寧夏某肉牛場(chǎng)牛呼吸道疾病綜合征相關(guān)病原檢測(cè)及分型鑒定

常益銘，岳華，2，湯承，2

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

目前，臨床上引起牛呼吸道疾病的病原感染形式已由單一感染發(fā)展為多種病原混合感染，導(dǎo)致牛呼吸道疾病防治難度加大，使其成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的一大難題。

牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是由外界環(huán)境條件、動(dòng)物機(jī)體和多種病原體相互作用引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病統(tǒng)稱，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一[1]。引起B(yǎng)RDC 的病原種類繁多，主要由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhoea virus，BVDV）、牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virustype 3，BPIV-3）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis，IBRV）、牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛細(xì)小病毒（bovine parvovirus，BPV）以及多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P.multocida）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimiahaemolytica，M.haemolytica）、牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）等組成[2-3]。其中，許多病毒，如BVDV和IBRV，能夠?qū)εＴ斐沙掷m(xù)性感染，導(dǎo)致感染牛對(duì)其他病原易感性增加，在應(yīng)激條件下，機(jī)體抵抗力降低時(shí)，不僅感染的病毒會(huì)在體內(nèi)大量繁殖，也會(huì)繼發(fā)感染其他病原，導(dǎo)致感染牛出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀[4]。臨床上，BRDC 病因復(fù)雜，引起的癥狀也極為相似，很難根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行病原判定，必須配合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2022 年3 月冬春換季期間，寧夏某存欄牛3 000 頭的某肉牛場(chǎng)暴發(fā)BRDC，各種年齡的牛均有發(fā)病，表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽、流膿性鼻液、呼吸困難和腹式呼吸等癥狀，發(fā)病率為28%，死亡率為5%，采用抗生素治療，效果不佳。為確定引發(fā)病情的病原，采集樣品進(jìn)行了BRDC 相關(guān)病原的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及分型鑒定，以便采取針對(duì)性防治措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢樣品 在該牛場(chǎng)無(wú)菌采集12 份病牛鼻腔深部棉拭子，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑與儀器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTMRT、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker等，購(gòu)于寶生物工程（大連）股份有限公司；LifeECO 基因擴(kuò)增儀，購(gòu)于杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白電泳儀，購(gòu)于Bio-Rad 公司；高速離心機(jī)，購(gòu)于Eppendorf 公司。

1.1.3 參考病毒（菌）株 IBRV、BPIV-3、BRSV、BAdV-3、BCoV、BPV、BVDV、P.multocida（Pm）、M.haemolytica（Mh）和M.bovis等陽(yáng)性核酸，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和核酸提取 在鼻腔深部棉拭子樣品中，每份加入5 mL 的PBS 溶液吹打混勻，渦旋3 min，10 000 r/min 離心3 min 后取上清液備用；采用TrizolTMReagent 提取樣品總RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)采用酚氯仿法提取樣品DNA。

1.2.2 樣品檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[5-12]報(bào)道的PCR和RT-PCR 方法，分別對(duì)12 份樣品進(jìn)行IBRV、BPIV-3、BRSV、BAdV-3、BCoV、BPV、BVDV、Mh、Pm和M.bovis核酸檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳鑒定后，選取陽(yáng)性樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，引物序列見表1。

1.2.3 病原分型鑒定 由于BCoV 和BAdV-3 僅有1 種血清型和基因型，因此只對(duì)Mh 和BAdV-3這兩種病原進(jìn)行分型鑒定。將經(jīng)PCR 反應(yīng)鑒定為Mh 陽(yáng)性的樣品，按照文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法進(jìn)行血清型鑒定（表2）；將BVDV 5'-UTR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳鑒定后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

2.1 BRDC 相關(guān)病原PCR 檢測(cè)

BRDC 相關(guān)病原檢測(cè)結(jié)果顯示：12 份鼻拭子樣品中，共檢出BAdV-3、BCoV、BVDV 和Mh共4 種病原，陽(yáng)性檢出率分別為100%（12/12）、66.67%（8/12）、66.67%（8/12）和100%（12/12），其他病原均無(wú)檢出；陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序均確定為特異性擴(kuò)增（圖1），證實(shí)該場(chǎng)BRDC 病情由BAdV-3、BCoV、BVDV和Mh等4種病原感染引起。

