jié)直腸癌并通過術(shù)中病理確診合并肝轉(zhuǎn)移；②術(shù)前通過血清學(xué)、影像學(xué)檢查排除其他惡性腫瘤、精神疾病、免疫相關(guān)疾病；③術(shù)前未經(jīng)過任何抗腫瘤治療；④術(shù)前術(shù)后均未使用免疫相關(guān)治療藥物；⑤臨床資料完整，依從性良好，簽署知情同意書。手術(shù)后樣本按如下標(biāo)注進行取材，將距離腫瘤≤1cm的組織定義為癌旁組織，距離腫瘤≥2cm的組織定義為遠(yuǎn)癌組織，手術(shù)切緣處為正常組織。取材后樣本用無菌PBS清洗，并立刻用樣本使用3%戊二醛固定后用于電鏡分析。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2動物模型建立與分組:C57BL/6N小鼠，雌性，6～8周齡(賽業(yè)蘇州生物科技有限公司)。小鼠護理和處理程序委托賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司進行，處理程序經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠使用脾注射方式接種MC38細(xì)胞[4]。正常組小鼠均脾臟注射等劑量PBS。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠生存狀態(tài)。術(shù)后12～14d后用1.25%三溴乙醇腹腔麻醉，開腹經(jīng)下腔靜脈取血處死，對新鮮肝臟組織進行不同分區(qū)的取材。選取距離可見腫瘤邊緣小于5mm的組織為癌旁組織，大于5mm部位為遠(yuǎn)癌組織。同時取正常組小鼠肝臟為正常肝組織對照。將組織分成3份，其中1份用福爾馬林溶液浸泡，用于組織病理學(xué)分析；1份用3%戊二醛固定，用于透射電鏡觀察；1份采用液氮冷凍，-80℃低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2電鏡樣本制備與觀察:樣本使用3%戊二醛固定。PBS沖洗3次后，1%鋨酸固定，乙醇-丙酮逐級脫水，丙酮：包埋劑=1∶1浸透組織過夜，純包埋劑包埋，樹脂固定。切片后行鉛鈾染色，在廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡中心觀察，電鏡型號為日本HITACHI公司H-7650型透射電鏡。

1.3蘇木素-伊紅染色(HE染色)烤片、在二甲苯中脫蠟、依次在100%、95%、85%、75%濃度梯度的酒精中水化，浸入蒸餾水中1min。蘇木素染色30s～1min，TBST返藍(lán)；伊紅染色，根據(jù)切片的著色情況滴加蒸餾水沖洗，終止染色。中性樹脂封片。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序:取組織50mg，液氮冷凍研磨，溶解蛋白，提取RNA。使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA完整性和總量。建庫起始RNA為total RNA，總量≥1μg。采用AMPure XP beads進行建庫。測序采用Illumina NovaSeq 6000進行。以參考基因組(Database version 104.39)和基因模型進行注釋。使用HISAT2 v2.0.5 構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5 將配對末端clean reads與參照基因組比對。

1.5生信分析:使用DESeq2軟件包(1.20.0)進行組間差異表達(dá)基因分析，每組2個樣本重復(fù)。使用Benjamini&Hochberg方法校正P值。以|FC|>2且校正adj值<0.05作為顯著差異表達(dá)的閾值。使用clusterProfiler(v3.4.4)軟件分析差異表達(dá)基因的KEGG通路富集。

2 結(jié) 果

2.1肝轉(zhuǎn)移癌患者的肝內(nèi)遠(yuǎn)癌組織細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)改變:正常肝細(xì)胞在電鏡下細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富，有成堆糖原及眾多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[5]。在本研究結(jié)果中，5例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的肝內(nèi)遠(yuǎn)癌組織大部分細(xì)胞均出現(xiàn)核渙散的現(xiàn)象，少部分形態(tài)較圓。部分細(xì)胞異染色質(zhì)呈斑點狀散在核漿(圖1a1)。腫瘤組織的細(xì)胞核仁不明顯，核溶解增多，核質(zhì)邊際濃縮，核周隙變大。部分細(xì)胞核膜破裂，核呈碎裂形態(tài)，呈現(xiàn)更不穩(wěn)定狀態(tài)(圖1b1)。遠(yuǎn)癌肝細(xì)胞中大量線粒體出現(xiàn)形態(tài)改變。線粒體形態(tài)不均一，部分線粒體膨大腫脹，甚至呈空泡狀，線粒體嵴變短變少甚至消失(圖1a2)。與正常細(xì)胞相比，遠(yuǎn)癌肝細(xì)胞內(nèi)大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)、腫脹，并可見大量核糖體分布在腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之上(圖1a3)。腫瘤組織的線粒體形態(tài)不規(guī)則，數(shù)目不恒定，多數(shù)線粒體嵴減少或者消失呈空泡狀。細(xì)胞內(nèi)少見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1b2、3)。綜上所述，遠(yuǎn)癌組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中均出現(xiàn)顯著改變，但與癌細(xì)胞相比，結(jié)構(gòu)異常程度不同。

