白念珠菌定植對于免疫抑制宿主繼發(fā)侵襲性感染的預測價值及免疫調(diào)控影響

朱 琤， 余躍天

作者單位：1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院預防保健科，上海 200025；

2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院重癥醫(yī)學科。

侵襲性念珠菌病包括念珠菌血癥和深部組織念珠菌感染，治療時間長、費用高、預后差，因此引起廣泛關注。目前易感人群已由惡性血液系統(tǒng)疾病患者轉(zhuǎn)為免疫抑制宿主（immunocompromised host，ICH），而這其中念珠菌血癥是近些年最常見的侵襲性念珠菌病。已有研究結(jié)果表明，白念珠菌血癥歸因死亡率為49%，全因死亡率高達60%[1]。目前對于ICH 在病程中發(fā)展為念珠菌血癥的風險評估及準確預測仍不完善，但我們前期研究發(fā)現(xiàn)，此類患者在發(fā)生念珠菌血癥前往往存在多部位的念珠菌定植[2]。當宿主免疫功能出現(xiàn)障礙時，假菌絲的組織侵襲能力得到進一步加強，進而使患者出現(xiàn)臨床癥狀[3]。因此，念珠菌定植、念珠菌血癥及宿主免疫狀態(tài)三者之間的關系成為研究熱點。雖然念珠菌定植指數(shù)及念珠菌評分等指標逐步應用于臨床，但很少有與ICH 相關的研究。

定植是宿主機體對于病原微生物清除力與黏附力相互作用的結(jié)果，除皮膚黏膜屏障外，細胞介導的免疫反應是至關重要的抗真菌防御系統(tǒng)。由于白念珠菌細胞壁的組成部分 （1,3）-β-D 葡聚糖是一種促炎介質(zhì)，會對宿主機體的免疫系統(tǒng)造成干擾，而我們的前期研究證實，對于白念珠菌氣道定植患者抗真菌治療可以使CD4 Th 淋巴細胞、白細胞介素（IL）-17A 等指標恢復得更快[4]，但對于念珠菌血癥發(fā)生后宿主機體的適應性免疫應答過程尚不了解。因此，我們設計此前瞻性觀察性研究，試圖進一步探索ICH 白念珠菌定植對于繼發(fā)侵襲性感染的預測價值及侵襲性念珠菌感染發(fā)生后機體免疫調(diào)控與預后的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

前瞻性觀察性研究納入2016 年1 月—2020 年12 月五年期間收治于仁濟醫(yī)院風濕免疫科及重癥醫(yī)學科ICH 合并白念珠菌血癥患者。其中ICH 定義滿足如下一項即可診斷：①長期（＞3 個月）或大劑量口服潑尼松＞0.5 mg·kg-1·d-1；②接受免疫抑制劑治療；③存在原發(fā)性免疫缺陷疾??；④過去5 年由于實體腫瘤行化療；⑤存在實體器官移植史；⑥存在血液系統(tǒng)惡性腫瘤病史[5]。若出現(xiàn)以下情況，則予以排除：①患者年齡＜18 歲或＞80 歲；②除白念珠菌外，存在其他引起血流感染的病原微生物。本研究由上海交通大學倫理委員會審核通過后準予執(zhí)行，倫理審批號： No. 2016-Clinical-Res-083。

根據(jù)納入ICH 合并白念珠菌血癥患者的性別、年齡、基礎疾病等指標，按1 ∶2 傾向匹配，無白念珠菌血癥的ICH，其入選標準仍參考2013 年版美國感染病學會對于ICH 的定義[5]。

1.2 標本送檢及菌株鑒定

疑似菌血癥患者抽取2 個不同部位外周血標本，隨即注入需氧及厭氧血培養(yǎng)瓶各2 套（法國生物梅里埃公司，需氧瓶259789 SA，厭氧瓶 259793 SN），置入全自動血培養(yǎng)儀（BacT/Alert24，法國生物梅里埃公司）。待儀器報陽后，進行涂片及革蘭染色，同時接種于羊血哥倫比亞培養(yǎng)基及念珠菌科瑪嘉培養(yǎng)基，待菌落生長完全后，用法國生物梅里埃公司全自動微生物分析系統(tǒng)VITEK-2 Compact 進行鑒定。

