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    血清miRNA-21-5p和miRNA-574-5p在良惡性肺結(jié)節(jié)鑒別診斷中的價(jià)值*

    2022-11-07 02:45:52何震宇宋星儀師澤元安小康
    罕少疾病雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:標(biāo)志物惡性結(jié)節(jié)

    何震宇 宋星儀 師澤元 安小康

    河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 (河南 開封 475000)

    肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)[1]。由于早期階段臨床癥狀無特異性,大部分患者確診后,便已處于已處于晚期,導(dǎo)致 5年總體生存率較差[2-3]。目前主要通過計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)篩查肺結(jié)節(jié)高危人群,近年來隨著高分辨率 CT 的廣泛應(yīng)用[4-5]。判斷結(jié)節(jié)的良惡性是肺癌早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵[6]。肺結(jié)節(jié)可分為實(shí)性和亞實(shí)性結(jié)節(jié),形態(tài)特征明顯不同,難以診斷[7]。研究報(bào)道,miRNAs 、自身抗體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、DNA甲基化等有助于肺結(jié)節(jié)診斷[8-9]。因此,本文探討了血清miRNA-21-5p 和 miRNA-574-5p 在良惡性肺結(jié)節(jié)鑒別診斷中的價(jià)值,旨在為今后臨床控制和預(yù)防提供思路。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象 選2020年1月至2022年1月本院收治肺結(jié)節(jié)患者的57例。

    納入標(biāo)準(zhǔn):受試者在 CT 掃描中檢測(cè)到肺結(jié)節(jié); 參與者的臨床資料應(yīng)完整。排除標(biāo)準(zhǔn):具有肺癌疾病史;肺部存在急性感染或活動(dòng)性肺結(jié)核;心、肝、腎功能異常;合并其他惡性腫瘤。依據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行分組,即良性結(jié)節(jié)組(12例)和惡性結(jié)節(jié)組,其中惡性結(jié)節(jié)組(45例)。

    1.2 資料收集 收集性別、年齡、吸煙史、結(jié)節(jié)大小及分布等臨床資料。吸煙被定義為吸煙超過 6 個(gè)月,包括接觸二手煙。

    1.3 血清miRNA-21-5p和 miRNA-574-5p水平檢測(cè) 將儲(chǔ)存的血清樣品解凍,將300μl 添加到900μl Trizol 試劑(Invitrogen,San Diego,CA,USA)中的250fmol標(biāo)準(zhǔn)cel-miRNA-39 30μl中。根據(jù)制造商的說明提取總RNA。對(duì)于miRNA-21-5p、miRNA-574-5p和cel-miRNA-39的定量實(shí)時(shí)PCR,使用了miRNA特異性TaqMan MicroRNA Assays(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA,USA)。miRNA-21-5p和miRNA-574-5p的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物由TAKARA Biotechnology提供(miRNA-21-5p: 5'-UAG CUU AUCAGACU GAUGUUGA-3'; miRNA-574-5p:5 '-UGAGUGUGUGGUGUGUGU GAG UGUG U-3')。逆轉(zhuǎn)錄的總反應(yīng)體積為20μl,包括總 RNA,50 ng-5 μg;GSP(基因特異性引物),2pmol;2×ES 反應(yīng)混合物,10μl;Easy Script RT/RI 酶混合物,1μl;和足夠的無 RNase 水至終體積為20μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42°C下進(jìn)行15分鐘,然后在85°C下熱滅活5秒。實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)也使用20μl的體積,每個(gè)樣品一式三份測(cè)定,包括 cDNA,3μl;正向引物(10μM),0.4μl;反向引物(10μM),0.4μl;2× TransStart Top Green qPCR SuperMix,10μl;被動(dòng)參考染料(50×)(可選),0.4μl;和足量的蒸餾去離子水至最終體積為20μl。反應(yīng)在ABI Prism 7500qPCR機(jī)器上進(jìn)行,反應(yīng)條件為94℃變性35s,60℃退火34s,72℃延伸10s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。然后在85°C下熱滅活5秒。實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)也使用20μl的體積,每個(gè)樣品一式三份測(cè)定,包括 cDNA,3μl;正向引物(10μM),0.4μl;反向引物(10μM),0.4μl;2×TransStart Top Green qPCR SuperMix,10μl;被動(dòng)參考染料(50×)(可選),0.4μl;和足量的蒸餾去離子水至最終體積為20μl。反應(yīng)在ABI Prism 7500 qPCR機(jī)器上進(jìn)行,反應(yīng)條件為94℃變性35s,60℃退火34s,72℃延伸10s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。然后在85°C下熱滅活 5秒。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)也使用20μl的體積,每個(gè)樣品一式三份測(cè)定,包括 cDNA,3μl;正向引物(10μM),0.4μl;反向引物(10μM),0.4μl;2×TransStart Top Green qPCR SuperMix,10μl;被動(dòng)參考染料(50×)(可選),0.4μl;和足量的蒸餾去離子水至最終體積為20μl。反應(yīng)在ABI Prism 7500 qPCR機(jī)器上進(jìn)行,反應(yīng)條件為94℃變性35s,60℃退火34s,72℃延伸10s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。被動(dòng)參考染料(50×)(可選),0.4μl;和足量的蒸餾去離子水至最終體積為20μl。反應(yīng)在ABI Prism 7500 qPCR機(jī)器上進(jìn)行,反應(yīng)條件為94℃變性35s,60℃退火34s,72℃延伸10s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。被動(dòng)參考染料(50×)(可選),0.4μl;和足量的蒸餾去離子水至最終體積為20μl。反應(yīng)在ABI Prism 7500 qPCR機(jī)器上進(jìn)行,反應(yīng)條件為94℃變性35s,60℃退火34s,72℃延伸10s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。用線蟲 cel-miRNA-39 外源內(nèi)參對(duì)待檢測(cè)的靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。miRNA表達(dá)水平通過△△Ct法計(jì)算:△Ct=平均值Ct(感興趣的miRNA)-平均值Ct(參考miR-39),在這種情況下△△Ct=平均值Ct(惡性結(jié)節(jié)的miRNA)-平均值 Ct(良性結(jié)節(jié)的miRNA)。每個(gè)感興趣的miRNA的相對(duì)表達(dá)對(duì)應(yīng)于2 △△Ct值。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析經(jīng)SPSS 21.0分析,計(jì)量資料采用(±s)表示,t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示,兩組比較采用χ2檢驗(yàn),采用受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)估m(xù)iRNA-21-5p 和 miRNA-574-5p的診斷價(jià)值,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般臨床資料兩組在性別、不同直徑、年齡、腫瘤家族史、吸煙史和不同密度結(jié)節(jié)中的分布方面比較,P>0.05;兩組在分布中方面比較,P<0.05,見表 1。

