李乾龍,王萬雯,吳萌華,楊應東,萬潔,文建國,殷蓓蓓,郝桂英
(1.西昌學院動物科學院,四川西昌 615013;2.攀枝花市農林科學研究院畜牧水產所,四川攀枝花 617061;3.西昌華寧生物科技有限公司,四川西昌 615000)
立克次體是一類以蜱為主要傳播媒介的病原微生物,是專性寄生于真核細胞內的革蘭氏陰性原核生物,介于細菌與病毒之間,較接近于細菌,在蜱蟲體內可經卵垂直傳播給下一代,通過叮咬可水平傳播給宿主,引起多種人獸共患病[1]。在遺傳進化史上,立克次體主要分為斑疹傷寒和斑點熱群立克次體[2]。目前我國流行的立克次體至少有10種[3],包括日本立克次體(Rickettsia japonica)、黑龍江立克次體(Rickettsia heilongjiangensis)、立克次體XY99(Rickettsiasp.XY99)、拉烏爾立克次體(Rickettsia raoultii)、西伯利亞立克次體BJ-90亞種(Rickettsia sibiricasubsp.BJ-90)等[4]。近幾年我國又發(fā)現了幾種新的蜱傳立克次體,如Candidutus Rickettsia jiaonani[5]、Rickettsia erhaii[6]等。隨著新的立克次體不斷被發(fā)現,該病原逐漸受到了更多學者的重視。
我國已先后從黑龍江、新疆、內蒙古、北京、福建、海南、廣東、云南、廣西、四川等?。▍^(qū)、市)的蜱中檢測到立克次體[7-8]。Yuan等[9]在我國云南、廣西、廣東等地檢測到新型立克次體GD01 株,總陽性率為12.5%(71/569)。Zhang等[10]報道我國四川省蒼溪縣主要流行兩種立克次體,總體陽性率為33.5%(63/188)。隨著調查研究深入,我國多地發(fā)現蜱攜帶立克次體,且其流行范圍廣,潛在危害大。
攀西地區(qū)位于四川省西南部,山場廣闊,河谷光熱資源豐富,這為動植物的生長發(fā)育提供了優(yōu)良環(huán)境,同時也給蜱類孳生提供了條件。本地區(qū)牛羊以放牧為主,因此增加了牛羊被蜱叮咬的概率和感染蜱傳病原的風險。目前關于攀西地區(qū)蜱的區(qū)系分布及蜱傳立克次體感染情況的調查研究報道較少。為了解攀西地區(qū)蜱傳立克次體的流行情況,對采集自攀西地區(qū)的蜱進行種類鑒定和立克次體分子檢測,以期為攀西地區(qū)蜱傳立克次體病的綜合防控提供依據。
2021 年6 月至2022 年3 月,在涼山彝族自治州和攀枝花市,隨機選擇牛羊,共采集其體表的蜱252 只,其中西昌市38 只(羊源10 只、牛源28 只)、鹽源縣23 只(牛源)、美姑縣30 只(羊源)、木里縣19 只(羊源)、會東縣21 只(羊源)、布拖縣7 只(羊源)、昭覺縣7 只(牛源)、普格縣7只(牛源)、米易縣40 只(羊源)、鹽邊縣60 只(羊源),編號標記后保存于1.5 mL 離心管中待檢。
冷凍混合球磨儀(MM400),德國萊馳公司產品;電泳儀(JY600E),北京君意電泳儀科技有限公司產品;SDS-PAGE 凝膠成像系統(tǒng),美國伯樂GelDocXR+公司產品;銀制PCR 儀(Nexus GSX)、高速離心機(5810R)、冰箱(U725)、可調微量移液槍,均為德國艾本德公司產品;試劑主要有:2×EasyTaqPCR superMix、DL 2 000 DNA Maker、TBE(tris-硼酸電泳緩沖液)、核酸染料、生理鹽水等。
首先對蜱進行觀察,根據鄧國藩等[11]主編的《中國經濟昆蟲志.硬蜱科》進行初步形態(tài)學鑒定;然后將蜱蟲洗凈放入1.5 mL 離心管中(如為成蜱可剪取一半),用干凈的剪刀將蜱蟲剪碎后加入200 μL 滅菌生理鹽水,再向離心管中加入4 粒鋼珠,研磨8 min 及以上;取出鋼珠后,按照血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA 并置于-80 ℃冰箱保存。
根據已發(fā)表文獻[12]對蜱蟲16S rRNA 進行擴增,引物序列見表1。PCR 擴增體系(25.0 μL):