圖1 人肝轉(zhuǎn)移病灶電鏡結(jié)果

2.2小鼠肝臟遠(yuǎn)癌組織出現(xiàn)與正常肝組織不同的改變:本研究采用小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型進一步驗證遠(yuǎn)癌組織中的變化。對比健康對照組小鼠，建模組小鼠的肝臟出現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)移病灶，直徑1-2mm為主(圖2a)。HE染色顯示，健康對照組小鼠肝臟與模型組小鼠癌旁>1mm的細(xì)胞病理形態(tài)無明顯差異(圖2b)。電鏡分析顯示正常小鼠肝臟細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，細(xì)胞膜形態(tài)正常。細(xì)胞核圓。細(xì)胞內(nèi)可見大量線粒體形態(tài)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)。細(xì)胞內(nèi)容豐富，視野內(nèi)可見大量含脂滴或蛋白質(zhì)空泡樣結(jié)構(gòu)(圖2c)。小鼠遠(yuǎn)癌組織中肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整，出現(xiàn)呈異型性的核，異染色質(zhì)向核膜邊緣聚集，邊緣呈鋸齒狀。部分視野中細(xì)胞溶解狀態(tài)明顯，可見核溶解、核固縮等凋亡狀態(tài)(圖2d1)。線粒體出現(xiàn)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對對照組更為腫脹(圖2d2)。腫瘤組織視野下細(xì)胞與細(xì)胞之間邊界不清。大部分細(xì)胞核仁不明顯，核異型性數(shù)量較多。有些細(xì)胞核膜破裂，異染色質(zhì)凝聚在核膜下，核呈碎裂形態(tài)(圖2e1)，線粒體出現(xiàn)空泡化，數(shù)量增多；腫瘤組織中部分線粒體脫髓鞘，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糅合(圖2e2)。小鼠肝轉(zhuǎn)移模型遠(yuǎn)癌組織的肝組織細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)變化與人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移癌遠(yuǎn)癌組織具有一定程度的相似。

2.3遠(yuǎn)癌組織中表達(dá)譜發(fā)生改變:為探索遠(yuǎn)癌組織中基因表達(dá)的改變，將小鼠模型肝臟中的遠(yuǎn)癌組織、癌旁組織及癌組織、對照組正常肝組織進行了轉(zhuǎn)錄組分分析，以|FC|>2且校正adj值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，分別得到癌組織與正常組織組上調(diào)基因922個、下調(diào)基因546個、癌旁組織與正常組織組上調(diào)基因336個、下調(diào)基因199個、遠(yuǎn)癌組織與正常組織組上調(diào)基因2891個、下調(diào)基因826個(圖3a)。對以上各組的上、下調(diào)基因進行KEGG通路富集。癌組織與正常組織比較組、癌旁組織與正常組織比較組中上調(diào)基因有阿米巴遷移、PI3K-Akt信號通路等共同富集通路(圖3b1、2)。遠(yuǎn)癌組織與正常組織組相比上調(diào)基因在細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等通路上富集(圖3c1)。其中下調(diào)基因主要為：DNA加合物的化學(xué)致癌作用、甾類激素生物合成、視黃醇代謝等(圖3c2)。

2.4遠(yuǎn)癌、癌旁與癌組織中共同上調(diào)的信號通路:將癌組織與正常組織組、癌旁組織與正常組織組、遠(yuǎn)癌組織與正常組織組的上調(diào)基因取交集(圖4a)，將共同的上調(diào)基因進行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)基因在化學(xué)致癌作用、ECM受體相互作用等通路上富集(圖4b、表1)。從共同上調(diào)的基因中選取連接度最大的基因進行互作網(wǎng)絡(luò)分析(圖4c)，可以觀察到連接度較大的基因分布在Col家族(如Col膠原蛋白Col2A)、Bub家族、Kif家族、Jun基因等。

表1 共同富集基因KEGG通路及基因列表

圖2 小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型

圖3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

圖4 遠(yuǎn)癌組織、癌旁與癌組織中共同上調(diào)的信號通路

3 討 論

腫瘤可以包括細(xì)胞外旁分泌信號等多種不同形式作用與腫瘤微環(huán)境中的不同細(xì)胞[1]。過往研究集中在癌對癌旁組織的作用，而對于遠(yuǎn)癌組織中的影響研究很少。本研究通過對結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移癌患者及小鼠肝轉(zhuǎn)移動物模型的遠(yuǎn)癌組織進行細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移癌的遠(yuǎn)癌組織病理組織形態(tài)正常的細(xì)胞內(nèi)，同樣出現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。而通過表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)癌細(xì)胞出現(xiàn)部分與癌細(xì)胞相同的細(xì)胞通路上調(diào)。