1.3 藥敏試驗

經(jīng)血標本分離出的白念珠菌均使用比色微量稀釋法進行藥敏試驗，其中所包含的藥物為米卡芬凈、卡泊芬凈、阿尼芬凈、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、兩性霉素B 及5-氟胞嘧啶共9 種，檢測最低抑菌濃度（MIC）并將結(jié)果與美國臨床和實驗室標準化協(xié)會制定的M60 文件比對，判斷抗真菌藥物對于所分離出的白念珠菌抗菌活性。

1.4 數(shù)據(jù)收集及臨床評估

納入患者的臨床資料主要包含以下5 方面內(nèi)容：①年齡、性別及導致患者免疫抑制狀態(tài)疾病的基本信息；②患者入院時Sevilla 評分、念珠菌評分、念珠菌定植指數(shù)及校正念珠菌定植指數(shù)；③患者抗念珠菌療程及血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間；④入院當日，確診白念珠菌血癥第1、3、5、7、10、14天（DA、D1、D3、D5、D7、D10、D14） 外 周血淋巴細胞絕對值、T 淋巴細胞絕對值、Th 淋巴細胞絕對值、CD4/CD8 比值、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、（1,3）-β-D 葡 聚 糖、 腫 瘤 壞 死因子（TNF） -α 和干擾素（INF） -γ 等指標數(shù)值；⑤30 d 和60 d 全因死亡率。

主要研究終點為比較念珠菌定植指數(shù)及各項念珠菌評分對于ICH 白念珠菌血癥的預測價值；次要研究終點為比較白念珠菌血癥患者生存組及死亡組自確診后各時間節(jié)點炎癥及免疫指標的變化。

1.5 統(tǒng)計學分析

計數(shù)資料以頻數(shù)及百分比表示，其可比性分析采用χ2或Fisher 檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±SD）表示，兩組之間的可比性分析采用獨立樣本t檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，并根據(jù)曲線下面積（AUC）評估念珠菌定植指數(shù)及各項評分對于白念珠菌血癥的診斷價值。繪制Kaplan-Meier 生存曲線比較白念珠菌血癥患者30 d 和60 d 的生存率。應用SPSS 20.0 軟件進行相關統(tǒng)計分析，以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線情況

五年研究期間共計42 例ICH 合并白念珠菌血癥患者納入研究，生存25 例，死亡17 例。患者平均年齡（42.6±12.4）歲，基礎疾病以系統(tǒng)性紅斑狼瘡為主（26 例，61.9%），收治于ICU 患者為34 例（81.0%）。根據(jù)美國感染病協(xié)會指南推薦意見，念珠菌血癥患者非連續(xù)2 次血培養(yǎng)陰性后，抗真菌藥物仍需繼續(xù)使用2 周[6]。因此，入組患者抗真菌療程為（20.7±2.2）d，總住院時間（29.6±3.8）d。見表1。

表1 白念珠菌血癥患者基線情況Table 1 Demographic and clinical characteristics of the patients with Candida albicans bloodstream infection

2.2 白念珠菌對抗菌藥物的敏感率

對42 例患者血標本中分離出的42 株白念珠菌行抗真菌藥物敏感性試驗，并將藥敏結(jié)果與上海市細菌真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)和中國醫(yī)院侵襲性真菌病監(jiān)測網(wǎng)（CHIF-NET）數(shù)據(jù)[7-8]進行對比。患者血標本中分離出的白念珠菌對棘白菌素類抗真菌藥物敏感率均為100%，對兩性霉素B 也有極高的敏感率（98.3%），但對三唑類抗真菌藥物的敏感率不佳，低于上海市細菌真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)及CHIF-NET 數(shù)據(jù)，尤其是對最常使用的抗真菌藥物氟康唑，其敏感率僅為85.3%，對比上海市及全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)，差異存在統(tǒng)計學意義（85.3%對94.2%對99.0%，P＜0.05），提示將氟康唑作為臨床搶先治療的首選抗真菌藥物時需慎重。見圖1。

