獼猴桃潰瘍病病菌的多樣性及其檢測技術(shù)

胡施祺， 戴德江， 羅金燕， 朱潔， 安千里， 李斌*

(1.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058； 2.浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站，浙江 杭州 310020；3.上海市農(nóng)技推廣中心， 上海 201103； 4.溫州市植物保護與土壤肥料管理站，浙江 溫州 325000)

獼猴桃細菌性潰瘍病最早于20世紀(jì)80年代在美國加利福尼亞州[1]和日本神州靜岡縣[2-3]被發(fā)現(xiàn)，目前在美國、日本、法國、新西蘭、韓國、伊朗、意大利、葡萄牙和智利等國家以及中國陜西、安徽、重慶、四川、湖北、湖南、河南和河北等地區(qū)均有發(fā)生，具有擴展快、危害重、防治難等特點，嚴(yán)重影響獼猴桃的產(chǎn)量及果實質(zhì)量，給世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4]。中國、美國、新西蘭等國以及歐洲植物保護組織都已將獼猴桃細菌性潰瘍病菌列為植物檢疫對象和A2類檢疫性有害生物[5]。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)被認為是引起獼猴桃細菌性潰瘍病的主要病原菌，該病原菌能夠侵染獼猴桃屬的多種寄主，包括美味獼猴桃、中華獼猴桃、軟棗獼猴桃及狗棗獼猴桃[6]，引起葉斑葉枯、枝干枯裂潰爛、花器萎蔫壞死、皮孔變紅，病處伴隨菌膿分泌等癥狀[7]，造成樹體死亡、果皮變厚、果味變酸、果實變小、果形不一。該病菌的遠距離傳播主要通過進出口的苗木、接穗及花粉等[8]。

為有效遏制獼猴桃細菌性潰瘍病在我國的快速蔓延，建立其主要病原菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏和方便的檢測方法至關(guān)重要。本文綜述了國內(nèi)外學(xué)者對獼猴桃細菌性潰瘍病菌多樣性及檢測技術(shù)的研究進展情況，重點分析和比較了各類檢測技術(shù)的優(yōu)劣，為早期有效預(yù)防獼猴桃細菌性潰瘍病提供了借鑒。

1 獼猴桃細菌性潰瘍病菌的多樣性

1.1 病原菌的確定

1983年，Opgenorth[1]在美國加利福尼亞州首次發(fā)現(xiàn)了獼猴桃細菌性潰瘍病，通過生物學(xué)鑒定認為引起該病害的病原為丁香假單胞桿菌。1989年，Serizawa等[2-3]根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化及致病性試驗發(fā)現(xiàn)，1984年在日本靜岡暴發(fā)的獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌與丁香假單胞桿菌死李致病變種(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum，Psm)及丁香假單胞桿菌丁香致病種(Pseudomonassyringaepv.syringae，Pss)雖相似但存在明顯差異，死李致病變種對梨和日本杏有弱致病性，而對其他24種植株均無致病性，據(jù)此認為該獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌是丁香假單胞桿菌屬新的致病種，并將其命名為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Psa)。1993年，朱曉湘等[9]通過生物學(xué)方法將我國1986年東山峰農(nóng)場發(fā)生的獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌鑒定為Pss，但隨后意大利[10]、韓國[11]、法國、西班牙[12]、土耳其[13]、斯洛文尼亞[14]、新西蘭[15]及希臘[16]等國的獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌被鑒定為Psa，國內(nèi)陜西[17-18]、安徽[19]、福建[20]、四川[21]等多地獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌均被鑒定為Psa。目前，對于獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌的鑒定雖還沒有統(tǒng)一結(jié)果，但國內(nèi)外研究人員普遍認為獼猴桃細菌性潰瘍病的病原為Psa[21]。