表1 PCR 檢測(cè)引物信息

表2 Mh 分型引物信息

圖1 陽(yáng)性樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 病原混合感染統(tǒng)計(jì)

樣品檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：此次牛場(chǎng)的BRDC病情由BAdV-3、Mh、BCoV 和BVDV 混合感染引起，共有BAdV-3+Mh、BAdV-3+Mh+BVDV、BAdV-3+Mh+BCoV 和BAdV-3+Mh+BCoV+BVDV共4 種不同形式的混合感染組合，其混合感染率分別為16.67%、16.67%、25.00%和41.67%。

2.3 病原分型鑒定

將檢測(cè)到的Mh 陽(yáng)性樣品，采用分型引物Hypothetical protein、Core-2/I-Branching enzyme和TupA-like ATPgrasp3 進(jìn)行血清分型，結(jié)果僅有Hypothetical protein 擴(kuò)增（圖2），表明該場(chǎng)流行的Mh 為莢膜血清型A1 型菌株；對(duì)8 個(gè)BVDV陽(yáng)性樣品的5'-UTR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型，結(jié)果所有樣品均與1a 亞型毒株聚為一支（圖3），表明該場(chǎng)流行的毒株均為BVDV 的1a 亞型。

3 討論

圖2 Mh 分型鑒定結(jié)果

圖3 BVDV 5'-UTR 基因核苷酸序列進(jìn)化樹

環(huán)境與多種病原體的相互作用是BRDC 的主要發(fā)病形式。本研究在寧夏某牧場(chǎng)患有BRDC癥狀的牛深部鼻腔棉拭子樣品中檢測(cè)到了BAdV-3、BVDV、BCoV 和Mh 共4 種病原，其中BAdV-3和Mh 的檢出率均為100%，BCoV 和BVDV 的檢出率均為66.67%，表明這4 種病原是造成該牛場(chǎng)發(fā)生BRDC 的主要病原。12 份樣品均存在不同病原組合的混合感染情況，表明該牛場(chǎng)病情較為復(fù)雜。冬春換季期間氣候不穩(wěn)定，這為BRDC 的發(fā)生創(chuàng)造了有利條件，同時(shí)多種病原的混合感染又增加了病情的嚴(yán)重程度，使得死亡率上升，也給BRDC診斷與治療帶來了阻礙[14]。因此，當(dāng)天氣突變、斷奶和運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素發(fā)生時(shí)，應(yīng)做好牛群的抗應(yīng)激處理。同時(shí)要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，定期檢測(cè)牛群中BRDC 相關(guān)病原的抗體水平[15-16]，以有效預(yù)防BRDC 發(fā)生；發(fā)病時(shí)，應(yīng)盡早進(jìn)行病原檢測(cè)，以便采取針對(duì)性措施，有效控制病情。