2×EasyTaqPCR superMix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,引物T16SP1和T16SP2各1.0 μL,模板1.0 μL。PCR 擴增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s,共38 個循環(huán);72 ℃ 6 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得到的陽性樣本進行切膠送生物公司測序,通過序列比對確定蜱種類。
表1 蜱種類鑒定引物信息
采用郭利萍[13]報道的引物,擴增外膜蛋白A編碼基因(ompA);采用高悅等[2]報道的套式PCR引物,擴增立克次體檸檬合成酶編碼基因(gltA)。以上引物均由上海杰李生物有限公司合成,引物序列見表2。
表2 立克次體引物名稱、序列及其目的條帶
PCR 擴增體系(25.0 μL):2×EasyTaqPCR superMix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各1.0 μL,模板1.0 μL。
ompA基因擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、46 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,共35 個循環(huán);72 ℃ 6 min。
gltA基因第一輪擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 80 s,共35 個循環(huán);72 ℃5 min。第二輪擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35 個循環(huán);72 ℃5 min。
PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳,選取陽性產物送至生工生物工程(成都)有限公司雙向測序。
將測序得到的立克次體gltA、ompA基因片段,經拼接剪切后通過Blast 進行同源性比對,下載同源性較高的序列作為參考序列,同時下載不同種立克次體的同源基因序列,利用MEGA-X 通過Maximum Likelihood 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并設置自舉值為1 000。
立克次體感染情況用Excel 軟件分析。對不同地區(qū)、不同宿主的蜱攜帶立克次體陽性率,利用SPSS 21.0 軟件進行卡方檢驗。當P<0.05 時,差異顯著即存在統(tǒng)計學意義;P>0.05 時,差異不顯著。
對252 只蜱蟲先進行形態(tài)觀察鑒定,再通過PCR 擴增16S rRNA 基因,經過1%瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現電泳條帶與目的條帶(460 bp)基本一致(圖1)。陽性樣本測序結果經Blast 比對,確定為微小扇頭蜱和褐黃血蜱。
PCR 擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳后得到的目的條帶均與預期目的片段(ompA為510 bp,gltA為381 bp)大小一致(圖2),分別擴增出74份ompA基因和11份gltA基因陽性樣本。
圖1 蜱16S rRNA 基因片段PCR 擴增電泳結果
圖2 立克次體ompA、gltA 基因PCR 擴增電泳結果
2.2.1ompA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建共有29 個陽性樣本ompA基因測序成功,進行剪切后序列長度約為486 bp。ompA基因片段序列同源性分析顯示:主要存在兩種斑點熱立克次體序列,樣本BTY227 序列與我國陜西省長角血蜱體內檢測到的敬信立克次體暫定種(Candidatus R.jingxinensis,MH932061)同源性為100%(483/483 bp),XCY98 與微小扇頭蜱中檢測到的立克次體共生菌(Rickettsia endosymbiontofRhipicephalus microplus,MN537556)同源性為100%(486/486 bp)。以Rickettsia akari為外群,基于ompA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示:BTY227 與敬信立克次體暫定種聚為一支,親緣關系近;XCY98 與立克次體共生菌聚為一支,親緣關系近,且與馬賽立克次體、扇頭立克次體有較近的親緣關系。