    表1 一般臨床資料

    2.2 血清miRNA-21-5p和 miRNA-574-5p水平 兩組miRNA-21-5p和miRNA-574-5p水平比較,P<0.05,見表2。

    表2 血清miRNA-21-5p和miRNA-574-5p水平

    2.3 miRNA-21-5p和 miRNA-574-5p診斷價(jià)值 據(jù)ROC曲線分析可知,miRNA-21-5p 和 miRNA-574-5p診斷肺部惡性結(jié)節(jié)AUC分別是0.690,0.711,聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.819,具體見表3及圖1。

    表3 miRNA-21-5p和miRNA-574-5p診斷價(jià)值

    3 討 論

    隨著低劑量胸部CT的普及,肺部結(jié)節(jié)的檢出率急劇上升,盡管這些結(jié)節(jié)大多是良性的。為了實(shí)現(xiàn)惡性結(jié)節(jié)的早期診斷并避免對(duì)良性結(jié)節(jié)進(jìn)行侵入性評(píng)估,臨床醫(yī)生需要準(zhǔn)確區(qū)分良惡性結(jié)節(jié)[10]。在臨床實(shí)踐中,臨床醫(yī)生使用各種方法來診斷或跟蹤肺結(jié)節(jié)。首先,他們可能會(huì)跟蹤患有肺結(jié)節(jié)的患者,以監(jiān)測(cè)結(jié)節(jié)的變化?;蛘?,可能需要通過經(jīng)支氣管肺活檢或手術(shù)活檢獲得病理學(xué)診斷,特別是對(duì)于那些可能是惡性的結(jié)節(jié)。在做出這些決定時(shí),臨床方法需要考慮患者的合并癥以及患者的意愿[11-12]。多數(shù)早期肺癌是無癥狀的,并且在被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期階段[13]。如果肺癌能夠早期臨床診斷,患者的預(yù)后可以得到顯著改善。肺癌各個(gè)階段的5年生存率僅為15~19%。早期診斷的生存率可能會(huì)得到改善,特別是對(duì)于I期,5年生存率可以提高到 81~85%[14]。因此,在早期階段改善肺癌篩查似乎是合理的。低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描 (LDCT) 屬于臨床上常用的早期檢測(cè)篩查工具[15]。隨著對(duì)肺結(jié)節(jié)影像學(xué)特征和血清腫瘤生物標(biāo)志物認(rèn)識(shí)的不斷深入,有利于尋找一種比現(xiàn)有影像學(xué)模型或生物標(biāo)志物具有更高特異性和敏感性的非侵入性方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)節(jié)的可靠早期診斷。惡性腫瘤。本研究的研究旨在尋找更有效的新腫瘤標(biāo)志物,并利用血清腫瘤標(biāo)志物以及臨床特征和影像學(xué)特征建立預(yù)測(cè)模型,以提高肺癌的早期診斷率[16]。