1.2 遺傳多樣性

Psa菌群具有豐富的遺傳多樣性。2012年，Chapman等[22]利用管家基因、Ⅲ型效應(yīng)基因和植物毒素基因的多位點序列分析發(fā)現(xiàn)，全球至少包括4個具有不同進化軌跡的Psa類群：第一類群Psa1分離自日本，1992年在意大利暴發(fā)的Psa，可產(chǎn)生菜豆菌毒素；第二類群Psa2分離自韓國，這一類群均含有能產(chǎn)生冠菌素的質(zhì)粒，但是不含有產(chǎn)菜豆菌毒素的基因簇[23]；第三類群Psa3為分離自新西蘭特普克地區(qū)、智利奧希金斯和毛勒地區(qū)、中國陜西省的病原菌，2008年以后在意大利暴發(fā)，該類群既不能產(chǎn)生菜豆菌毒素也不能產(chǎn)生冠菌素，具有強致病性，已在全球流行，也被稱為Psa-V[7]；第四類群Psa4為此前流行于維多利亞州和西澳大利亞州的Psa，同樣該類群也不能產(chǎn)生菜豆菌毒素和冠菌素，并且比其他生物群毒力更弱，僅能引起葉斑而不會引起潰爛與枝條枯萎等其他癥狀，生理生化特征也與其他3個類群有明顯差異，該類群可以在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生高強度綠色熒光并能水解七葉苷，第四類群與其他3個類群在檸檬酸合成酶編碼基因(cts)的同源性也低于其他類群與丁香假單胞菌茶樹致病種(Pseudomonassyringaepv.theae，Psth)的同源性[24]，現(xiàn)已被歸為新變種P.syringaepv.actinidifoliorum(Psaf)[25]。2014年，Sawada等[26]在日本佐賀分離到獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌，通過形態(tài)特征、生理生化測定、分子檢測、致病性實驗及多位點序列分析鑒定，該病原菌為不同于其他4個類群的新類群，并將該類群命名為Psa5。第五類群目前僅在日本局部地區(qū)有報道，該類群與第二類群親緣性較近，但其既不具有第二類群保守的冠菌素合成基因，也沒有日本本土病原菌第一類群保守的菜豆菌毒素合成基因，與其他3個類群組成不同的是該類群基因組中含有45個Ⅲ型分泌效應(yīng)器基因[27]。

2 目前主要檢測技術(shù)

獼猴桃細菌性潰瘍病菌的經(jīng)典鑒定主要包括田間病害癥狀觀察和病菌的生物學(xué)測定等。田間可通過觀察癥狀進行初步鑒定，主要癥狀為枝干病部溢出大量初為乳白色、后變紅褐色的菌膿，上部枝條萎蔫死亡，葉片產(chǎn)生中間為褐色、邊緣為黃色暈圈的近圓形病斑。生物學(xué)鑒定主要包括細菌的分離純化、形態(tài)觀察等細菌學(xué)性狀及生理生化測定[5,9,28]。傳統(tǒng)方法鑒定雖不需要昂貴的儀器設(shè)備，但費時費力，而且特異性不高，隨著微生物鑒定方法的不斷發(fā)展，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等[29]方法也逐漸應(yīng)用于獼猴桃潰瘍病菌的檢測。

免疫檢測是利用抗原和抗體的特異性和靈敏性，定量或定性檢測待測物的一種方法。2017年，Cimmino等[30]利用Psa胞外多糖制備抗血清；2018年，Chen等[31]利用Psa3特異性效應(yīng)蛋白hopz5制備了具有良好特異性的多克隆抗血清PAb∶hopz5，能夠區(qū)分Psa3與親緣關(guān)系較近的細菌，如丁香假單胞桿菌丁香致病種、茶樹致病種和番茄致病種等；2020年，郭麗倩[5]以獼猴桃細菌性潰瘍病的致病菌株為免疫原，通過雜交瘤技術(shù)獲得的3株抗獼猴桃細菌性潰瘍病菌的單抗6C5、14H5和18A4，據(jù)此建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法檢測獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測極限分別達到9.0×102和3.6×103mL-1。免疫學(xué)檢測雖然快速靈敏，但對抗血清的質(zhì)量要求較高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于PCR的一系列分子檢測技術(shù)逐漸被建立起來，這些分子檢測方法更便捷，特異性和靈敏性更高，逐漸成為檢測獼猴桃細菌性潰瘍病的主要方法。雖然針對Psa特異性片段建立的分子檢測方法有諸多優(yōu)點，但也存在一些應(yīng)用推廣的缺點(表1)，如需要購買昂貴的配套儀器設(shè)備，需要檢測人員具備專業(yè)的檢測技術(shù)知識等[21]。