一般認(rèn)為，病毒對(duì)機(jī)體的持續(xù)感染和免疫抑制是造成BRDC 發(fā)生的主要誘因。本研究在12 份患有BRDC 的牛深部鼻腔棉拭子樣品中共檢測(cè)到BVDV、BCoV 和BAdV-3 等3種病毒，證實(shí)了BRDC 多病原混合感染的復(fù)雜性。BVDV 是黃病毒科瘟病毒屬成員，1946 年于美國(guó)被首次分離到，最初發(fā)現(xiàn)其主要引起消化系統(tǒng)疾病，因此將其命名為BVDV，隨后發(fā)現(xiàn)BVDV 還可以損傷呼吸、生殖和免疫系統(tǒng)，最主要的危害是引起牛的免疫抑制和持續(xù)性感染[17-18]。BVDV 常作為原發(fā)病原，與細(xì)菌、支原體等其他病原造成混合感染，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)造成了無(wú)法估量的損失，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄。BCoV被認(rèn)為是引起犢牛腹瀉和成年牛冬痢以及各年齡段牛呼吸道疾病的重要病原，主要通過糞-口傳播或吸入含有病毒顆粒的氣溶膠而造成感染，對(duì)于其最初的入侵門戶目前仍然存在較大爭(zhēng)議[19]。BCoV 除對(duì)牛易感外，對(duì)長(zhǎng)頸鹿、駱駝等多種動(dòng)物也均具有易感性，甚至對(duì)人也有易感性，因而具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[20-22]。之前常認(rèn)為，引起B(yǎng)RDC 的病毒性病原主要有BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV和BCoV 等，但最近研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，BAdV-3 在患有BRDC 的牛群中廣泛存在，并且與BRDC 的發(fā)生具有顯著的相關(guān)性（P＜0.000 1）。本課題組前期在11 個(gè)發(fā)生BRDC 的肉牛引種場(chǎng)中檢測(cè)到的BAdV-3 陽(yáng)性率為78.7%，成功分離到1株fiber基因缺失毒株（BO/YB24/17/CH），并且證實(shí)該毒株在我國(guó)具有廣泛的地域分布[25]。而本研究在12 份BRDC 發(fā)病牛的深部鼻腔棉拭子中檢測(cè)到BAdV-3的陽(yáng)性率為100%，更加證實(shí)了之前的檢測(cè)結(jié)果，表明BAdV-3 也是引起B(yǎng)RDC 的重要病原，應(yīng)當(dāng)對(duì)該病毒引起足夠的重視。

細(xì)菌性病原體在BRDC 中的作用常表現(xiàn)為繼發(fā)感染。細(xì)菌性病原雖然不是BRDC 的原發(fā)性病原，但當(dāng)它與其他原發(fā)性呼吸道病原混合感染時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致感染動(dòng)物嚴(yán)重的臨床癥狀，致使其死亡率上升[26]。因此，當(dāng)發(fā)生BRDC 時(shí)應(yīng)當(dāng)重視細(xì)菌感染的防治，及時(shí)確定細(xì)菌類型，采用敏感類抗生素，盡可能減少損失。本研究在12 個(gè)牛深部鼻腔棉拭子中檢測(cè)到的Mh 陽(yáng)性率為100%，證實(shí)其是造成此次呼吸道疾病的主要細(xì)菌性病原。Mh 常作為共生菌分布于正常的牛上呼吸道中，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激、病毒感染等原因造成機(jī)體抵抗力下降時(shí)，會(huì)在上呼吸道大量增殖，并侵入下呼吸道，引起較為嚴(yán)重的肺炎[27]。Mh 共有12 個(gè)血清型，其中A1、A2 和A6 是流行較為廣泛的血清型[28]，而A1 和A6 是引起牛肺炎的主要血清型。A2 血清型常存在于健康牛的上呼吸道，當(dāng)機(jī)體受到外界應(yīng)激或混合感染時(shí)，A2 血清型會(huì)迅速被A1 血清型所取代。而本研究在12 份深部鼻腔棉拭子樣本中檢測(cè)到的Mh 陽(yáng)性率為100%，并且均為A1 血清型菌株，證實(shí)該牛場(chǎng)Mh 的優(yōu)勢(shì)血清型是A1 型。抗生素是治療細(xì)菌性疾病最有效的方法。近年來，隨著抗生素的不科學(xué)使用，關(guān)于細(xì)菌耐藥性的報(bào)道也越來越多。本案例中，肉牛場(chǎng)曾使用抗生素進(jìn)行治療，但治療效果不佳，表明Mh 對(duì)于該牧場(chǎng)所使用的抗生素可能存在耐藥情況，因此有必要進(jìn)行細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)，選取敏感抗生素進(jìn)行治療。

根據(jù)該牛場(chǎng)發(fā)病牛的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，最終確定該肉牛場(chǎng)發(fā)生的BRDC 由BVDV 1a 亞型、Mh A1 血清型以及BAdV-3、BCoV 混合感染引起。鑒于目前BRDC 由多種病原混合感染引起，加強(qiáng)牛場(chǎng)生物安全管理，減少牛群應(yīng)激，給予良好的生長(zhǎng)環(huán)境和制定合理免疫程序等綜合防控措施，仍然是防制BRDC 最有效的手段。