    對(duì)于放射學(xué)檢查結(jié)果,臨床醫(yī)生通常使用Swensen模型和 VA模型來區(qū)分良性和惡性肺結(jié)節(jié)。在Swensen模型中,年齡、吸煙史、其他癌癥病史、結(jié)節(jié)的直徑、毛刺和位置等因素對(duì)判斷結(jié)節(jié)的良惡性有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙史、肺氣腫、直徑、毛刺和血管征在鑒別結(jié)節(jié)良惡性方面比較,P>0.05。但有研究表示,年齡較大且吸煙史較長(zhǎng)的患者更容易出現(xiàn)惡性結(jié)節(jié)[17-18]。miRNA可以通過結(jié)合mRNA 3'UTR在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),導(dǎo)致mRNA降解或轉(zhuǎn)錄抑制[19]。多項(xiàng)研究表明,miRNA 的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成有關(guān)[20]。miRNA可以在生理或病理?xiàng)l件下由正常細(xì)胞分泌到體液中,也可以由凋亡和壞死細(xì)胞分泌到體液中[21]。最近也研究了miRNA作為判斷肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的生物標(biāo)志物[22]。近年研究表明,miRNA作為生物標(biāo)志物區(qū)分惡性肺結(jié)節(jié)的敏感性為54.8%~92.9%,特異性為69.2%~90.9%[23]。血清miRNA是一種新型的血清腫瘤標(biāo)志物,具有非侵入性、易獲取、靈敏度高等特點(diǎn)。已證實(shí)miRNA可參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展[24-26]。miRNA-21是700多種不同 miRNA 中特別重要的miRNA分子,因?yàn)樗谌橄侔?、結(jié)腸癌、肺癌和其他腫瘤中高度表達(dá)。Foss等人的研究表明miRNA-574-5p在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷中具有重要意義。當(dāng)miRNA-574-5p和miRNA-1254一起使用時(shí),肺癌早期診斷的敏感性和特異性分別為82%和77%[27]。有研究證實(shí)證明miRNA-21、miRNA-210和miRNA-15在肺癌患者血清中高表達(dá),其中以miRNA-21最為突出。其研究表明血漿miRNA-21可作為循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物用于早期診斷非小細(xì)胞肺癌[28-29]。另外有研究表明miRNA-574-5p水平可用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷[30]。本研究中兩組在分布中存在顯著差異,與大多數(shù)研究一致。有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)多位于右上葉(37.5%),惡性結(jié)節(jié)最多位于右上葉(41.4%)[31]。本研究中良性結(jié)節(jié)組和惡性結(jié)節(jié)組之間miRNA-21-5p和miRNA-574-5p水平差異顯著(P<0.05),其中惡性結(jié)節(jié)組血清miRNA-21-5p和miRNA-574-5p水平更高。根據(jù)ROC曲線分析可知,miRNA-21-5p和miRNA-574-5p診斷肺部惡性結(jié)節(jié)AUC分別是0.690,0.711,聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.819。結(jié)果表明,聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值高于miRNA-21-5p和miRNA-574-5p單獨(dú)檢測(cè)的診斷價(jià)值,表明miRNA-21-5p和miRNA-574-5p聯(lián)合檢測(cè)有望有助于肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷,對(duì)肺癌的診斷有一定價(jià)值。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)惡性結(jié)節(jié)患者的血清miRNA-21-5p和miRNA-574-5p水平顯著高于良性結(jié)節(jié)患者,是潛在的血清生物標(biāo)志物。然而,本研究樣本量較小,標(biāo)本采集具有地域限制;且迄今為止的檢測(cè)方法在臨床上的應(yīng)用有限。因此,需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證這些標(biāo)志物的重要性和實(shí)用性。本研究將通過擴(kuò)大樣本量、收集更多不同區(qū)域的肺結(jié)節(jié)患者以及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間的進(jìn)一步研究來驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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