表1 獼猴桃細菌性潰瘍病菌主要檢測方法優(yōu)劣勢比較

3 分子檢測技術(shù)及相關(guān)引物

傳統(tǒng)的檢測技術(shù)由于檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低、特異性弱已越來越難以適應(yīng)當(dāng)前植物檢疫工作的實際需要，基于PCR的分子檢測技術(shù)以其快速、簡便、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點在Psa檢測方面得到了大力發(fā)展。2002年，Koh等[11]采用隨機擴增多態(tài)性技術(shù)篩選出Psa特異性片段，并據(jù)此設(shè)計出引物對KNF/KNR，可以特異地從Psa中擴增出一條492 bp的條帶，使快速、準(zhǔn)確診斷由Psa引起的獼猴桃潰瘍病成為可能(表2)。2003年，Jung等[32]基于冠菌素合成編碼基因cfl設(shè)計了巢式PCR，能有效檢測第二類群Psa2，其他3個類群因不能合成冠菌素均不能被檢測[33]。2010年，Rees等[34]根據(jù)16S-23S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)設(shè)計兩對引物對PsaF1/R2和PsaF3/R4，能分別從Psa特異擴增出一條280 bp和175 bp的條帶，但值得注意的是，丁香假單胞桿菌丁香致病種、茶樹致病種和番茄致病種均能產(chǎn)生假陽性，需輔助明膠液化和對胡蘆巴堿的利用等其他試驗加以區(qū)分[34-35]。

表2 已報道用于檢測丁香假單胞獼猴桃致病變種的引物

為進一步提高Psa分子檢測技術(shù)的特異性，2011年Gallelli[36]等根據(jù)avrD1基因和KN-PCR產(chǎn)物設(shè)計了AvrDdpx-F/AvrDdpx-F和KNF/KNR兩對引物進行雙重PCR，可直接快速檢測疑似感染的獼猴桃葉片、花蕾、枝干及花粉組織，而無需進行組織分離和DNA提取，極大減少了檢測步驟和時間[5]；此外，Psth、Pto及Pss等丁香假單胞桿菌相近種均不能產(chǎn)生226 bp和492 bp這兩條特異條帶。2013年，Biondi[37]根據(jù)外膜蛋白P1編碼基因ompP1設(shè)計了引物B1/B2，并以KNF/KNR為巢式引物進行巢式PCR，雖與其他PCR技術(shù)相比在一定程度上提升了反應(yīng)的靈敏度和特異性，但和KN-PCR及RG-PCR一樣不易區(qū)別Psa與Psth、Pto，需進一步通過RFLP分析來區(qū)分[37]。邵寶林等[38]通過RAPD分析獲得一條1 300 bp左右的特異片段，然后通過克隆測序及軟件設(shè)計將獲得的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定可靠的序列特異擴增區(qū)域(Sequence characterized amplified region，SCAR)標(biāo)記，設(shè)計并合成一對SCAR特異引物F7/R7，能特異地從Psa中擴增出一條約950 bp的條帶，而Pss、Pto等相近菌株均未擴增出特異條帶，與傳統(tǒng)檢測方法以及通用引物逐步篩選法相比，該方法具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度。周大祥等[39-40]將疊氮溴化乙錠、疊氮溴化丙錠與實時熒光定量相結(jié)合用于Psa檢測，染料穿透死菌細胞膜從而有效區(qū)別活死菌，彌補了PCR的不足，但因染料較貴，導(dǎo)致檢測成本較高，極大地制約了其廣泛推廣使用。