圖3 基于ompA 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.2gltA基因擴增結果分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建共有11 份陽性樣本gltA基因測序成功,序列長度約為366 bp。gltA基因片段序列同源性分析顯示:主要存在兩種斑點熱立克次體序列,樣本BTY227與從我國南方微小扇頭蜱體內分離的敬信立克次體暫定種(Candidatus R.jingxinensis,MW114883)同源性為100%(366/366 bp),MYY86 與從意大利血紅扇頭蜱體內分離的馬賽立克次體(R.massiliae,KJ663741)同源性為99.73%(365/366 bp)。以Rickettsia bellii為外群,基于gltA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)顯示:BTY227 與敬信立克次體暫定種聚為一支,親緣關系近;MYY86 與馬賽立克次體聚為一支,有較近的親緣關系。
圖4 基于gltA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.3.1 不同種類 從采集的252 份蜱樣品中,共檢出立克次體74 份,總體陽性率為29.37%(74/252)。共檢出31 份敬信立克次體暫定種(Candidatus R.jingxinensis),其中西昌牛源9 份、米易羊源5 份、普格牛源2 份、會東牛源6 份、美姑牛源5 份、木里羊源1 份、布拖羊源3 份;檢出立克次體共生菌(Rickettsia endosymbiontofRhipicephalus microplus)2 份,均為西昌羊源;檢出馬賽立克次體(R.massiliae)1 份,為米易羊源。由此推斷,敬信立克次體暫定種為攀西地區(qū)立克次體優(yōu)勢種。
2.3.2 不同采集地 本次采集的蜱來自10 個縣市,不同采集地的蜱攜帶立克次體陽性率不同。ompA基因檢測結果(表3)顯示:布拖陽性率最高,為57.14%,其次為西昌55.26%,會東42.86%;經卡方檢驗,10 個縣市中,排除未檢測到立克次體的鹽源、昭覺后,剩余8 個縣市的蜱攜帶立克次體陽性率 差異顯著(P=0.023,<0.05)。gltA基因檢測結果(表3)顯示:同樣是布拖陽性率最高,為28.57%,其次為普格14.29%、美姑13.33%;經卡方檢驗,10 個縣市中,排除未檢出的縣市,不同縣市的蜱攜帶立克次體陽性率差異不顯著(P=0.611)。單位:%
表3 不同縣市蜱攜帶立克次體檢測陽性率統(tǒng)計
2.3.3 不同宿主 從總體來看,不同牛羊來源蜱攜帶的立克次體陽性率相近,其中牛源蜱攜帶的立克次體陽性率為29.55%,羊源蜱攜帶立克次體陽性率為29.27%(表4)。經卡方檢驗,牛、羊宿主蜱攜帶的立克次體陽性率差異不顯著(P=1.000)。但在西昌市,蜱攜帶的立克次體情況與宿主有顯著差異(P=0.009),而在美姑縣,蜱攜帶立克次體情況與宿主無顯著差異(P=0.708)。
因蜱的發(fā)育經歷了卵、幼蜱、若蜱、成蜱,因此通過形態(tài)學觀察需要鑒定人員具有豐富的經驗,因此分子學鑒定更受廣大學者青睞。用于蜱分子生物學鑒定的基因主要有16S rRNA、COI、COII、ITS-1、ITS-2[12,14-15]。16S rRNA 基因序列高度保守,因此常作為蜱種類鑒定靶基因。攀西地區(qū)幅員遼闊,地理、氣候等特點適合蜱生活繁衍。而該地區(qū)蜱的區(qū)系分布調查仍處于空白。本檢測發(fā)現,微小扇頭蜱為攀西地區(qū)的優(yōu)勢蜱種,并分布有褐黃血蜱。該結果與姚曉燕等[16]對我國微小扇頭蜱分布情況的總結相符。攀西地區(qū)位于川南,與云南省接壤且與其氣候特點類似,也屬于微小扇頭蜱生長的中高適生區(qū)。