在遠(yuǎn)癌肝組織中，呈現(xiàn)出與正常肝組織不一樣的改變，這些改變中的一部分與腫瘤細(xì)胞的改變一致，這很有可能是惡性腫瘤在浸潤轉(zhuǎn)移過程中對正常機體的影響和對鄰近細(xì)胞的活性誘導(dǎo)所致。對于腫瘤細(xì)胞的研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞非典型的核形態(tài)，與基因組完整性和細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)及其功能的變化有關(guān)。遠(yuǎn)癌組織中的細(xì)胞核異型性明顯，呈正常細(xì)胞核形態(tài)的較少。而異型細(xì)胞核的增多恰是遠(yuǎn)癌組織被腫瘤影響的證據(jù)之一。在許多相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞基因組和核亞結(jié)構(gòu)及其功能的變化進而導(dǎo)致其表現(xiàn)出非典型的核形態(tài)[6]。腫瘤細(xì)胞的核仁增大，染色質(zhì)亦可呈不同的形態(tài)[7]。其次，通過本研究的電鏡觀察可以看到遠(yuǎn)癌組織中表現(xiàn)出與腫瘤組織類似的線粒體數(shù)量增多的現(xiàn)象。線粒體可以控制活性氧、癌蛋白和腫瘤代謝物的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)、自噬和執(zhí)行細(xì)胞死亡，并通過癌細(xì)胞內(nèi)部和癌細(xì)胞外部機制影響機體新陳代謝[8]。此外，腫瘤細(xì)胞在內(nèi)部壓力(如致癌基因的激活)和外部不利環(huán)境信號(如缺氧和營養(yǎng)缺乏)的刺激下，能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)[9]。腫瘤細(xì)胞通過增加蛋白質(zhì)的合成以滿足腫瘤發(fā)生過程中代謝增加的需求。為此增殖的癌細(xì)胞需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的快速擴張以分裂并合成足夠的蛋白質(zhì)分配給子細(xì)胞[10]。這些相關(guān)報道和本研究中觀察到遠(yuǎn)癌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變的現(xiàn)象相一致。Azizidoost S等通過回顧分析認(rèn)為，當(dāng)癌細(xì)胞滲入肝臟后會改變肝正常生態(tài)位細(xì)胞，肝生態(tài)位中的正常肝細(xì)胞會受到異常肝再生和炎癥和纖維化等病理生理因素的影響，進而獲得腫瘤易感性[11]。在本研究中觀察到以上遠(yuǎn)癌組織的細(xì)胞形態(tài)改變，推測為惡性腫瘤在局部浸潤過程中的活性誘導(dǎo)所致。腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)改變了遠(yuǎn)癌組織細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)，為新腫瘤形成或原腫瘤在器官內(nèi)的微轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移提供遺傳物質(zhì)、能量和蛋白質(zhì)等先決條件。

腫瘤在局部浸潤和蔓延的過程中大致分為四個步驟：腫瘤細(xì)胞間的表面黏著分子減少、與基底膜的黏著增加、正常細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞借助阿米巴樣運動移動完成局部浸潤蔓延等生物活動。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因在黏著斑、ECM受體相互作用等通路富集，這一結(jié)果提示了遠(yuǎn)癌組織中出現(xiàn)了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)果的重塑。同時，在基因互作網(wǎng)絡(luò)中，連接度較高的基因大多參與腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的調(diào)控，如Adamts、Bub1、Col4a1/2、Col5a1、Col6a1等基因在不同的腫瘤研究中被證實分別參與不同的腫瘤相關(guān)信號通路軸的調(diào)節(jié)，促進腫瘤轉(zhuǎn)移并增加了罹患腫瘤的易感性。于此同時，腫瘤細(xì)胞在浸潤轉(zhuǎn)移的過程中會產(chǎn)生膠原酶以溶解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原成分使基底膜形成缺損有利于腫瘤細(xì)胞的通過。在本研究中Col3a1基因在遠(yuǎn)癌組織中表達(dá)上調(diào)。Col3a1可參與編碼Ⅲ型膠原蛋白，該蛋白的過表達(dá)能導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，膠原纖維直徑改變。體現(xiàn)了腫瘤作為一類影響全身的疾病，其對機體的影響遠(yuǎn)不止于腫瘤區(qū)域，鄰近組織也常常受到波及[12]。通過本研究結(jié)果可以推測腫瘤組織調(diào)控遠(yuǎn)癌組織出現(xiàn)了適應(yīng)性的改變，為腫瘤細(xì)胞向周圍的浸潤提供了更好的條件。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的遠(yuǎn)癌組織盡管仍然維持正常的細(xì)胞組織形態(tài)，但亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)及細(xì)胞表達(dá)譜均與正常細(xì)胞存在顯著差異。這一現(xiàn)象對于肝轉(zhuǎn)移的形成、復(fù)發(fā)及患者預(yù)后的影響還有待更多研究進行證實。