針對Psa的遺傳多樣性，國內(nèi)外學(xué)者也開展了特定類群的檢測研究。例如2014年，Gallelli等[41]為提高Psa-V的特異性分子檢測水平，建立了一種基于EvaGreen化學(xué)染料和hrpW基因的實時熒光PCR檢測法，可特異靈敏地從獼猴桃葉片、果實和樹皮組織中檢測出Psa-V。2016年，F(xiàn)ujikawa[27]基于第五類群特異序列設(shè)計了能有效區(qū)別Psa5和其他4個類群的特異性引物Con002F/R、Con034F/R、Con044F/和Con067F/R，PCR及電泳結(jié)果證明這4套引物對均能從Psa5擴增出單一條帶。2017年，Ruinelli等[42]采用比較基因組學(xué)方法，利用已公開的Psa基因組數(shù)據(jù)，選擇獨特的靶區(qū)，建立了兩種能夠檢測Psa的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，PSA LAMP和PSA3 LAMP，可區(qū)分不同類群的Psa，PSA LAMP對除第四類群(低毒力菌株)的其他3個類群產(chǎn)生陽性結(jié)果，而PSA3 LAMP只特異性針對普遍流行的第三類群Psa3。兩種LAMP檢測方法均有強特異性，親緣關(guān)系較近的Psth、Pto、Pss等丁香假單胞桿菌其他致病變種均不能產(chǎn)生陽性結(jié)果；同時LAMP檢測不僅能從無癥狀獼猴桃材料檢出Psa，且相比普通PCR，無需昂貴設(shè)備，所需時間更短。2021年，王一波等[43]通過簡化檢測步驟，優(yōu)化PSA3 LAMP反應(yīng)體系，加入熒光染料SYBR Green I等使反應(yīng)結(jié)果可視化，減少對儀器設(shè)備的依賴，有效發(fā)揮LAMP在田間廣泛應(yīng)用的潛力。

4 展望

自獼猴桃細菌性潰瘍病首次報道以來，該病害已快速向世界各國擴散流行。目前，我國獼猴桃主產(chǎn)區(qū)基本都有該病害的發(fā)生，嚴(yán)重制約了我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。而該病害得以快速流行和暴發(fā)的其中一個重要因素就是缺乏對病原菌快速、準(zhǔn)確和靈敏的檢測方法，本文總結(jié)了現(xiàn)有的各種獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測方法，重點比較了各自的優(yōu)缺點。展望未來，有必要在下面幾個方面予以進一步加強：

首先，需要推動現(xiàn)有檢測技術(shù)產(chǎn)品化。隨著免疫技術(shù)的發(fā)展，膠體金試紙條在植物檢疫中的利用已較成熟，目前我國已開發(fā)出多款可供基層使用的相應(yīng)檢測試紙條產(chǎn)品，國外也有獼猴桃細菌性潰瘍病抗體制備的報道，但獼猴桃細菌性潰瘍病相關(guān)免疫學(xué)試紙條仍待開發(fā)，以滿足農(nóng)戶等非專業(yè)人員和設(shè)備簡單的基層檢疫部門大規(guī)模普篩等需求。相比于普通PCR、qPCR及RT-PCR，LAMP具有設(shè)備簡單、反應(yīng)時間短、結(jié)果可視化等特點[42]，克服了分子檢測需要昂貴的配套設(shè)備、專業(yè)的儀器及專業(yè)的檢測技術(shù)知識等缺點[21]，能較好滿足田間對獼猴桃細菌性潰瘍病檢測需求。

其次，各檢測方法有利有弊，應(yīng)采取多種檢測方法相結(jié)合以達到更好的檢測效果。例如噬菌體不僅可以作為生物制劑有效防控獼猴桃細菌性潰瘍病，還可以用于獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測。噬菌體是一種特異性感染靶細菌的病毒，由于其寄主范圍的特殊性，可用于特定植物病原細菌種類和菌系的鑒別、預(yù)測病菌的消長、檢測種子苗木的帶菌及病菌存活情況，在植物病害研究中具有重要的理論和實踐意義[6]。2007年，雷慶等[44]以丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種為指示菌，從獼猴桃細菌性潰瘍病病枝中首次分離到一株噬菌體。近幾年，雖然國內(nèi)外均有報道利用分離噬菌體生物防治獼猴桃細菌性潰瘍病菌[45-49]，然而，噬菌體在獼猴桃潰瘍病菌的檢測以及區(qū)分其各類群的差異方面仍未見文獻報道，迫切需要進一步加強相關(guān)領(lǐng)域的研究。