圖1 血標本分離出的白念珠菌對抗真菌藥物的敏感率Figure 1 Antifungal susceptibility of the Candida albicans strains isolated from blood

2.3 念珠菌定植相關指標與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間的相關性

分析納入42 例患者的念珠菌定植指數(shù)、校正念珠菌定植指數(shù)、念珠菌評分及Sevilla 評分。念珠菌定植指數(shù)為（0.6±0.2）分，校正念珠菌定植指數(shù)為（0.5±0.1）分。將念珠菌定植相關指標與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間行相關性分析，提示Sevilla評分與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間呈正相關（R2=0.404，P＜0.000 1），其他指標未提示相關性（P均＞0.05），見圖2。由于入組患者中全腸外營養(yǎng)患者及外科手術患者較少，因此念珠菌評分為（2.0±0.8）分，但Sevilla 評分為（11.1±2.4）分，提示入組對象均為高危患者。

圖2 念珠菌定植相關參數(shù)與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間的相關性分析Figure 2 The correlation between Candida colonization parameters and time to blood culture negative conversion

2.4 念珠菌定植相關指標對白念珠菌血癥的診斷效能

根據(jù)納入42 例ICH 合并白念珠菌血癥患者的性別、年齡、基礎疾病等指標，進行1 ∶2 傾向匹配，納入84 例無白念珠菌血癥的ICH 患者，其中女性患者66 例（78.6%），基礎疾病仍以系統(tǒng)性紅斑狼瘡為主（52 例，61.9%）。收集126 例不同狀況患者相對應的念珠菌定植指數(shù)、校正念珠菌定植指數(shù)、念珠菌評分及Sevilla 評分，繪制ROC 曲線（圖3）。Sevilla 評分對于念珠菌血癥的診斷價值較高，AUC為0.77，最佳截斷點為11 分（P＜0.001）；校正念珠菌指數(shù)最佳截斷點為0.4，同樣具有較高的診斷價值，AUC為0.73（P＜0.001）。念珠菌評分及念珠菌定植指數(shù)尚無法作為ICH 念珠菌血癥較好的診斷判定指標（P＞0.05），見表2。

表2 念珠菌定植相關指標對于白念珠菌血癥的診斷效能分析Table 2 The performance of Candida colonization parameters for diagnosing candidemia

圖3 念珠菌定植相關參數(shù)對于念珠菌血癥的診斷效能分析Figure 3 The performance of Candida colonization parameters for diagnosing candidemia

2.5 白念珠菌血癥患者免疫及炎性指標改變與預后分析

納入42 例患者中最終死亡17 例，死亡率為40.5%，其中14 例患者于發(fā)病30 d 內(nèi)死亡（圖4）。比較生存組和死亡組患者入院當日、確診白念珠菌血癥第1、3、5、7、10、14 天（DA、D1、D3、D5、D7、D10、D14）外周血淋巴細胞絕對值、T 淋巴細胞絕對值、Th 淋巴細胞絕對值、CD4/CD8 比值、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、INF-γ 及（1,3）-β-D 葡聚糖指標（圖5）。兩組患者在發(fā)生白念珠菌血癥后相關炎性指標均出現(xiàn)上升趨勢，且伴有淋巴細胞絕對值下降，在疾病確診1 周后達到高峰。隨著抗真菌藥物治療，生存組患者炎性及免疫指標逐漸趨于正常，而死亡組則進一步惡化。

圖4 免疫抑制宿主發(fā)生白念珠菌血癥后的生存分析Figure 4 The survival rate of the immunocompromised hosts with candidemia

圖5 生存組與死亡組各時間點免疫及炎性指標變化Figure 5 Changing patterns of relevant immune and inflammation biomarkers compared between survivors and deaths