表4 不同宿主來源蜱攜帶的立克次體檢測陽性率統(tǒng)計單位:%
目前針對蜱攜帶立克次體的檢測方法多樣,但用于流行病學調查的仍以分子生物學檢測方法為主,包括普通PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR 及自殺式PCR(suicide PCR)[17]。主要的靶基因有16S rRNA、檸檬合成酶基因(gltA)、外膜蛋白A 基因(ompA)、外膜蛋白B 基因(ompB)以及細胞表面抗原1(sca1)、細胞表面抗原4(sca4)、17 kDa 蛋白抗原等編碼基因。其中ompA與ompB對斑點熱群立克次體有較好的特異性及鑒別性,即不同斑點熱群立克次體,其ompA表現出種的特異性,對斑點熱群立克次體的基因型、亞型鑒定及分類具有重要意義,此外ompA基因還可以準確把握斑點熱群立克次體的遺傳變異特征[18]。
唐天才[19]報道四川省石渠縣斑點熱立克次體總陽性率為49.48%,盛悅[20]報道內蒙古斑點熱群立克次體總陽性率為37.7%。而本研究發(fā)現,攀西地區(qū)蜱攜帶立克次體陽性率為29.37%,低于上述兩個地區(qū)。攀西地區(qū)作為四川省的西部城市群,有發(fā)展農牧業(yè)得天獨厚的優(yōu)勢,屬于典型的半農牧地區(qū),相比純牧區(qū)的內蒙古及石渠縣,其立克次體陽性率的差異可能與蜱種類分布及氣候、海拔等自然條件不同有關。蜱蟲傳播需要借助宿主來完成,例如依靠鳥類遷徙、牲畜貿易等。攀西地區(qū)各地交通不便,蜱蟲傳播途徑受限,導致各地區(qū)蜱種類及數量有差異,進而導致其攜帶的立克次體陽性率不同。此外,采樣過程中經咨詢牧民與養(yǎng)殖戶得知,不同地區(qū)不同養(yǎng)殖戶的驅蟲意識參差不齊,導致個別地區(qū)蜱蟲孳生,蜱攜帶的立克次體陽性率較高。不同宿主蜱攜帶的立克次體陽性率差異不顯著,這與該地區(qū)蜱蟲無差別叮咬有關,而個別地區(qū)陽性率差異顯著可能與牛羊養(yǎng)殖模式不同等因素有關。
本研究證實,攀西地區(qū)存在3 種立克次體,其中敬信立克次體暫定種為優(yōu)勢種,其與Guo等[21]報道的陜西省長角血蜱體內敬信立克次體暫定種序列(MH932061)同源性高達100%;且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,兩個地區(qū)的立克次體處于同一分支。以上表明,敬信立克次體暫定種可能是國內多個地區(qū)的立克次體優(yōu)勢種,需要重點加強對其流行的控制。馬賽立克次體與斑點熱感染有關,首次于法國扇頭蜱屬體內被發(fā)現[22]。Wei等[23]首次在國內西北部的新疆伊犁縣圖蘭扇頭蜱體內檢測到馬賽立克次體,其蜱攜帶率為3.50%(4/114);Guo等[24]在西北部塔克拉瑪干沙漠圖蘭扇頭蜱體內檢測到馬賽立克次體,蜱攜帶率為1.71%(2/117)。本檢測發(fā)現,微小扇頭蜱的立克次體攜帶率為0.40%(1/252),與上述結果基本相符,存在低攜帶率現象且都發(fā)現于扇頭蜱屬。綜上,攀西地區(qū)存在發(fā)生立克次體病的潛在威脅,應重視蜱傳立克次體病預防。
目前攀西地區(qū)乃至涼山彝族自治州均缺乏系統(tǒng)的蜱種檢測及蜱傳立克次體的分析與研究。涼山州及周邊多為少數民族群居,天然放牧為主的飼養(yǎng)方式使得人們與自然及牲畜接觸增多,被蜱叮咬的概率較大,蜱傳立克次體病發(fā)病風險較高。因此,當地應做好對牛、羊等家畜的驅蟲工作,避免在蜱蟲活動高峰期放牧,采取相應防護措施,防止被蜱蟲叮咬。各縣市應設立哨點醫(yī)院,重點監(jiān)測、控制和治療蜱傳立克次體病,做好宣傳,提高群眾防范意識,以保證公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)有序發(fā)展。