3 討論

本研究表明，ICH 發(fā)生白念珠菌血癥后死亡率高，且此類患者血標本中分離出的白念珠菌對臨床常用的三唑類抗真菌藥物氟康唑耐藥率較高。在各項與念珠菌定植相關的評估指標中，Sevilla評分與校正念珠菌定植指數(shù)對于念珠菌血癥的發(fā)生具有較好的診斷價值。宿主發(fā)生白念珠菌血癥后，其免疫功能受到極大的影響，生存組在抗真菌藥物治療下結(jié)合自身免疫功能調(diào)整，更容易在相對短的時間內(nèi)恢復至基礎穩(wěn)態(tài)水平；而死亡組患者始終處于免疫與炎性反應失衡狀態(tài)。此臨床研究為下一步開展念珠菌血癥宿主機體適應性免疫應答的調(diào)控機制奠定了部分基礎。

念珠菌評分、Sevilla 評分、念珠菌定植指數(shù)及其校正指數(shù)目前仍是臨床最常用的預測侵襲性念珠菌感染尤其是念珠菌血癥的重要參考指標，但其使用時機及針對患者人群仍存在差異[9-10]。Sevilla 評分為三部分，除念珠菌定植水平以外，其對宿主從基礎情況至入院治療過程進行了整體評估。尤其對于患者是否入住ICU、留置導管情況、抗菌藥物使用情況等作了進一步分析，且對于患者既往糖皮質(zhì)激素累計用量（過去15 d 潑尼松累計用量＞500 mg）進行了評估。最重要的是Sevilla 評分的17 項評分標準完全包括了念珠菌評分的4 項指標，因此對于ICH 的評估更為準確全面，不僅適用于外科手術患者，對于因內(nèi)科疾病及收治于ICU 的患者同樣適用。Sevilla 評分在評估宿主念珠菌定植強度的同時，也進一步評估了皮膚黏膜屏障的完整性（留置導管、腹部手術、血液透析等），同時評估了免疫功能，因此其對于念珠菌血癥的診斷效能最高，AUC為0.77，且其評分高低與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間，即白念珠菌的清除時間呈正相關。

嚴重的感染在最初促炎階段之后，將逐步過渡至抑炎階段，導致免疫抑制階段延長，稱為侵襲性免疫抑制后階段。這是由于循環(huán)中淋巴細胞重新定位至感染區(qū)域而導致其計數(shù)下降，以及膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡發(fā)生[11]。我們的研究已經(jīng)通過臨床數(shù)據(jù)改變證實了這種繼發(fā)性免疫反應受損與不良結(jié)局相關。如此嚴重、持續(xù)的低淋巴細胞計數(shù)也使患者容易繼發(fā)感染，并導致惡性循環(huán)，這也從另外一個方面解釋了相關的高死亡率。在念珠菌血癥發(fā)生過程中，位于吞噬細胞表面的模式識別受體，特別是Dectin-1 受體，可以識別真菌細胞壁上的甘露聚糖和相關蛋白以及其他結(jié)構(gòu)，如葡聚糖和甲殼素等。釋放的細胞因子由于識別模式及受體的不同而存在差異。IL-1β 及IL-6的釋放是通過多種途徑刺激造成，而IL-17A 的分泌依賴于IL-23 的刺激，而不是通過凝集素受體。Th17 細胞分泌特異性細胞因子包括IL-17A、IL-21及IL-22。細胞因子IL-1β、IL-6 和轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導Th17 細胞的發(fā)育，而IL-23 是維持Th17 細胞的重要細胞因子[12]。因此，我們的研究表明，死亡組患者IL-17A 水平明顯高于生存組水平。

綜上，Sevilla 評分對于ICH 發(fā)生白念珠菌血癥具有較高的診斷效能，且其評分高低與念珠菌血癥培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間呈正相關。淋巴細胞絕對值下降及細胞因子水平，尤其是IL-17A 持續(xù)升高等是提示白念珠菌血癥患者預后不良的重要因素。